1. Strategie genoterapii
W zależności od typu choroby stosowane są różne strategie terapii genowej:
a. Komplementacja defektu genetycznego.
Do komórek z defektem genetycznym wprowadzana jest prawidłowa kopia genu, na podstawie której powstanie białko, którego wcześniejszy brak lub nieprawidłowe funkcjonowanie powodowało objawy choroby. Strategia stosowana jest w przypadku chorób monogenowych recesywnych np. mukowiscydozy, anemii sierpowatej, hemofilii.
b. Korekta mutacji.
Metoda polega na naprawie defektu genetycznego (uszkodzony fragment genu lub cały gen zastępowany jest poprawną sekwencją). Najczęściej do tego celu wykorzystuje się oligonukleotydy lub rybozymy (RNA o aktywności katalitycznej). Strategia jest wykorzystywana w próbach leczenia chorób monogenowych recesywnych i dominujących (np. pląsawicy Huntingtona).
c. Zahamowanie ekspresji zmutowanego genu.
Jako preparat podaje się antysensowne oligonukleotydy, rybozymy lub siRNA (mały interferujący RNA) wiążące docelową sekwencję DNA lub RNA i degradujące ją. Strategia ma na celu inaktywację genów, których produkty odpowiedzialne są za powstanie choroby. Metoda znalazła zastosowanie w przypadku chorób infekcyjnych, nowotworowych oraz chorób monogenowych dominujących.
d. Eliminacja komórek.
Do komórek docelowych wprowadzane są preparaty genowe zawierające cDNA kodujące białka wywołujące śmierć nieprawidłowych komórek np. czynniki proapoptotyczne, immunostymulujące, toksyczne białka lub ich prekursory. Metoda jest stosowana w przypadku chorób infekcyjnych i nowotworowych
e. Nadanie komórkom nowych cech fenotypowych.
Przykładem jest terapia proangiogenna polegająca na podaniu preparatów genowych zawierających cDNA kodujące proangiogenne czynniki indukujące formowanie nowych naczyń krwionośnych. Terapia proangiogenna znalazła zastosowanie w leczeniu chorób układu krążenia np. niedokrwienia serca i kończyn. Innymi przykładami tego typu strategii są szczepionki DNA mające na celu immunizację ustroju oraz terapia antyangiogenna wykorzystywana w próbach leczenia nowotworów.
Główne problemy terapii genowej
Stosunkowo proste założenia terapii genowej okazały się trudne w realizacji. Pojawiło się wiele problemów uniemożliwiających osiągnięcie efektu terapeutycznego i zastosowanie terapii genowej w klinice. Dlatego też prowadzone są dalsze badania mające na celu ominięcie zaistniałych barier. Przede wszystkim należy zapewnić bezpieczeństwo procedury poprzez przygotowanie nietoksycznych, nieimmunogennych preparatów genowych zgodnych z wymogami farmakopealnymi. Należy także zaprojektować sposób podania (łatwy, bezpieczny i efektywny) oraz określić dawkę preparatu. Ponadto preparaty genowe powinny być łatwe i tanie w syntezie i przechowywaniu. Poważnym problemem jest także brak wydajnego systemu transferu genów do jąder komórkowych komórek docelowych. Z tym z kolei są związane problemy z uzyskaniem długotrwałej ekspresji transgenu na odpowiednim poziomie. Przyczyną niestabilnej ekspresji są także trudności z uzyskaniem ukierunkowanej integracji wprowadzanego DNA, przez co konieczne staje się wielokrotne podawanie preparatu genowego, co z kolei przyczynia się do powstania odpowiedzi immunologicznej ze strony organizmu. Wydajna ekspresja na stałym poziomie wymaga także dobrania odpowiedniego systemu ekspresyjnego tzn. odpowiedniego konstruktu wektora, przy czym szczególną uwagę należy zwrócić na wybór promotora inicjującego transkrypcję.
