WYKŁAD 9

Detektor refraktometryczny

Jest najbardziej uniwersalnym detektorem spośród stosowanych w HPLC.

Detekcja polega na pomiarze różnicy współczynnika załamania światła eluentu i eluentu zawierającego w sobie substancję wymytą z kolumny.

Budowa

Przez jedną jego komórkę przepływa sam eluent, a przez drugą mieszanina eluentu i substancji analizowanej

Im większa jest różnica w wartościach współczynników załamania światła mierzonych w obu komórkach tym większa jest czułość detekcji.

Można przyjąć, że detektor refraktometryczny jest detektorem o średniej czułości i w optymalnych warunkach można nim wykryć 1 ppm chromatografowanej substancji.

Wskazania detektora zmieniają się ze zmianą składu fazy ruchomej dlatego detektor ten nie nadaje się do pracy w przypadku elucji gradientowej. Jest wrażliwy na zmiany ciśnienia i temperatury, dlatego musi być termostatowany z dokładnością ±0,01'C

Stosuje się go do wykrywania węglowodanów, alkoholi i kwasów alifatycznych.

Detektory elektrochemiczne

Najczęściej stosowane to polarograficzne i kulometryczne, służące do wykrywania substancji nieorganicznych i organicznych podlegających reakcjom elektrochemicznego utleniania i redukcji. Są one bardzo użyteczne ze względu na ich selektywność i czułość względem niektórych związków. Są stosowane zwłaszcza do analizy związków biologicznie czynnych - syntetycznych i naturalnych np. katecholamin.

Pewnym ograniczeniem w chromatografii z detekcją elektrochemiczną jest fakt, że nie można jej stosować w normalnym układzie faz, ponieważ faza ruchoma mniej przewodzi prąd elektryczny, co zwykle osiąga się przez dodatek soli. A co za tym idzie eluent musi zawierać wodę.

SPEKTOMETRIA MAS

To uniwersalna technika analityczna zaliczana do metod spektroskopowych, której podstawą jest pomiar stosunku masy do ładunku elektrycznego cząsteczki.

Współcześnie istnieje wiele odmian tej techniki, z której każda posiada inne zastosowanie i wymaga stosowania aparatów o innej konstrukcji. Wszystkie te techniki są jednak oparte na jonizacji cząsteczek lub atomów, a następnie detekcji liczby i stosunku masy do ładunku powstających jonów. Wyniki działania spektrometru mas są przedstawiane w postaci tzw. widma masowego.

Wszystkie spektrometry mają natomiast wspólny schemat blokowy, w którym są ujęte podstawowe elementy składowe:

- źródło jonów - urządzenie w którym następuje jonizacja cząsteczek przy użyciu różnorodnych technik.

- analizator - w którym wcześniej powstałe jony ulegają rozdziałowi na podstawie stosunku ich masy do ładunku

- detektor - urządzenie „zliczające” jony napływające z analizatora

Spektrometr mas rejestruje elektrycznie naładowane cząstki i daltego, aby widmo mogło powstać badana substancja musi ulec jonizacji, chyba że jest już w postaci jonowej.

Układ wprowadzania próbek (raczej nie będzie na egzaminie do odwołania)

Jest kilka alternatywnych sposobów wprowadzania próbki do spektrometru mas, a zastosowany układ zależy na ogół od lotności i natury próbki oraz metody jonizacji. Wprowadzenie próbki do układu jest dość istotnym przedsięwzięciem, ponieważ w najczęściej stosowanych przyrządach cały układ musi być utrzymany pod bardzo niskim ciśnieniem (w wysokiej próżni), aby jony mogły poruszać się bez przeszkód.

Próbki analizowane mogą być w postaci gazu, cieczy lub ciała stałego i od charakteru próbki zależy sposób jej wprowadzania.

Układy zimne

Gazy lub związki bardzo lotne w temperaturze pokojowej mogą przeciekać do spektrometru mas przez szklany piasek(chyba) i dostawać się rurką szklaną do źródła jonów

Układ z wlotem gorącym

1. Bardzo podobny do wlotu zimnego z tym, że można go ogrzewać do ok. 300'C w celu odparowania związków, które następnie doprowadza się do źródła jonów za pomocą ogrzewanego przewodu. Aby uniknąć katalizowanego rozkładu próbki lub przegrupowania, wskazane jest wytwarzanie całego układu AGHIS (z ang. All-glass heated inlet system)

2. Wlot przez septum, składający się z ogrzewanego zbiornika z nierdzewnej stali do którego wprowadza się ciepłe próbki, które odparowane pod niskim ciśnieniem i w wysokiej temperaturze dyfundują przez układ zaworowy do źródła jonów.

