Temat 7: Metody posiewu i hodowli drobnoustrojów (2)

Zadanie 1. Posiew na podłoże agarowe ze skrobią

Podłoże to umożliwia zbadanie zdolności szczepu do hydrolizy skrobi (amylolizy), a także do określenia liczby bakterii amylolitycznych w badanej próbie.

1. Wykonać posiew metodą powierzchniową wprowadzając pipetą na pożywkę 100 μl

zawiesiny bakterii Bacillus sp. i rozprowadzając głaszczką

2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 7 dni

3. Po inkubacji zalać powierzchnię hodowli płynem Lugola i odczekać kilka minut.

Płyn Lugola reaguje ze skrobią dając fioletowe zabarwienie. Wyjaśnić

zaobserwowane zmiany barwne w pożywce.

Zadanie 2. Posiew na bulion z tryptofanem

Podłoże to umożliwia zbadanie zdolności szczepu do wytwarzania indolu z tryptofanu, co jest ważną cechą biochemiczną wykorzystywaną w identyfikacji pałeczek z grupy coli.

1. Pobrać ezą zawiesinę bakterii Escherichia coli i zaszczepić pożywkę

2. Inkubować w temperaturze 37⁰C

3. Po inkubacji wykonać próbę na indol dodając do hodowli 0,5 cm³ odczynnika

Kovacsa. Powstanie w ciągu kilku minut intensywnie czerwonego zabarwienia

świadczy o obecności indolu w hodowli.

Zadanie 3. Hodowla bakterii nitryfikacyjnych

Hodowle bakterii autotroficznych (w tym nitryfikacyjnych) prowadzi się zasadniczo na pożywkach zawierających jedynie związki nieorganiczne (czasami dodaje się jeszcze niezbędne witaminy). Związki organiczne bakterie te wytwarzają asymilując CO₂. Bakterie autotroficzne rosną wolniej od heterotroficznych (korzystających z gotowych związków organicznych), dlatego wymagają dłuższego czasu inkubacji.

1. Do probówki z pożywką mineralną Winogradskiego dla I fazy nitryfikacji

(zawierającą kationy amonowe) wprowadzić grudkę ziemi lub 0,5 cm³ wody rzecznej

2. Tak samo zaszczepić pożywkę Winogradskiego dla II fazy (zawierającą azotyny)

3. Inkubować przez 14 dni w temp. pokojowej.

4. Po inkubacji zbadać obecność produktów nitryfikacji I fazy (azotyny) i II fazy

(azotany) oraz zanik substratów w odpowiednich probówkach.

Wykrywanie azotynów:

1. na szkiełko zegarkowe nanieść pipetą 0,2 cm³ hodowli,

2. oddzielnymi pipetami dodać: 0,1 cm³ r-u kwasu sulfanilowego i 0,1 cm³ r-u

α- naftyloaminy (odczynnik Griessa); w przypadku obecności azotynów pojawia się czerwono - amarantowe (do brunatnego) zabarwienie.

Wykrywanie azotanów:

1. w celu usunięcia azotynów, które dają taką samą reakcję barwną, do probówki

wsypać 1 g mocznika, rozpuścić i wstawić do łaźni wodnej o temp. 10⁰C, po

czym wlać ok. 2 cm³ stężonego kwasu siarkowego nie dopuszczając do wrzenia.

2. po ustąpieniu wydzielania się pęcherzyków gazu, wlać ostrożnie 1cm³ r-u

dwufenyloaminy; pojawienie się zabarwienia niebieskiego do granatowego

świadczy o obecności azotynów.