2. Nukleotydy antysensowne
Są komplementarne i do promotora i do genu - przyłączanie do promotora jest wydajniejsze.
Antysensowne oligonukleotydy liczą 20-30 nukleotydów (zarówno rybo-, jak i deoksyrybonukleotydy), których sekwencja jest komplementarna do mRNA (czyli antysensowna) lub też sekwencji DNA genu lub jego promotora. Oligonukleotydowe antysensy hybrydyzują z mRNA tworząc przestrzenną „przeszkodę”, uniemożliwiając przyłączenie mRNA do rybosomów. Hamowanie ekspresji genu za pomocą antysensu polega także na powstaniu dwupasmowego „hybrydu” złożonego z mRNA i antysensownego oligonukleotydu, który aktywuje enzym RnazęH, której działanie polega na degradacji mRNA w tym dupleksie. Antysensowne oligonukleotydy mogą także wiązać się z sekwencjami DNA, tworząc przestrzenne struktury tripleksów. Gdy struktura taka powstanie w obrębie promotora uniemożliwia wiązanie czynników transkrypcyjnych i hamuje tym samym transkrypcję.
Antysens
Technika wykorzystywana w terapii nowotworów. Oparta jest na hamowaniu syntezy określonych białek poprzez antysensowne oligonukleotydy. Antysensowne oligonukleotydy to 12-30 nukleotydowe fragmenty DNA. Hamowanie syntezy niechcianych białek może przebiegać w dwojaki sposób:
- poprzez asocjację antysensu do wybranej sekwencji pre-RNA, zaburzając składanie
- przez asocjację antysensu do dojrzałego mRNA blokując dostęp do rybosomu, bądź tworząc heterodupleks degradowany przez RNAzę.
3. Rybozymy - co to jest i jakie to ma zastosowanie w genoterapii
Substancje zbudowane z kwasu rybonukleinowego (RNA) zdolne do katalizowania pewnych reakcji chemicznych. Spełniają zatem funkcje analogiczne do enzymów białkowych.
Rybozymy występują u wszystkich organizmów, przede wszystkim w mechanizmie syntezy białek oraz przemian kwasów nukleinowych. Transferaza peptydylowa - enzym wchodzący w skład rybosomów, który tworzy wiązania peptydowe, jest rybozymem (rRNA). Inną ważną funkcją rybozymów snRNA jest wycinanie intronów ze świeżo zsyntetyzowanego mRNA. Niektóre rybonukleazy także są rybozymami.
Pojawiły się już pierwsze eksperymentalne wykorzystania rybozymów do leczenia chorób, m.in. zakażenia HIV, oraz do terapii genowej.
Właściwości katalityczne rybozymów:
- możliwość tworzenia skomplikowanej struktury II i III rzędowej przez parowanie krótkich odcinków w obrębie cząsteczki
- tworzenie niestandardowych par zasad
- obecność grupy -OH przy węglu 2' rybozy
- możliwość koordynacji kationów metali dwuwartościowych
Właściwości i pochodzenie rybozymów:
- występują w wirusach i katalizują specyficzną reakcję cięcia RNA uczestnicząc w namnażaniu się wirusa (Hammerhead, Hairpin, VS, HDV)
- występują w połączeniu z białkami, jako nukleoproteiny (RNAza P)
Zastosowanie rybozymów:
- wyciszanie genów przez specyficzne cięcie RNA
- terapia antyretrowirusowa
- leczenie chorób związanych z ekspansją trójek nukleotydowych i anomalnymi długościami transkryptu (choroba Huntingtona, dystrofia mięśniowa)
- co się stanie jeżeli wprowadzimy do organizmu nadmiar oligonukleotydów DNA - mogą reagować z innymi składnikami kom, np enzymami i zaburzać ich aktywność, mogą też stymulować wydzielanie cytokin
5. siRNA (small interfering RNA) - dwuniciowe cząsteczki RNA o długości ok. 20-25 par zasad, które powodują wyciszanie ekspresji genów o homologicznej sekwencji (interferencja RNA - RNAi). Powstają przez pocięcie dwuniciowego RNA (np. wirusowego) w komórce przez enzym Dicer na fragmenty odpowiedniej długości. Krótkie siRNA wiążą sie z kompleksem białkowym o aktywności rybonukleazy zwanym RISC. Kompleks ten wiąże się z komplementarną do siRNA cząsteczką mRNA i tnie ją na kawałki, uniemożliwiając w ten sposób powstanie kodowanego przez nią białka. Zazwyczaj - w przeciwieństwie do miRNA - sekwencja siRNA jest w 100% homologiczna z sekwencją docelowego mRNA. Rośliny (i inne organizmy eukariotyczne) wykorzystują mechanizm interferencji RNA powodowany przez siRNA do obrony przed wirusami. Ponadto sztuczne siRNA wykorzystywane są w biologii molekularnej, prowadzone są też badania nad zastosowaniem ich w medycynie.
