Biologia Medyczna W

Prof. Żak

• Polimeraza RNA II do zapoczątkowania transkrypcji z promotorów zawierających kasetę TATA potrzebuje ponad 40 różnych polipeptydów tzw. podstawowych czynników transkrypcyjnych

- główne, tj. wykorzystywane przez wszystkie geny są niezbędne do transkrypcji DNA na mRNA

- specyficzne czynniki- pomagają inicjować transkrypcję genów w specyficznych typach komórek w określonym czasie

• Transkrypcję regulują też sekwencje wzmacniające i wyciszające

- mogą być zlokalizowane tysiące zasad od genu

- mogą być regulowane przez aktywatory i ko-aktywatory będące specyficznymi czynnikami transkrypcyjnymi

Podstawowy czynnik transkrypcyjny

- TFIID

- TFIID

- TFIIA

- TFIIB

- TFIIF

- TFIIE

- TFIIH

Sposoby aktywacji inicjacji transkrypcji katalizowanej przez polimerazę RNA.

Czynniki transkrypcyjne mogą na 3 różne sposoby aktywować inicjację

1. niektóre czynniki transkrypcyjne wiążą się z sekwencjami sąsiadującymi z promotorem podstawowym i bezpośrednio oddziałują z kompleksem preinicjacyjnym

2. część czynników współdziała z koaktywatorem lub mediatorem, które pośredniczą w oddziaływaniu tego czynnika transkrypcyjnego z kompleksem preinicjacyjnym

3. niektóre rodzaje oddziaływań wymagają zagięcia DNA

Transkrypcja elongacja

• Polimeraza RNA przesuwa się wzdłuż DNA- rozplata przed sobą helisę DNA, w obrębie niewielkiego bąbla transkrypcyjnego

• W miejscu polimerazy dołącza kolejne nukleotydy

- tworząc wiązania fosfodiestrowe używając trifosforanów rybonukleotydów- odłączenie P-P dostarcza energii do reakcji polimerazy

- przejściowo tworzy się krótki heliakalny odcinek hybrydy DNA\ RNA

• Na miejscu polimeryzacji polimeraza RNA splata nici DNA- odsuwając od matrycy nowo syntetyzowany RNA

Sposoby dojrzewania RNA

• Modyfikacji końców 5` i 3`

• Składanie kesonów

• Cięcie istotne w dojrzewaniu rRNA i tRNA, zachodzi u prokariota i eukariota

• Modyfikacje chemiczne

- dodawanie nowych grup np. CH₃ do specyficznych nukleotydów- powszechne

- redagowanie RNA

- pojawienie się nowych nukleotydów- nie są powszechne

- przez poliadenylację

- deaminacja zasad azotowych

Pierwotny transkrypt na eukariota nie jest gotowy do uczestniczenia w translacji

Powstawanie eukariotycznego mRNA

• Z dużego prekursora, tzw. mRNA

• Na końcu 5` jest 7- metyloguanylan związany 5`- 5` trifosforanowym

- trzy typy czapeczki- sam 7-metyloguanylan- dodatkowo metylowana ryboza pierwszego nukleotydu, dodatkowo metylowana dwie ryboza pierwszych nukleotydów końca 5`

- cząsteczki mRNA z czapeczką podlegającą bardziej wydajnie translacji

- czapeczki pomagają w stabilizacji mRNA, chroniąc je przed trawieniem przez 5`- rybonukleazy

Alternatywne składanie RNA

• Pierwotny transkrypt ulega składaniu zachodzącemu w różny sposób

- istnieją alternatywne miejsca przerwania łańcucha transkrypt i poliadenylację jego końca 3`

- prowadzi to do powstania różnych funkcjonalnych mRNA

- w translacji powstają z ich udziałem różne warianty białek

• Niektóre sposoby składania są swoiste dla określonych rodzajów komórek, tkanek.

