Wiadomości ogólne
Białka są podstawowym materiałem, z którego zbudowana jest protoplazma i struktury komórek spełniających czynności życiowe. Występują one we wszystkich komórkach roślinnych i zwierzęcych, są niezbędnym składnikiem pokarmowym dla ludzi i zwierząt.
Białka są to substancje wielkocząstkowe zbudowane z α-L-aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi w łańcuchy polipeptydowe. Wiązanie peptydowe powstaje w ten sposób, że grupa aminowa jednego łączy się z grupą karboksylową drugiego aminokwasu z wydzieleniem cząsteczki wody.
Związki powstałe przez połączenie dwóch lub więcej aminokwasów za pomocą wiązań peptydowych [ - CO - NH - ] noszą nazwę peptydów.
Białka są związkami złożonymi z co najmniej 100 aminokwasów. Kolejność i liczba aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym jest uwarunkowana genetycznie i nosi nazwę struktury pierwszorzędowej albo pierwotnej białka.
Właściwości białek zależą od liczby aminokwasów związanych w łańcuch, od ich charakteru i kolejności występowania w łańcuchu. Liczbę powiązanych aminokwasów (długość łańcucha) można z pewnym przybliżeniem pośrednio określić przez oznaczenie masy cząsteczkowej białka. Natomiast charakter wchodzących w jego cząsteczkę aminokwasów i ich skład ilościowy określa się przez rozdział i oznaczenie poszczególnych składników w hydrolizacie kwasowym lub enzymatycznym.
Aminokwasy są związkami o podobnych właściwościach chemicznych, dlatego do ich izolowania i oznaczania stosuje się metody chromatografii bibułowej (podziałowej), jonowymiennej, cienkowarstwowej, sita molekularnego i innych. Zwłaszcza chromatografia jonowymienna odegrała w analizie aminokwasów zasadniczą role, gdyż na jej podstawie stosuje się powszechnie automatyczne analizatory aminokwasów (wg Steina i Moora).
Za pomocą metod chromatograficznych nie jest jednak możliwe ustalenie kolejności występowania tych składników w łańcuchu polipeptydowym (struktury pierwotnej). Kolejność tę można ustalić w białku oczyszczonym do postaci jednorodnej (sprawdzenie jednorodności przez chromatografie jonowymienną, adsorpcyjną i powinowactwa, elektroforezę i ultrawirowanie) różnymi żmudnymi metodami, przez rozkład na podjednostki, czy składowe peptydy itp. Około 25 lat temu wprowadzono automatyczny aparat do stopniowej degradacji łańcucha polipeptydowego i oznaczania kolejno odłączanych składników (analizy sekwencyjnej).
Mimo znacznych trudności, dla wielu polipeptydów i białek ustalono już kolejność (sekwencję) aminokwasów, a pierwszymi z nich były: insulina, zawierająca 51 aminokwasów i rybonukleaza, zawierająca 124 aminokwasy.
2. Struktura wtórna białek.
Kolejność aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym jest określana, jak wyżej wspomniałam, jako pierwszorzędowa struktura cząsteczki i utrwalona wyłącznie kowalencyjnymi wiązaniami peptydowymi. Jednakże taki łańcuch może być różnie usytuowany w przestrzeni, co z kolei stanowi tzw. strukturę wtórną białka. Badania struktury wtórnej białek prowadzi się metodami fizycznymi, a przede wszystkim za pomocą interferencji rentgenograficznej, czyli badania ugięcia promieni Roentgena (promieni X) na węzłach siatki krystalograficznej białka. W ramach struktury wtórnej rozróżnia się jej trzy poziomy: drugorzędową, trzeciorzędową i czwartorzędową.
Struktura drugorzędowa jest to sposób i stopień zwinięcia łańcucha polipeptydowego w formie śruby prawej, czyli tzw. α-heliksu lub też struktury pasmowej. Typowym przykładem struktury α-heliksu jest cząsteczka α-keratyny. Jest ona ustabilizowana maksymalna liczbą wiązań wodorowych, które tworzą się w wyniku powinowactwa wodoru do elektroujemnych atomów azotu lub tlenu. W zwiniętym łańcuchu polipeptydowym tworzenie ich polega na oscylacji protonów między grupami NH i C=O wiązań peptydowych występujących w sąsiednich zwojach. Są one bardzo słabe, lecz ze względu na ich dużą liczbę w łańcuchu są zdolne do utrwalania jego struktury.