6. W jaki sposób można dokonać korekcji zmutowanego genu, jak to działa i który sposób jest najwydajniejszy?
- za pomocą chimerycznych oligodT (70-80 nukleotydów),
- jednoniciowych fragmentów DNA (400-800 nukleotydów; najwydajniejsze, sprawność korekcyjna 1-10%, podczas gdy oligodT - 0.0002%)
- za pomocą rybozymów
7. Sposoby bezpośredniego i pośredniego niszczenia kom nowotworowych
W przypadku chorób, w których powstaniu i przebiegu bierze udział wiele różnych genów (np. chorób nowotworowych) manipulacje takie, prowadzące do korekty zmienionego patologicznego fenotypu na fenotyp prawidłowy, są trudne do przeprowadzenia. W chorobach nowotworowych wykorzystuje się raczej zabiegi polegające na wprowadzeniu do komórek nowotworowych genów, których białkowe produkty mają doprowadzić do zniszczenia komórek nowotworowych [2, 3].
W badaniach przedklinicznych oraz we wstępnych próbach klinicznych stosuje się dwa typy (rodzaje) niszczenia komórek nowotworowych: niszczenie bezpośrednie oraz tzw. niszczenie pośrednie (Ryc. 1., który przedstawia podstawowe założenia terapii genowej chorób nowotworowych).
Niszczenie bezpośrednie komórek nowotworowych polega na tym, że wprowadzony do nich gen (najczęściej pochodzenia wirusowego lub bakteryjnego) koduje enzym metabolizujący nieaktywny prolek do aktywnego leku [4]. Jest to tzw. koncepcja genów samobójczych: wprowadzone geny „uczulają” komórki nowotworowe na pewnego typu leki lub „radiouczulają” je na promieniowanie jonizujące; zob. m.in. nasze prace [5, 6].
Niszczenie pośrednie polega na tym, że wprowadzony do komórek nowotworowych gen koduje białko, tzw. białko immunomodulacyjne (najczęściej: różnego typu cytokiny), mobilizujące układ immunologiczny do swoistego niszczenia komórek nowotworowych [2, 3, 7].
W ostatnich latach pojawiła się nowa strategia dotycząca pośredniego niszczenia komórek nowotworowych, tzw. antyangiogenna terapia genowa [8]. W terapii tej wykorzystuje się geny, których ekspresja prowadzi do zahamowania angiogenezy. Przypomnijmy, że zahamowanie angiogenezy w nowotworach (ograniczenie powstawania naczyń w guzach pierwotnych i przerzutach) prowadzi do zahamowania ich wzrostu. Angiogenezie oraz białkowym inhibitorom angiogenezy poświęciliśmy odrębne artykuły [9, 10].