- ά- tropomiozyna wytwarzana w mięśniach poprzecznie prążkowanych jest inna niż wytwarzana w mięśniach gładkich

Redagowanie RNA czasem zmienia właściwości kodujące, mRNA- ludzki, mRNA- apolipoproteiny B

- w wyniku deaminacja cytozyny następuje przekształcenie C w U

- zmienia to kodon CAA glutaminy w kodon terminacyjny UAA

- prowadzi to do powstania formy apolipoproteiny B48 w komórkach jelita

Translacja

W rybosomach informacja genetyczna niesiona przez mRNA odczytywana jest w celu wytworzenia białka

• Cząsteczka adapterowa jest łącznikiem między informacją genetyczną a białkiem, której rolę pełni aminoacylo-tRNA

• Cząsteczki aminoacylo-tRNA to tRNA do których przyłączane są aminokwasy

• Każdy tRNA jest na tyle unikatowy, że przyłącza się do niego tylko jeden aminokwas

Aktywacja aminokwasów- tworzenie aminoacylo-tRNA

• Syntetazy aminoacylo-tRNA- enzymy aktywują aminokwasy i przyłączają je do 3`- terminalnej adenozyny właściwego im tRNA

• Syntetazy tRNA są bardzo swoiste pod względem przyłączania odpowiedniego aminokwasu do właściwego tRNA

-ponieważ rozpoznawanie kodonów jest całkowicie zależne od tRNA, a nie od przyłączonego aminokwasu, wierność/ poprawność syntezy białka zależy od wysokiej swoistości syntezy tRNA

• Reakcja aminoacylacji jest 3- stopniowa

AA+ATP= aminoacylo- AMP+Pp₁, aminoacylo AMP+tRNA= aminoacylo tRNA Pp₁= 2P

Ten końcowy etap powoduje, że ogólna reakcja jest nieodwracalna

• Na wytworzenie 1 aminoacylo- tRNA wydatkowane są 2 wiązania fosforanowe wysokoenergetyczne, pochodzące z ATP

Powstawanie aminoacylotRNA i wiązanie antykodonu z kodonem

Rybosomy jest aparatem molekularnym do wytwarzania polipeptydów; przemieszcza się wzdłuż mRNA, wyłapuje komplementarne aatRNA, przytrzymuje aminoacylotRNA w odpowiednim miejscu i łączy wiązaniem peptydowym aminokwasy w polipeptydach

W inicjacji translacji u eukariota uczestniczy czapeczka i ogon poli(A)

• Składanie kompleksu preinicjacyjnego

- podjednostka 4OS+tRNA ^MET + czynnik inicjacyjny Elf-2+GTP

• Wiązanie kompleksu preinicjacyjnego do końca 5` mRNA za pośrednictwem kompleksu wiążącego się z cząsteczką (e 1F-4F) i czynnika Elf- 3

-ogon poli (A) ma również wpływ na przyłączenie kompleksu preinicjacyjnego do mRNA, jego długość koreluje z wydajnością inicjacji z różnych cząsteczek mRNA

• Kompleks preinicjacyjny skanuje mRNA wzdłuż lidera do napotkania kodonu inicjującego `5AUG3`, który jest rozpoznawany dzięki swemu położeniu wewnątrz sekwencji kozak

- czynniki Elf- 4A i Elf- 4B ułatwiają proces skanowania- są helikazami

Inicjację translacji kończy przyłączenie dużej jednostki rybosomy- w momencie umiejscowienia kompleksu inicjacyjnego w sekwencji zawierającej kodon inicjacyjny, wymagana jest hydroliza GTP

- następuje odłączenie czynników inicjacyjnych

- inicjatorowy tRNA ^MET jest związany w miejscu P rybosomy, dlatego do miejsca A może przyłączyć się drugi aminoacylotRNA, którego antykodon jest komplementarny do kodonu

- tworzy się pierwsze wiązanie peptydowe i rozpoczyna się proces elongacji translacji

Translacja cząsteczki mRNA- elongacja

• W etapie 1 cząsteczka aminoacylo tRNA wiąże się do miejsca A na rybosomie

• Podczas 2 etapu karboksylowy koniec tripeptydu zostaje odłączony od tRNA znajdującego się w miejscu P i połączony wiązaniem peptydowym z wolną grupą aminową aminokwasu