Struktura pasmowa jest charakterystyczna dla β-keratyny, czyli cząsteczki w pełni rozwiniętej, a występuje również w fibroinie jedwabiu, ze względu na niemożność tworzenia wiązań wodorowych wewnątrz łańcucha (brak zwinięcia) powstają one pomiędzy odpowiednimi grupami sąsiadujących łańcuchów, co powoduje powstanie struktury zbudowanej z płasko ułożonych obok siebie licznych łańcuchów polipeptydowych. Gdy łańcuchy są maksymalnie rozwinięte, ich okres identyczności, czyli odległość między sąsiadującymi atomami o identycznej konfiguracji (np. miedzy sąsiednimi resztami) wynosi 0,72 nm. Taka odległość jest charakterystyczna dla białek bogatych w glicynę i głównie fibrylarnych, ale jej fragmenty występują również w białkach globularnych.
Obok struktur α-heliksu oraz pasmowej, stosunkowo rzadko spotykana jest struktura β-heliksu będąca tworem o odwrotnej symetrii. Jest ona związana z lewokierunkowym zwinięciem łańcucha peptydowego i charakterystyczna dla białek o właściwościach elastycznych, jak np. jedna z frakcji glicyny pszenicy, białko kurczliwe rybosomy, czy elastyna (białka elastomeryczne).
W białkach o typowej strukturze α- lub β-heliksu występują strefy o zakłóconej regularności, która może wynikać ze znacznego nagromadzenia w nich proliny (zmieniającej kąt tworzonego wiązania peptydowego) lub glutaminy (tworzącej dodatkowe wiązania wodorowe). Powoduje to powstawanie tzw. struktur przypadkowego kłębka, które w strukturze białek szczególnie bogatych w wymienione aminokwasy (np.: gliadyny i gluteniny pszenicy) mogą stanowić nawet 70% struktury. Cząsteczki białek globularnych są zwykle mieszaninami opisanych trzech struktur i np. mioglobina zawiera 75% struktury heliakalnej i resztę nieuporządkowanej, a chymotrypsyna tylko 14% α-heliksu, 45% struktury pasmowej i resztę, czyli 41% w postaci nieuporządkowanego (przypadkowego) kłębka.
Struktura trzeciorzędowa dotyczy głównie białek globularnych. Jest to sposób pofałdowania i zwinięcia heliksu białkowego w przestrzennie zwarty twór ściśle określony przez strukturę pierwszorzędową. Utrwalenie tej struktury dokonuje się z udziałem wiązań wodorowych, a także innych mogących tworzyć się między reaktywnymi grupami reszt aminokwasowych. Mogą to być wiązania jonowe miedzy grupami kwasowymi (Asp i Glu) i zasadowymi (Lys, Arg, His), wiązania estrowe i tioestrowe między grupą karboksylową i hydroksylową (Ser, Thr), hydrosulfidową (Cys) i wiązania disulfidowe między dwiema resztami hydrosulfidowymi, a ponadto wiązania typu sił van der Waalsa czy kohezji.
Zachowanie naturalnej drugo- i trzeciorzędowej struktury ma podstawowe znaczenie przy działaniu katalitycznym białek enzymatycznych i innych białek biologicznie czynnych. U białek włókienkowych struktura trzeciorzędowa występuje tylko w postaci szczątkowej i przejawia się dodatkowym zwinięciem kilku łańcuchów polipeptydowych względem siebie w postaci „liny okrętowej”. Strukturę drugo- i trzeciorzędową białka określa się wspólnie jako konformację cząsteczek.
Struktura czwartorzędowa określa stopień asocjacji lub polimeryzacji poszczególnych cząsteczek białkowych lub łańcuchów polipeptydowych (zwanych tu podjednostkami lub monomerami) w większe zespoły, zazwyczaj oligomery. Ta struktura jest utrwalona przede wszystkim przez wiązania disulfidowe (dwusiarczkowe), a także przez kleszczowe (chelatowe), tworzące się z udziałem grup fenolowych, aminowych karboksylowych i za pośrednictwem jonów metali, oraz siłami van der Waalsa. Są znane przykłady przekształcania się prze asocjację białka nieaktywnego w aktywne, np. fosforylazy b w fosforylazy a. (rys.3)
3. Klasyfikacja białek
Istnieje kilka sposobów klasyfikacji białek, z których najbardziej rozpowszechniony dzieli białka ze względu na budowę i niektóre właściwości, zwłaszcza rozpuszczalność. Do białek prostych są zaliczane te, które po hydrolizie dają wyłącznie aminokwasy lub ich pochodne. Natomiast białka złożone składają się z cząsteczki białka prostego połączonego z inną, niebiałkową cząsteczką zwykle organiczną (grupą prostetyczną) z udziałem wiązań kowalencyjnych, heteropolarnych i koordynacyjnych.