Metody tworzenia genetycznie zmodyfikowanych organizmów
Aby otrzymany organizm był transgeniczny, należy do niego wprowadzić kawałek DNA, który pochodzi od obcego organizmu. Nim jakiś organizm zostanie genetycznie zmieniony, transformowany, należy posiadać fragment materiału genetycznego, który pochodzi z innego organizmu. Może on zostać wycięty z większego fragmentu DNA, dzięki enzymom restrykcyjnym. Są to cząsteczki białek, które potrafią przecinać nić DNA, częstokroć czynią to w specyficznym miejscu, dzięki czemu możliwe jest wycięcie takiego fragmentu, jaki jest potrzebny.
Tak przygotowany materiał jest wprowadzany do zwierząt bądź roślin. Ten fragment najczęściej zwiera informację (koduje) cząsteczki białka, które będą wykorzystane przez organizm. Samo wprowadzenie materiału genetycznego nie jest łatwe. Metody, którymi biotechnologowie się posługują by tego dokonać bywają odmienne w odniesieniu do roślin i zwierząt, dlatego omówione zostaną osobno.
Przedstawione poniżej metody dotyczą modyfikacji roślin.
1. Metoda z wykorzystaniem wektora.
W tej metodzie, jak sama nazwa wskazuje, wykorzystuje się wektory do wprowadzenia materiału genetycznego do komórek roślinnych. Są nimi bakterie z rodzaju Rhizobium: Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes, które posiadają naturalną zdolność do wprowadzania swojego DNA do roślin. Te mikroorganizmy posiadają w swojej komórce plazmid, który zawiera zakodowaną informację o białkach niezbędnych do zaatakowania rośliny. To właśnie on wnika do komórki roślinnej, a jeden z jego fragmentów, nazwany odcinkiem T (T-DNA), integruje się z materiałem genetycznym komórki gospodarza. Naukowcy potrafią usunąć geny znajdujące się wewnątrz fragmentu T, a na ich miejsce wstawić dowolny inny fragment DNA, który może zawierać geny pochodzące z innego gatunku. Obecnie do transformacji roślin używa się plazmidów pochodzących z Agrobacterium tumefaciens.
Metoda ta ma poważne ograniczenie - można ja stosować wyłącznie do roślin dwuliściennych, ponieważ tylko one ulegają zarażeniu przez Agrobacterium. Rośliny jednoliścienne, do których należą zboża, nie mogą być transformowane tym sposobem.
2. Metody bez wykorzystania wektora.
Są to metody polegające na bezpośrednim wprowadzeniu DNA do komórek roślinnych. Pozwalają one na transformowanie dowolnych roślin. Nim fragment będzie mógł być wprowadzony do komórki gospodarza, ta musi być pozbawiona ściany komórkowej (oprócz mikrowstrzelowania). By to osiągnąć można poddać ją działaniu enzymów degradujących.
Otrzymuje się w ten sposób tzw. protoplast, którego błona komórkowa stanowi koleją barierę dla transgenu, wprowadzanego do komórek z wykorzystaniem jednej z metod, ogólnie podzielonych na fizyczne i chemiczne.
- Elektroporacja, fizyczna - polega na wykorzystaniu serii impulsów elektrycznych, które naruszają strukturę błony, powodując powstanie w niej porów, przez które DNA może przeniknąć do wnętrza komórki. Podejście to może być stosowane też przy wprowadzaniu genów do innych komórek - zwierzęcych, bakteryjnych.
- Mikrowstrzeliwanie, fizyczna - wykorzystuje mikroskopijne kulki z złota lub wolframu o średnicy 0,5 - 5 mikrometra (0,0000005-0,000005 metra). Fragmenty DNA które pragnie się wprowadzić do komórek są opłaszczane na tych kulkach, a następnie wstrzeliwane do komórek roślinnych. Używana jest do tego tzw. "armatka genowa" (ang. particle gun). Wadą metody jest niska wydajność oraz mogące wystąpić uszkodzenia komórek. Zaletą jest to iż komórki nie muszą być pozbawiane ściany komórkowej, można wprowadzać do np. do fragmentu liścia, jak i DNA może zostać wprowadzona także do chloroplastów i mitochondriów.