Oba wloty zimny i gorący wymagają próbki w ilości do miligrama.

Wprowadzenie bezpośrednio za pomocą sondy (włącznie do tego miejsca)

Związki, które nie są wystarczająco lotne, aby mogły być wprowadzane przez wlot zimny lub gorący, można umieszczać bezpośrednio w źródle jonów za pomocą sondy przechodzącej bezpośrednio przez próżniową śluzę. Pod niskim ciśnieniem panującym wewnątrz typowego źródła, w którym zachodzi jonizacja elektronami, oraz w wyniku ogrzewania liczne związki stają się wystarczająco lotne, aby mogły dawać dobre widma.

Stosując zmodyfikowaną konstrukcję sondy, można wprowadzając ją nie wprost do źródła, ale tuż nad nim lub jako strumień elektronów używanych do jonizacji.

Wlot przez chromatograf gazowy

Stosujemy, gdy analizujemy mieszaniny związków, a nie jak poprzednio czyste lub prawie czyste związki. Widmo mas mieszaniny jest zwykle zbyt złożone, aby można je było interpretować bez wątpliwości, dlatego wskazany jest rozdział składników mieszaniny przed badaniem metodą spektroskopu mas.

Stosowane są dwie metody połączenia chromatografu z MS:

1. Należy wprowadzić z chromatografu do spektrometru tylko część próbki, aby nie spowodować przeciążenia układu - uzyskuje się to za pośrednictwem separatorów, gdzie oddziela się z reguły nadmiar gazu nośnego od próbki (stosując np. membrany półprzepuszczalne) i wtedy wprowadza się ją do spektrometru.

2. Jeżeli w chromatografie gazowym stosuje się kolumnę kapilarną o niewielkim przepływie gazu nośnego, a układ odpompowujący spektrometru masowego ma wystarczającą wydajność, to możliwe jest bezpośrednie połączenie chromatografu masowego ze spektrometrem masowym - są to zazwyczaj chromatografy o wysokiej sprawności i takie połączenia są najczęściej spotykane.

Wlot z roztworów

Połączenie spektrometru mas z przepływającym strumieniem cieczy stanowi pewne techniczne wyzwanie, gdyż niezbędne jest tutaj odparowanie całego eluentu, a następnie usunięcie rozpuszczalnika, zanim rozpuszczona substancja zostanie wprowadzona do źródła jonów i poddana jonizacji w fazie gazowej. Jeżeli nie uda się usunąć nadmiaru rozpuszczalnika to spowoduje to powstanie niedopuszczalnie wysokiego ciśnienia w źródle jonów.

Termosprej - jedyny szeroko rozpowszechniony interfejs(połączenie między spektrometrem mas i chromatografem) w którym ciecz jest podgrzewana i przepuszczana dyszę, co powoduje wytwarzanie aerozolu. Sam proces rozpylania nosi nazwę nebulizacji. Szybkie pompowanie pozwala na uniknięcie większości rozpuszczalnika, a jonizacja zachodzi w wyniku reakcji chemicznych.

Przepływ ciągły lub dynamiczne bombardowanie szybkimi elektronami - wprowadzenie cieczy do źródła jonów skonstruowanego w ten sposób, że jonizacja zachodzi bezpośrednio z fazy ciekłej.

Elektrosprej - polega na wprowadzeniu strumienia cieczy o niewielkim przepływie w silne pole elektryczne pod ciśnieniem atmosferycznym. Pole elektryczne jest wytwarzane przez przyłożenie napięcia 3-6kV między kapilarą, a elektrodą o przeciwnym znaku. Pole powoduje akumulację ładunków w powierzchniowej warstwie cieczy na końcu kapilary, która to warstwa ulega rozerwaniu, a znebulizowana ciecz tworzy strumień naładowanych kropelek. Odparowanie rozpuszczalnika zawartego w kropelkach powoduje ich kurczenie, aż do momentu, w którym siły odpychania kolumbowskiego zbliżą się do poziomu spójności i spowodują ich rozerwanie. Krople mogą w ten sposób ulegać kaskadowemu rozszczepieniu do coraz to mniejszych kropelek, aż do momentu, gdy pole elektryczne na ich powierzchni stanie się wystarczająco duże, aby spowodować desorpcję jonów.