Białka proste dzieli się na: protaminy, histony, albuminy, globuliny, prolaminy, gluteiny i skleroproteiny, a za kryterium tego podziału przyjęto rozpuszczalność w wodzie, roztworach soli i etanolu oraz charakter wchodzących w ich skład aminokwasów. Pierwsza grupa należy do polipeptydów, pięć następnych do białek globularnych, a ostatnia do fibrylarnych.
Białka proste. Protaminy, ze względu na małą masę cząsteczkową (do 5 kDa) są zaliczane do polipeptydów. Występują w dojrzałej spermie ryb i ptaków. Są zbudowane tylko z 8 rodzajów aminokwasów, o znacznej przewadze zasadowych, zwłaszcza Arg, natomiast nie zawierają aminokwasów siarkowych. W związku z taką budową protaminy odznaczają się dużą zawartością azotu (ok. 25%) i mają charakter zasadowy.
Histony są typowymi białkami jądra komórkowego, w którym występują w połączeniu z kwasami nukleinowymi jako nukleoproteiny. Ze względu na ich silnie zasadowy charakter mają właściwości podobne do protamin (choć ich skład aminokwasowi jest bardziej zróżnicowany) oraz zawierają małe ilości aminokwasów siarkowych.
Albuminy są bardzo rozpowszechnione w cieczach ustrojowych i ziarnach roślin uprawnych. Są rozpuszczalne w wodzie i rozcieńczonych roztworach soli, ulegają wysoleniu w obecności większych stężeń siarczanu amonu. W ich skład wchodzą wszystkie aminokwasy z przewagą kwaśnych. Do ważniejszych należą: albumina surowicy krwi, α-albumina mleka, owoalbumina jaja, rycyna nasion rącznika oraz leukozyna ziarna zbóż. Podstawową ich funkcją w tkankach jest regulacja ciśnienia osmotycznego cieczy ustrojowych i wiązanie różnych składników (odżywczych, regulacyjnych).
Globuliny są największą, najważniejszą i najbardziej rozpowszechnioną grupą białek, a należy do niej większość enzymów i glikoprotein. Występują w cieczach ustrojowych zwierząt (α-, β-, γ-globuliny surowicy) oraz wchodzą w skład białek zapasowych nasion, zwłaszcza motylkowatych. Globuliny są nierozpuszczalne w wodzie, a rozpuszczają się w rozcieńczonych roztworach soli i mogą być wysolone przez ich stężone roztwory. W skład globulin wchodzą wszystkie aminokwasy białkowe, w tym dużo Asp i Glu.
Szczególnym rodzajem białek tej grupy są tzw. immunoglobuliny (Ig) zwane też przeciwciałami. Są to specyficzne białka obronne, występujące w plazmie krwi, limfie i innych wydzielinach kręgowców. Filogenetycznymi prekursorami Ig są tzw. hemaglutyniny, występujące u bezkręgowców w postaci związanej wewnątrz komórek. Szczególną właściwością tych białek jest wiązanie obecnych w ustroju ciał obcych, tzw. antygenów i brak tej możliwości w stosunku do białek własnych.
Prolaminy stanowią grupę białek rozpuszczalnych w niższych, rozcieńczonych alkoholach alifatycznych i niektórych aromatycznych, zarówno bez redukcji (prolaminy I), jak i po redukcji (prolaminy II). Występują tylko w nasionach traw, np. pszenicy, gdzie stanowią frakcję gliadyny i częściowo gluteniny kompleksu glutenowego. Zawierają szczególnie dużo Glu i Pro oraz azotu amidowego, natomiast wyjątkowo mało Lys.