- Z użyciem PEG, chemiczna - polega na wykorzystaniu glikolu polietylenowego (PEG od ang. polyethylene glycol), który powoduje zwiększenie przepuszczalności błony komórkowej, poprzez prowadzenie do jej chwilowej, odwracalnej dezorganizacji. To pozwala na wniknięcie transgenu do komórek, wraz z DNA nośnikowym.
- Fuzja liposomów - tworzone są liposomy, wewnątrz których są cząsteczki DNA. Tworzy się je poprzez utworzenie podwójnej błony lipidowej na roztworze z cząsteczkami DNA i wstrząsanie nie - powstają wtedy "kuleczki" błonowe z DNA w środku. Liposomy łączą się z protoplastami komórek wprowadzając do środka DNA.
- Mikroiniekcja - polega na wprowadzeniu DNA za pomocą igły mikromanipulatora, doświadczenie wykonywanie jest przez ręcznie człowieka. Metoda praco- i czasochłonna.
Komórki macierzyste o cechach komórek embrionalnych
Polskim naukowcom pracującym na Uniwersytecie Louisville w Kentucky (USA) i współpracującym z kilkoma ośrodkami w Polsce, po raz pierwszy na świecie udało się wyizolować ze szpiku kostnego dorosłej myszy komórki macierzyste o cechach komórek embrionalnych. To odkrycie otwiera drogę do prawdziwego przełomu - regeneracji ludzkich narządów. Przeszczep narządu wyhodowanego z uzyskanych od pacjenta komórek szpiku nie niesie niebezpieczeństwa reakcji odrzuceniowej i nie jest tak kontrowersyjny pod względem etycznym.
W ostatnich latach w wielu ośrodkach na całym świecie trwają badania nad poznaniem możliwości komórek macierzystych. W związku z ich zdolnościami do podziału i samoodnowy naukowcy pokładają w nich wielkie nadzieje dotyczące odtwarzania uszkodzonych narządów. Nadzorujący przełomowe badanie prof. Mariusz Ratajczak, kierownik Ośrodka Transplantacji Uniwersyteckiego Szpitala Dziecięcego w Krakowie-Prokocimiu i jednocześnie dyrektor Programu Komórki Macierzystej w Centrum Rakowym na Uniwersytecie Stanowym w Louisville w Kentucky swoje poszukiwania ukierunkował na maleńkie (2-3-mikrometrowe) komórki szpikowe o cechach komórek embrionalnych (very small embryonic-like stem cells - VSEL), upatrując w nich przełomowych możliwości. I to okazało się kluczem do sukcesu.
"Do tej pory standardem była wiedza, z której wynikało, że komórki macierzyste ze szpiku dają wzrost w zakresie jednej tkanki, czyli że ich zdolności regeneracyjne są ograniczone. Przełom tych badań polega na tym, że wykryte zostały multipotencjalne komórki o cechach embrionalnych, tzn. komórki, z których można uzyskać praktycznie każdą tkankę potrzebną do przeszczepu. Dodatkowej wagi temu odkryciu nadaje fakt, że znaleziono je w organizmie dorosłej myszy, co daje alternatywne źródło ich pozyskiwania i zakończenie dyskusji na temat etycznej strony pozyskiwania komórek embrionalnych dla celów badawczych i leczniczych z zarodków" - mówi prof. Bogusław Machaliński z Zakładu Patologii Ogólnej Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie, którego zespół ściśle współpracował z prof. M. Ratajczakiem.
"Nasz wkład polega na sortowaniu komórek w poszczególne podfrakcje. Oprócz tego pracujemy na krwi pępowinowej, a także zbieramy krew od wytypowanych pacjentów i wszystkie te materiały wysyłamy do ostatecznej obróbki do prof. Ratajczaka" - wyjaśnia prof. B. Machaliński. W programie bierze udział także zespół prof. Michała Tendery z Kliniki Kardiologii ląskiej AM w Katowicach oraz doc. Marcin Majka i dr Jarosław Baran z CM UJ w Krakowie.