Zasada spektrometru mas w analizie substancji organicznych w pierwszym etapie polega na wytworzeniu jonów tej substancji. Metoda wytwarzania jonów tej substancji może być różna w zależności od sposobu w jakim następuje jonizacja.

We współczesnej spektrometrii mas stosuje się:

- jonizację strumieniem elektronów

- jonizację polem elektrycznym

- jonizację chemiczną

- desorpcję polem elektrycznym

- spektrometrię mas jonów wtórnych

- bombardowanie szybkimi atomami

- jonizację w iskrze

- jonizację w indukcyjnie sprzężonej plazmie

- elektrorozpylanie

- jonizację w wyniku desorpcji laserem

Jonizacja i fragmentacja

Jon dodatni może zostać wytworzony z cząsteczki poprzez proste usunięcie jednego elektronu - proces destrukcyjny.

Proces jonizacji można przedstawić równaniem:

M → M⁺ + e

Jon M⁺ jest nazywany jonem molekularnym (lub jonem macierzystym) i jest charakteryzowany dwoma parametrami: ładunkiem (z) i masą (m).

W spektrometrach masowych jony są analizowane wg stosunku masy do ładunku (m/z). Jeżeli utworzony jon będzie miał ładunek jednostkowy, wówczas z będzie równy +1 i stosuenk masy do ładunku będzie równy liczbowo masie jonu.

W celu wytworzenia jonu molekularnego z obojętnej cząsteczki niezbędne jest dostarczenie energii przynajmniej równej pierwszemu potencjałowi energetycznemu cząsteczki. Wartość ta zależy od natury pierwszego orbitalu, gdyż zazwyczaj z niego urywany jest elektron.

W spektrometrii mas w większości metod jonizacji stosuje się energie wyższe niż pierwszy potencjał jonizacyjny. Jony z nadmiarem energii wewnętrznej łatwo ulegają dysocjacji. Proces ten powszechnie nazywany jest fragmentacją. Prowadzi on do powstania nowych jonów i cząstek obojętnych.

Jon molekularny może ulegać rozpadowi na:

- parzystoelektronowy jon i nieparzystoelektronową cząstkę obojętną.

- nieparzystoelektronowy jon i parzystoelektronową cząstkę obojętną.

Procesy fragmentacyjne mogą przebiegać z oderwaniem parzyto- lub nieparzystoelektronowych cząstek obojętnych, a powstałe jony i cząstki mogą się dalej rozpadać wg ustalonych schematów. Taki proces fragmentacji prowadzi do powstania szeregu jonów, które tworzą widmo masowe danego związku. Wszystkie drogi fragmentacji tworzą schemat fragmentacji charakterystyczny dla danego związku.

Jonizacja elektronowa EI

Jest najstarszym, ale w dalszym ciągu najczęściej stosowanym sposobem jonizacji GC-MS.

W tym układzie elektrony emitowane z włókna żarowego (filamentu), przelatując przez komorę jonizacji w kierunku anody oddziaływują z cząsteczkami próbki powodując ich jonizację. Najpierw tworzy się jon molekularny, który później wg ustalonych schematów, charakterystycznych dla danego typu cząsteczek, ulega fragmentacji.

Energia potrzebna do jonizacji cząsteczek jest różna, pierwszy jony pojawiają się już prz energii 15-20 eV - potencjał jonizacji. Wydajność jonizacji gwałtownie wzrasto do ok. 50eV po czym osiąga względnie stałą wartość. Zazwyczaj pracuje się przy potencjale 70 eV. Fragmentacja uzależniona jest od energii jonizacji, im jest ona większa tym więcej fragmentów powstaje.

Warto wiedzieć:

1. Widmo powstające w spektrometrze masowym to: widmo fragmentacyjne.

2. Czym się różni pik chromatograficzny od piku powstającego w widmie masowym(fragmentacyjnym)?- Pik chromatograficzny- krzywa Gausa, pik masowy- sygnały prądowe (stosunek masy do ładunku i natężenia)

3. Jak narysować widmo fragmentacyjne danego związku (będzie lub nie będzie podany stosunek masy do ładunku) np. wody.

---