Gluteliny są rozpuszczalne w rozcieńczonych kwasach i zasadach, natomiast nierozpuszczalne w roztworach soli obojętnych i alkoholach. Występują w nasionach roślin jednoliściennych i stanowią frakcję tzw. białek resztkowych i glutenu; są w małym stopniu scharakteryzowane.
Skleroproteiny są duża grupą białek fibrylarnych występujących u zwierząt jako składniki tkanki łącznej i strukturalnej. Są one szczególnie odporne na działanie rozpuszczalników i enzymów proteolitycznych i występują w formie pseudokrystalicznej. Głównymi przedstawicielami tych białek są: keratyna, charakteryzująca się dużą zawartością Cys i innych aminokwasów o prostej budowie, oraz kolagen i elastyna, odznaczające się dużą zawartością Pro i hydroksy-Pro. Ze względu na znaczną odporność na działanie enzymów proteolitycznych i ubogi skład aminokwasowi, skleroproteiny mają małą wartość żywieniową. Żelatyna, podobna do kolagenu składem i właściwościami, nie jest białkiem naturalnym, lecz produktem degradacji cieplnej kolagenu otrzymywanym na dużą skalę do celów spożywczych i technicznych. Do białek włókienkowych zalicza się też fibroinę i serycynę jedwabiu oraz sponginę występującą w gąbkach i gorgoninę w koralach.
Białka złożone. Fosfoproteiny odznaczają się zawartością ok. 1% fosforanu związanego estrowo z grupami -OH seryny i treoniny. Głównymi przedstawicielami tych białek są α-, β- i κ-kazeina mleka oraz fosfowityna i witelina żółtka jaja. Te ostatnie zawierają ok. 30% Ser i 10% łatwo przyswajanego fosforanu, w związku z czym żółtko jest jego bardzo bogatym źródłem.
Glikoproteiny zawierają związane kowalencyjnie liczne oligosacharydy o łańcuchu prostym, czasem rozgałęzionym, złożonym zwykle z 2-10 reszt monosacharydu (zwykle są zbudowane z N-acetyloheksozoaminy, galaktozy lub mannozy, a rzadziej glukozy). Dołączenie sacharydów następuje po pełnej syntezie łańcucha peptydowego w ramach tzw. modyfikacji potranslacyjnej. Glikoproteiny są bardzo rozpowszechnione u roślin i zwierząt, gdzie stanowią składniki tzw. cieczy ustrojowych i białek błonowych, również enzymów (np.: hydrolaza acetylocholiny, glukoamylaza), hormony białkowe, białka surowicy krwi (np. α1-glikoproteina plazmy), wszystkie przeciwciała i substancje grupowe krwi, pektyny. Zawartość sacharydów w glikoproteinach waha się od 3% (albumina jaja) do 50% (albumina gruczołu podszczękowego). Podstawowymi funkcjami glikoprotein są: ochrona przed proteolizą, zlepiane i „smarowanie” powierzchni faz; odpowiadają też za rozpoznawanie ciał obcych (przeciwciała) oraz własnych, specyficznie pasujących elementów, np. znamię słupka i powierzchnia pyłku u roślin, szczepy bakterii Rhiobium i powierzchnia korzeni ( lektyny). Stanowią też podstawowy składnik substancji grupowych krwi oraz licznych receptorów występujących na powierzchni komórki.
Chromoproteiny stanowią chemicznie różnorodną grupę białek, których składnikiem niebiałkowym jest substancja barwna. Grupa ta dzieli się na hemoproteiny, zawierające tetrapirolowy układ hemowy, związany z jonem Fe³ oraz inne chromoproteiny, w których występują inne składniki barwne związane z białkiem - zwykle odwracalnie. Do hemoprotein należą: hemoglobina i mioglobina, odpowiedzialne za dostarczanie organizmom zwierzęcym tlenu, cytochromy, transportujące elektrony w głównych procesach oksydoredukcyjnych wszystkich organizmów, leghemoglobina uczestnicząca w wiązaniu N2 przez bakterie oraz niektóre enzymy (peroksydaza, katalaza). Z innych chromoprotein należy wymienić fikobiliny i fikocyjaniny oraz fitochromy, zawierające tetrapirolowe układy otwarte (bez jonu metalu), melanoproteiny, czyli substancje barwne skóry oraz pochodne karotenowi - rodopsyny - uczestniczące w procesie widzenia.