Wyjaśnione sprzeczności
Projekt realizowano od trzech lat. Badania prowadzono na modelu mysim, bardzo podobnym w zakresie komórek macierzystych do człowieka. Wyniki wskazujące na istnienie w dorosłym szpiku kilku całkowicie różnych typów komórek macierzystych, w tym niezwykle interesujących komórek VSEL, zostały opublikowane w styczniu 2004 r. na łamach prestiżowego czasopisma Leukemia (18: 29-40) należącego do grupy Nature. Udało się zidentyfikować i wyizolować komórki VSEL, określić ich cechy charakterystyczne, upodabniające je do komórek embrionalnych (budowa komórki, markery białkowe), a także wykazać, że w sytuacjach stresowych są one uwalniane ze szpiku do krwi obwodowej.
Eksperymenty Polaków wyjaśniły, dlaczego do tej pory uzyskiwano całkowicie sprzeczne rezultaty dotyczące potencjału regeneracyjnego komórek macierzystych ze szpiku. Naukowcy - nie zdając sobie z tego sprawy - pracowali na różnych typach komórek. Wyniki otrzymane przez zespół prof. M. Ratajczaka udało się już potwierdzić dwóm innym zespołom badawczym, co znacznie podniosło wiarygodność tych badań.
Bliski przełom w medycynie regeneracyjnej
12 grudnia ubiegłego roku w Atlancie, na corocznym zjeździe Amerykańskiego Towarzystwa Hematologicznego, w którym wzięło udział 25 tys. specjalistów z całego świata, prof. Mariusz Ratajczak ogłosił kolejne istotne wyniki prac nad komórkami VSEL. Udało się namnożyć je w warunkach laboratoryjnych oraz przekształcić otrzymane in vitro linie komórkowe w kilka różnych typów tkanek. Udowodniono zatem, że izolowane z dorosłego szpiku komórki VSEL są nie tylko fizycznie podobne do macierzystych komórek embrionalnych, ale także wykazują podobną plastyczność i aktywność biologiczną.
Obecnie Polacy prowadzą badania, które mają potwierdzić uzyskane na myszach wyniki również w organizmie człowieka. Rezultatów tych badań można się spodziewać już nawet za kilka tygodni. Jeżeli okażą się zgodne z przewidywaniami, będzie to prawdziwy przełom w medycynie regeneracyjnej. "Umiejętność izolowania komórek macierzystych o cechach embrionalnych da nam narzędzie do leczenia wielu chorób cywilizacyjnych, począwszy od udarów mózgu, choroby Parkinsona, poprzez uszkodzenia mięśnia sercowego na skutek zawału, uszkodzenia trzustki w przebiegu cukrzycy, a nawet urazy kręgosłupa czy dystrofie mięśniowe. I to naprawdę brzmi bardzo realnie - cieszy się prof. B. Machaliński. - Następnym etapem badań będzie odkrycie mechanizmów różnicujących. Chcemy zgłębić, jak to się dzieje, że mając populację komórek, możemy je ukierunkować na tworzenie poszczególnych narządów. Musimy dowiedzieć się, jakie geny, jakie enzymy za to odpowiadają. Wciąż jeszcze dużo jest do zrobienia".
Co dalej z iPS?
Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS, ang. induced pluripotent stem cells) stały się przebojem ostatnich miesięcy na polu badań nad komórkami macierzystymi. Ostatnie osiągnięcia potwierdzają skuteczność indukcji pluripotencji w różnych typach komórek somatycznych, a także potencjał komórek iPS jako narzędzia badawczego i terapeutycznego.