- 4 związanego z tRNA w miejscu A przez peptydylotransferazę

- przeniesieniu grupy peptydylowej towarzyszy przesunięcie się dużej podjednostki

• Etap 3 polega na przesunięciu się małej podjednostki o odcinek trzech nukleotydów wzdłuż mRNA w stronę 3` z równoczesnym usunięciem wolnego tRNA z miejsca E, przygotowuje to rybosomy do związania następnego aminoacylo tRNA i powtórzenia cyklu

Końcowa faza translacji polipeptydu

• Translację kończy związanie czynnika uwalniającego z kodonem stop, który jest w miejscu A na rybosomie

- białkowe czynniki uwalniające zmieniają aktywność peptydylotransferazy, zmuszając ją do przeniesienia grupy peptydowej z peptydylo-tRNA na cząsteczkę wody, zamiast na grupę aminową kolejnego aminoacylo tRNA

• Gotowy polipeptyd zostaje uwolniony, rybosomy uwalnia mRNA i dysocjuje na dwie oddzielne podjednostki, które mogą połączyć się z następnym mRNA

• Translacja trwa od 20 sekund do kilku minut

Koncepcja sygnałowa- syntezy białka na rybosomach RER

• Białka syntetyzowane na błonach siateczki szorstkiej są wytwarzane w formie prekursorowej, podlegają obróbce, zanim dotrą do właściwego miejsca przeznaczenia

• Hipoteza sygnałowa opisuje, w jaki sposób białka kierowane są do błon- sekwencja sygnałowa- dł. 15-30 aminokwasów, zawiera odcinek utworzony z aminokwasów hydrofobowych

• Translacja rozpoczyna się z cytoplazmie

• Etapy rozpoznania sekwencji sygnałowej, kierowania białka z cytoplazmy do błon- cząsteczka rozpoznająca sygnał SRP rozpoznaje i wiąże sekwencję sygnałową, gdy wysuwa się z rybosomy- wiążąc się też z rybosomem

- to hamuje dalszą translację

- kompleks SEP- rybosomy wiąże się z receptorem dla SRP na błonach RER

- białko SRP i receptor dla SRP odłączają się od rybosomy- wznowienie translacji

-syntetyzowane białko przechodzi przez błonę RER do jego światła

w świetle siateczki sekwencję sygnałową odczepia peptydaza sygnałowa-

- białko ulega N- glikozylacji

Przekaz informacji genetycznej z pokolenia na pokolenie jest uwarunkowany powieleniem DNA- replikacji- poprzedzającej podział komórki

- replikacji- proces syntezy DNA

- podwojenie nośnika informacji genetycznej

- replikacji zachodzi w czasie każdego cyklu podążającego w kierunku podziału komórki

- proces zależny od podstaw komplementarnego parowania zasad

- wolny nukleotyd może być przyłączony wtedy, gdy posiada komplementarnie właściwą zasadę do zasady w matrycy

- A z T i G z C

- jedna nić jest kopiowana w sposób ciągły, druga w sposób nieciągły- fragmenty Okazaki

- synteza wymaga obecności starterów RNA i pełnego białkowego aparatu replikacyjnego

Replikacji DNA

- synteza dwóch komplementarnych dwuniciowych helis z jednej wyjściowej

- obydwie nowe helisy mają sekwencję nukleotydowi identyczną z helisą wyjściową (z wyjątkiem rzadkich błędów)

- każdy łańcuch 2-niciowego DNA ma sekwencję nukleotydów dokładnie komplementarną do sekwencji nukleotydów swojego partnera

- każdy z nich może działa jako matryca, czyli „sztanca” w syntezie nowego komplementarnego łańcucha DNA

- umożliwia to komórce powielenie swych genów przed przekazaniem ich komórkom potomnym

- ponieważ każdy łańcuch macierzystej cząsteczki DNA służy do syntezy nowego łańcucha, każda z potomnych 2-niciowych helis DNA zawiera łańcuch stary i jeden nowy

- replikacji dokonuje zespół białek nazywany aparatem replikacyjnym

Inicjacja replikacji

- w określonym miejscu, które zawiera szczególne sekwencje nukleotydowi ( bogate w pary ATP), z którymi łatwo wiążą się:

- białka inicjujące i rozplatające struktury 2-niciowe

- białka inicjujące replikacji- helikazy- używają wiązania wodorowe i powodują lokalne rozplecenie dwuniciowej helisy DNA

- powstaje oczko replikacyjne

- topoizomerazy- rozplatają heliakalne struktury dwuniciowe- zmieniają liczbę opleceń DNA

polimeraza DNA jest szwem aparatu replikacyjnego

- syntetyzuje nowe nici DNA na matrycy starych nici

-katalizuje przyłączenie nukleotydów do rosnącego łańcucha DNA, tworząc wiązania fosfodiestrowe między grupą - OH na jego końcu 3` a fosforanem na końcu 5` nowo wchodzącego nukleotydu

- polimeraza DNA wykorzystuje uwalnianą energię z hydrolizy pirofosforanu, co decyduje, że reakcja polimeryzacji jest praktycznie nieodwracalna

- polimeraza DNA nie odłącza się od DNA każdorazowo po przyłączeniu kolejnego nukleotydu

- po replikacji jest ciągle zasocjonowana z DNA, wzdłuż którego przesuwa się etapami przez wiele cykli reakcji polimeryzacji

Polimeraza DNA nie może rozpocząć syntezy całkowicie nowego łańcucha, czyni to prymasa

- polimeraza może dołączyć nowy nukleotyd tylko do już istniejącego odcinka sparowanego z matrycą

- do rozpoczęcia syntezy DNA potrzebny jest inny enzym, który może zacząć nowy łańcuch nukleotydowy przez połączenie ze sobą dwóch nukleotydów, nie stawiając wymogu istnienie końca tworzącego parę

- enzymem tym jest polimeraza RNA, która wytwarza krótkie odcinki ok. 10 nukleotydów kwasu rybonukleinowego komplementarnego do DNA stanowiącego matrycę i służy pobieranie DNA jako miejsca startu

- odcinek RNA służy więc jako starter ( ang. Primer) do syntezy DNA

- enzym syntetyzujący starter zwany jest prymazą

- prymaza może inicjować syntezę, ale nie może sprawdzać swej pracy

Inicjacja replikacji

- skutkiem lokalnego zerwania wiązań wodorowych w DNA przez helikazę

- eksponowane są pojedyncze nici służące jako matryca do kopiowania DNA

- tworzą się pary przeciwnie zorientowanych widełek replikacyjnych

- w widełkach replikacyjnych przesuwa się wzdłuż DNA i wykorzystuje każdą z jej nici jako matryce

- widełki replikacyjne przesuwają się w obu kierunkach, na prawo i lewo od miejsca początku replikacji, dlatego proces replikacji jest 2- kierunkowy

- widełki replikacyjne przesuwają się z dużą prędkością ok. 1000 par zasad na sekundę ( u bakterii), ok. 100 par zasad na sekundę w komórkach człowieka

Oczka replikacyjne formują się w wielu miejscach wzdłuż nici DNA, umożliwiając szybsze postępowanie replikacji

- inicjacja replikacji w wielu miejscach jest konieczna do szybkiej replikacji długich DNA, np. u DROSOPHILA- ponad 6000 widełek replikacyjnych przypada na największy DNA

Nić wiodąca i nić opóźniająca DNA

- helisa ma antyrównoległe ułożenie obu nici

- nowe łańcuchy DNA są syntetyzowane w kierunku od końca 5` do końca 3`

- nić wiodąca DNA, zaczynająca się końcem 3` jest matrycą, na której odbywa się synteza ciągła

- nić opóźniająca DNA, zaczynająca się końcem 5` jest matrycą, na której odbywa się synteza nieciągła

Asymetria widełek replikacyjnych

- opóźniona nić DNA powstaje z początku w postaci krótkich odcinków DNA, ulegających później połączeniu

- polimeraza DNA pozornie cofa się, wykonuje manewr „wstecznego ściegu”

- musi syntetyzować krótkie fragmenty Okazaki w kierunku 5` do 3`, a następnie przesunąć się wzdłuż matrycy w przeciwnym kierunku

Anna®

---