Metaloproteiny zawierają różne jony metali związane bezpośrednio z białkiem: należą do nich tzw. ferrodoksyny, czyli białka żelazo-siarkowe, a także ferrytyna i ceruloplazmina, flawoproteidy, kompleksy białkowo-chlorofilowe oraz liczne enzymy, w których jon metalu pełni zasadniczą rolę strukturalną lub katalityczną. Znane są białka czynne, zawierające w swoim składzie Mg (fosfatazy), Mn (arginaza), Zn (insulina), Cu (oksydazy), Mo (reduktaza azotanowa) i inne.
Nukleoproteiny obejmują grupę polipeptydów i białek, głównie zasadowych (protamin, histonów), które są związane w kompleksy z kwasami nukleinowymi (DNA i RNA) za pomocą wiązań kowalencyjnych. Występują w jądrach komórkowych, gdzie stanowią podstawowy materiał genetyczny komórki (w postaci chromatyny), a także w rybosomach, gdzie tworzą kompleksy RNA z białkiem. Ponadto z prawie czystych nukleoprotein zbudowane są wirusy.
Lipoproteiny są to białka sprzężone z lipidami. Występują one głównie w bogatych w tłuszcz ziarnistościach oraz błonach komórkowych i cytoplazmatycznych, a także w plazmie krwi, cytoplazmie komórek i żółtku jaja. Odpowiadają za transport i rozprzestrzenianie lipidów, hormonów, witamin rozpuszczalnych w lipidach itp.
Ze względu na kształt cząsteczki, wyróżnia się białka fibrylarne i globularne.
Do białek fibrylarnych (włókienkowatych) zaliczamy białka o znacznej asymetrii cząsteczek, tj. dużym stosunku długości osi długiej do krótkiej. Ich cząsteczki stanowią zespoły rozciągniętych łańcuchów polipeptydowych. Są one na ogół nierozpuszczalne.
Białka globularne to te, których cząsteczki mają kształt eliptyczny, o niewielkim stosunku długości osi długiej do krótkiej. Składają się z pofałdowanych i dodatkowo zwiniętych łańcuchów polipeptydowych. Są na ogół dobrze rozpuszczalne w wodzie.
4. Ogólne właściwości białek.
Białka jako koloidy. Większość cząsteczek białkowych waha się w granicach 5-100 n, a więc ich roztwory mają charakter koloidowy. Ponieważ aminokwasy wchodzące w skład cząsteczki białka nadają jej określony ładunek, rozproszone cząsteczki mają charakter hydrofilowy i otaczają się, podobnie jak jony nieorganiczne „płaszczem wodnym”. Otoczka wodna chroni te cząsteczki przed łączeniem się w większe zespoły, a tym samym przed wytracanie z roztworu. Ta właściwość wyjaśnia pozostawanie tak dużych cząsteczek w jednorodnym roztworze, zdolność do znacznego uwadniania się białek (pęcznienia) i opornego oddawania wody przez napęczniałe białko. To ostatnie zjawisko ma duże znaczenie dla stanu uwodnienia żywej komórki. Ponadto pęcznienie odgrywa ważną rolę w suszarnictwie przy dehydratacji wysuszonych produktów zawierających znaczne ilości białka. Stopień dehydratacji zależy od stopnia zachowania białka w niezmienionym stanie w czasie suszenia.
Białka nie mogą przenikać przez błonę półprzepuszczalną o średnicy porów do 5 nm, co wykorzystuje się przy ich oczyszczaniu przez dialize. Roztwory białkowe mogą różnić się od innych roztworów koloidowych tym, że nie zawsze są monodyspersyjne, tzn. w rozproszeniu znajdują się niejednakowej wielkości cząsteczki. Jest to konsekwencją skłonności białek do asocjacji, co powoduje obecność w roztworze różnej wielkości zespołów cząsteczek, a także występowanie ich w mieszaninie.
Denaturacja białka. Zjawisko to powoduje szczególnie dużą zmianę konformacji cząsteczki biała z jednoczesnym zanikiem jej aktywności biologicznej i zmianę niektórych właściwości. Denaturacja zachodzi pod wpływem nadmiernie wysokiej temperatury, mocnych kwasów lub zasad, mocznika, chlorowodorku guanidyny, detergentów, niektórych związków aromatycznych, stężonych roztworów jonów metali ciężkich i soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS). Prowadzi ona do zerwania wiązań wodorowych i niektórych innych niekowalencyjnych, a więc do rozfałdowania łańcucha do układu przypadkowego. Ponadto grupy amidowe glutaminy i asparaginy tworzą wiązania wodorowe raczej z cząsteczkami wody, niż między sobą. Różne białka są w niejednakowym stopniu podatne na działanie czynników denaturujących, a jednoczesny wpływ kilku czynników zwykle potęguje tę wrażliwość.