Wykrywanie kationów amonowych:

1. na szkiełko zegarkowe nanieść 0,2 cm³ odczynnika Nesslera,

2. dodać (inną pipetą) 0,2 cm³ badanej hodowli i wymieszać,

3. pojawienie się żółtopomarańczowego do czerwonobrunatnego zabarwienia

świadczy o obecności kationów amonowych

Zadanie 4. Hodowla bakterii chemosyntezy żelazistej

1. Do probówki z pożywką mineralną wg Lieske (zawierającą Fe⁺⁺) wprowadzić

0,5 cm³ hodowli osadu czynnego

2. Inkubować przez 14 dni w temperaturze pokojowej

3. Po inkubacji opisać i wyjaśnić zaobserwowane zmiany w wyglądzie hodowli

Zadanie 5. Obserwacja mikroskopowa bakterii chemosyntezy siarkowej pochodzących z

hodowli w warunkach słabego natlenienia

1. Wykonać preparat przyżyciowy z osadu czynnego

2. Zaobserwować charakterystyczne nitkowate bakterie siarkowe z granulami siarki

widocznymi jako czarne kropki wewnątrz komórek

3. Wykonać rysunek

Zadanie 6. Obserwacja mikroskopowa purpurowych bakterii siarkowych pochodzących z

hodowli w warunkach beztlenowych

1. Wykonać preparat przyżyciowy

2. Zaobserwować duże bakterie wypełnione licznymi granulami siarki i poruszające się

ruchem śrubowatym. Wykonać rysunek.

Zadanie 7. Hodowla w warunkach beztlenowych bakterii denitryfikacyjnych

Bakterie denitryfikacyjne są heterotrofami oddychającymi w warunkach beztlenowych

za pomocą NO₃^-.

1. Probówki z bulion z KNO₃ zaszczepić osadem dennym (ok. 0,5 cm³) i zakorkować

uszczelniając folią

2. Inkubować przez 7 dni w temperaturze pokojowej.

3.W wyniku denitryfikacji wydziela się gaz (N₂) oraz tworzą się m. in. azotyny i

amoniak

Zadanie 8. Hodowla w warunkach beztlenowych bakterii desulfurykacyjnych

Bakterie desulfurykacyjne są bezwzględnie beztlenowymi heterotrofami oddychającymi za pomocą SO₄^-2

1. Zaszczepić osadem dennym metodą kłutą słupki agarowe z octanem ołowiu

2. Inkubować przez 7 dni w temperaturze pokojowej

3. Po inkubacji sprawdzić, czy pożywka ściemniała wzdłuż (i wokół) linii wkłucia.

Bakterie desulfurykacyjne redukują S⁺⁶ (SO₄^-2) do S^-2, który reaguje z kationami

metali (tu Pb⁺²) tworząc ciemne siarczki metali (w zastosowanej pożywce PbS).

Zadanie 9. Hodowla w warunkach beztlenowych bakterii fermentacji masłowej

Fermentacja jest rodzajem oddychania beztlenowego, w którym substrat oddechowy (np. sacharoza) jest utleniany za pomocą innego związku organicznego. Fermentację masłową przeprowadzają głównie klostridia, czyli beztlenowe laseczki z rodzaju Clostridium, np. bakterie glebowe Clostridium pasteurianum. W wyniku fermentacji masłowej powstaje kwas masłowy, CO₂ i H₂.

1. Probówki z 2% roztworem sacharozy zaszczepić grudką ziemi

2. Zawartość probówki ogrzewać przez 10 minut w łaźni wodnej w temperaturze

75-80^oC, w celu usunięcia tlenu i zabicia bakterii nieprzetrwalnikujących

3. Następnie probówkę szybko schłodzić i zakorkować uszczelniając folią

4. Inkubować przez 7 dni w temperaturze pokojowej.

5.Po inkubacji sprawdzić zapachowo obecność kwasu masłowego (charakterystyczny

zapach zjełczałego masła)

6.Pobrać 3 ml przesączonej hodowli na szkiełko zegarkowe, dodać kilka kropli

chlorku żelaza i podgrzać. W obecności kwasu masłowego pojawi się brązowy

maślan żelaza (III).

Zadanie 10. Hodowla w anerostacie - pokaz

---