Denaturacji towarzyszy wiele zmian fizycznych lub chemicznych, jak:
- zmniejszenie rozpuszczalności w punkcie izoelektrycznym,
- utrata aktywności biologicznej,
- zwiększenie aktywności grup chemicznych, zwłaszcza ukrytych wewnątrz cząsteczki; dotyczy to głównie grup fenolowych tyrozyny i SH cysteiny oraz wiązań S - S,
- zwiększenie kąta skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego oraz asymetrii cząsteczek,
- zwiększenie podatności na hydrolizę enzymatyczną.
Denaturacja białka jest procesem praktycznie nieodwracalnym. Stwierdzono jej odwracalność tylko dla białek o stosunkowo prostej budowie, co określa się jako renaturację. Na przykład rybonukleaza zbudowane ze 124 aminokwasów z 4 wiązaniami disulfidowymi po redukcji połączonej z rozfałdowaniem i denaturacją, podlega ponownemu wytworzeniu właściwych wiązań i przywróceniu aktywności.
Proces denaturacji białka utrudnia suszenie produktów zawierających znaczne jego ilości, gdyż denaturowane białko ma zmniejszoną zdolność pęcznienia podczas dehydratacji. Produkty takie suszy się w możliwie niskiej temperaturze w celu uzyskania znacznego stopnia odwracalności procesu. Najlepsze rezultaty daje suszenie sublimacyjne, czyli liofilizacja.
Masa cząsteczkowa. Dla białek przyjmuje się średnią masę cząsteczkową 115 Da na jedną resztę aminokwasowi, stąd dolną granicą, ustaloną dla nich na 100 aminokwasów, winno być 11,5 kDa. Natomiast średnia masa właściwa, uwzględniająca stan uwodnienia białka globularnego, wynosi 1,4 g • cmֿ¹, z wahaniami od 1,3 do 1,6 g • cmֿ¹. Z tych danych można obliczyć objętość. Jeżeli przyjmie się, że minimalna masa cząsteczkowa białka wynosi 1,91 • 10ֿ²º g, objętość wynosi 1,37 nm³.
Najczęściej porównywalną wielkością białek jest masa cząsteczkowa, którą oznacza się dla związków o mniejszych masach cząsteczkowych metodami opartymi na prawach Raoulta, a dla biopolimerów innymi, jak np. rozwiniętą przez Svedberga metodą oznaczania stałej sedymentacji S w ultrawirowaniu. Polega ona na poddaniu roztworu białka dużej sile odśrodkowej do 200 000 g (g - przyśpieszenie ziemskie), co powoduje sedymentację białka z szybkością zależną od masy cząsteczkowej, a przesuwająca się granica faz jest rejestrowana metodami optycznymi lub fotograficznie.
Masy cząsteczkowe białek wahają się w granicach od ok. 11,5 kDa do wielu milionów Daltonów, co wynika zwłaszcza z ich zdolności do asocjacji.
Ładunek elektryczny. Obecność w białkach aminokwasów o charakterze jonowym, nadaje cząsteczkom białkowym ładunek elektryczny, który jest wypadkową wszystkich dysocjujących grup. Jego wartość i znak zależą od pH środowiska, co jest związane z zależnymi również od pH stopniami dysocjacji wszystkich tych grup. Dla każdego białka istnieje określona wartość pH, przy której wszystkie ładunki równoważą się i jego ładunek sumaryczny jest równy zeru; ta wartość pH, podobnie jak u aminokwasów, nazywa się punktem izoelektrycznym białka.
Zawartość w białkach grup zjonizowanych rzutuje na wiele ich właściwości, niektóre z nich mają istotne znaczenie biologiczne, a inne są wykorzystywane w analityce. Należą do nich:
- zmienność konformacji cząsteczek (zależna od pH)
- ruchliwość w polu elektrycznym
- znaczne i zróżnicowane powinowactwo do cząsteczek wody
- zróżnicowane siły wiązania z wymieniaczami jonowymi.
Zmienność konformacji zależna od pH wynika z nierównomiernego rozmieszczenia ładunków w cząsteczce białka, które powoduje labilność wiązań jonowych. Dlatego nawet niewielkie zmiany pH, przez zmianę układu i siły wiązań jonowych zmieniają jednocześnie strukturę trzeciorzędową cząsteczek. Ma to szczególnie istotne znaczenie u białek biologicznie czynnych (np. enzymów), gdyż ich aktywność zależy ściśle od konformacji cząsteczek.
Ruchliwość w polu elektrycznym, wynikająca z wielkości i znaku sumarycznego cząsteczki białka jest powszechnie wykorzystywana w różnych metodach elektroforezy. Metoda ta polega na wędrówce cząsteczek białkowych o sumarycznym ładunku dodatnim lub ujemnym w polu elektrycznym do katody (-) lub anody (+). Metodę wywodzącą się z mało dogodnej elektroforezy swobodnej, odbywającej się w roztworze, zmodyfikowano na wiele sposobów. Do rozdzielania białek najczęściej stosuje się wędrówkę cząsteczek w buforze wysycającym bibułę lub w blokach żelowych (skrobia, agar, poliakryloamid), przy napięciu kilkuset woltów. Zależnie od rodzaju ładunku cząsteczki wędrują od elektrod przeciwnego znaku i z prędkością proporcjonalną do wartości tego ładunku. Efektem jest rozdział na różniące się pod względem ładunku frakcje. Przy rozdziale w żelach, poza różnym ładunkiem, wykorzystywana jest wielkość i kształt cząsteczek białkowych, które z różną prędkością wędrują przez „oczka” siatki tworzonej przez żel.
Odmianą elektroforezy jest tzw. ogniskowanie izoelektryczne, które polega na stworzeniu środowiska rozdziału (żelu) o gradiencie pH między elektrodami. Białka wędrują w żelu w kierunku odpowiedniej elektrody do chwili dotarcia do strefy ściśle odpowiadającej pH ich punktu izoelektrycznego, gdzie pozostają do zakończenia rozdziału.
Efektem wynikającym ze zróżnicowanego powinowactwa do wody jest zdolność białek do niejednakowego reagowania na stężone roztwory soli silnie dysocjowanych, np. siarczanu amonu. W tych warunkach ulegają one wysoleniu, czyli wytraceniu z roztworu, bez utraty właściwości biologicznych i cech strukturalnych. Hydrofilowe cząsteczki białek przyciągają cząsteczki wody, tworzące warstwę ochronną, która przeciwdziała ich zlepianiu się i wytrącaniu z roztworu. Wprowadzenie do roztworu znacznego stężenia ośrodków jeszcze bardziej hydrofilowych, jakimi są jony silnie dysocjowanej soli, prowadzi do przyjęcia przez nie (od białek) cząsteczek wody i ich odsłonięcia. To z kolei powoduje wytrącanie zlepionych cząsteczek białka z roztworu; jest ono różne dla różnych białek i na tym polega możliwość ich frakcjonowania drogą wysalania. Ponowne potraktowanie wysolonego białka wodą powoduje rozpuszczenie jego cząsteczek bez utraty aktywności biologicznej.
Białka o różnej sumarycznej wartości ładunku są z różną siłą wiązane przez tzw. wymieniacze jonowe, czyli substancje syntetyczne, zawierające ruchliwe kationy (kationity) lub aniony (anionity). Są one powszechnie używane (np. w postaci wypełniaczy kolumn) do rozdzielania substancji jonowych, m.in. aminokwasów i białek, gdyż po związaniu substancje te utrzymują się na kolumnie z różną siłą, zależną od ładunku i mogą być selektywnie wymywane. Do rozdziału białek cenne są zwłaszcza pochodne celulozy lub wspomnianego już żelu Sephadex, np. karboksymetylowe (CM-celuloza i CM-Sephadex) jako kationity i dietyloaminoetylowe (DEAE-celuloza i DEAE-Sephadex) jako anionity.
5. Struktura a funkcje białek
Wiadomo od pierwszych badań struktury białek (m.in. rentgenograficznych), że mają one rozbudowaną i zmienną strukturę trzeciorzędową, zależnie od zmieniających się warunków. Dotyczy to zwłaszcza białek aktywnych biologicznie, jak: transportujących tlen (hemoglobina i mioglobina), jony metali we krwi (ferrytyna i ceruloplazmina), substratów przenoszonych przez błony, białek katalitycznych (enzymy), czy regulacyjnych (kinezy białkowe). Większość wymienionych białek pełni swoje funkcje na zasadzie tzw. allosterii, czyli odwracalnej modyfikacji struktury wtórnej, pod wpływem wiązanych w ściśle określonym miejscu cząsteczki, tzw. efektorów (modyfikatorów) allosterycznych. Miejsce wiązania efektora jest określane jako centrum allosteryczne i jest zwykle położone we fragmencie cząsteczki ważnym dla przenoszenia modyfikacji, na struktury uczestniczące bezpośrednio w reakcji.
Najbardziej wszechstronnie współzależność konformacji i funkcji zbadano na przykładzie hemoglobiny (Hb), która ma, zależnie od zmieniającej się struktury, znaczne powinowactwo do O2 (w płucach), względnie bardzo małe (w tkankach peryferyjnych). Przy szczegółowym wyjaśnieniu struktury hemoglobiny (Perutz, 1959) okazało się, że białko to składa się z 4 łańcuchów peptydowych. Każdy z nich tworzy 8 domen α-helikalnych otaczających jedną grupę hemu, dlatego cząsteczka Hb może wiązać jednocześnie 4 cząsteczki O2. Grupa prostetyczna hemu jest zbudowana z protoporfiryny IX związanej koordynacyjnie z Fe² , a tlen wiąże się z tym jonem jednym z wiązań prostopadłych do płaszczyzny hemu. Wiązanie O2 odbywa się za pośrednictwem tzw. His 8 w heliksie F (proksymalnej - bliższej), a po jego połączeniu zbliża się His E7 z sąsiedniego heliksu E (bardziej oddalona). His E7 łączy się wprawdzie bezpośrednio z O2, ale pełni dwie inne funkcje: ochrania sąsiadujące grupy hemowe przed utlenieniem Fe² do Fe³ (wtedy tracą one zdolność wiązania O2) oraz ogranicza powinowactwo hemu do CO (jego wiązanie jest toksyczne i nieodwracalne). W tkance peryferyjnej oddysocjowanie cząsteczki O2 od Hb następuje przy udziale 2,3-bisfosforanu glicerynianu, który jako składnik erytrocytów towarzyszy Hb.
Inne przykłady, to np.: zmiany powinowactwa enzymu permeazy do przenoszonego przez błonę składnika pod wpływem ATP, czy zmiana allosterycznych enzymów w mechanizmach dodatniego czy ujemnego sprzężania zwrotnego (np. rola fosfofruktokinazy w dwukierunkowej regulacji rozpadu glukozy w glikolizie).
Innym mechanizmem przystosowania konformacji białka do jego funkcji (np. katalitycznej) jest działanie kinaz białkowych, które katalizują przenoszenie fosforanu z ATP na ściśle określone grupy - OH (zwykle Ser) wmontowane w łańcuch peptydowy aminokwasów. Do tej samej grupy można zaliczyć modyfikacje potranslacyjne, czyli zmiany dokonujące się po zakończeniu syntezy łańcucha peptydowego na rybosomie. Dotyczy to m.in. wprowadzania grup funkcyjnych, czy tzw. ograniczonej proteolizy, czego efektem jest np. zmiana konformacji centrum katalicznego (przemiana trypsynogenu do trypsyny).
Należy również wspomnieć, że występowanie domen powtarzalnych o określonej sekwencji aminokwasów, może rzutować bezpośrednio na przyjmowanie specyficznej struktury drugorzędowej, która powoduje szczególne właściwości fizykochemiczne czy biologiczne białka. Tak jest m.in. w białkach zapasowych ziarniaków zbóż chlebowych typu prolamin, które zawierają od heksa- do oktapeptydy powtarzalne, bogate w Glu, Pro i Gly. Konsekwencją tego jest powstanie struktury β-helikalnej o znacznej elastyczności i sprężystości, co zostało wykorzystane w piekarstwie. Innym przykładem dotyczącym tego samego białka jest jego rozkład (głównie frakcji α), z udziałem peptydaz trawiennych, m.in. do heksapeptydu Phe-Arg-Pro-Ser-Gln-Asn, który jest poznanym niedawno alergenem typowym dla celiakii.
1