Pluripotencjalność to cecha komórki oznaczająca jej zdolność do różnicowania we wszystkie typy komórek dorosłego organizmu. Tak ogromny potencjał posiadają w naturze tylko komórki wczesnego stadium zarodkowego - blastocysty (dokładniej tzw. wewnętrznej masy komórkowej, inaczej węzła zarodkowego). To właśnie takie komórki, wyizolowane i hodowane in vitro, znamy jako zarodkowe komórki macierzyste.
Otrzymywanie komórek macierzystych z zarodków, nawet w tak wczesnym stadium, jak blastocysta, budzi szereg kontrowersji. Pluripotencjalne komórki są jednak bardzo cenne - mogą stanowić narzędzie badań nad chorobami genetycznymi, pomagać w testowaniu nowych leków, a także stanowią potencjalne narzędzie terapeutyczne, w związku z ich umiejętnością różnicowania w różne typy komórek. Pozwalają też na badania wczesnych procesów rozwojowych, w tym przemian zachodzących na poziomie samej komórki i jej DNA.
To dzięki temu ostatniemu zastosowaniu, badaniom podstawowym genetyki zarodkowych komórek macierzystych, udało się poznać geny odpowiedzialne za ich pluripotencjalność, jak również te kierujące ich różnicowaniem.
Przełomem było udane reprogramowanie komórek skóry, fibroblastów, do komórek pluripotencjalnych, z wykorzystaniem zaledwie czterech z wielu poznanych czynników odpowiedzialnych za pluripotencjalność [1, 2, 3]. Dokonał tego zespół japońskiego naukowca Shinyi Yamanaki: po raz pierwszy w 2006 roku na komórkach mysich [1], w roku 2007 natomiast na ludzkich fibroblastach [2]. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), bo tak je nazwano, przypominają zarodkowe komórki macierzyste nie tylko morfologicznie, ale także pod względem szeregu cech charakterystycznych dotąd tylko dla tych drugich. Co najistotniejsze, wykazują pluripotencjalność i w warunkach in vitro mogą różnicować do różnych typów komórek występujących w dorosłym organizmie. (Por. Pluripotencjalne, lecz nie zarodkowe?)
Osiągnięcia ta pociągnęły za sobą lawinę kolejnych badań. W tym samym czasie co grupa Yamanaki uzyskanie ludzkich komórek pluripotencjalnych z fibroblastów ogłosił zespół Thomsona, używając innego zestawu czynników [3]. Kolejne publikacje przyniosły potwierdzenie skuteczności stosowanych metod [4-7], a nawet pokazały potencjalne możliwości terapeutycznego zastosowania komórek iPS [6]. Wiele zespołów, w tym znów grupa Yamanaki, dokonało udanych prób reprogramowania innych, bardziej zaawansowanych na ścieżkach różnicowania, komórek [8, 9]. I tak udało się uzyskać komórki pluripotencjalne z komórek epitelium żołądka [8], z hepatocytów (komórki wątroby) [8], a nawet limfocytów B [9].
Rodzi się pytanie, dlaczego iPS wydają się tak atrakcyjnym narzędziem, skoro potrafimy już uzyskiwać zarodkowe komórki macierzyste o tym samym potencjale. Istnieje szereg powodów, z których najszerzej dyskutowany to zapewne kwestie etyczne, dokładniej fakt, że uzyskiwanie komórek pluripotencjalnych ze zwykłych komórek somatycznych za pomocą opisywanej metody nie wymaga w ogóle używania zarodka w procedurze. Ale to nie jedyna zaleta.
Z punktu widzenia ewentualnej terapii najważniejszy jest fakt, że uzyskać można komórki autologiczne dla pacjenta. Prosta biopsja skóry dostarczy nam bowiem komórek, z których wyprowadzić możemy komórki identyczne genotypowo (i po ewentualnym różnicowaniu także fenotypowo) z komórkami pacjenta. Takie komórki nie będą rozpoznawane przez układ odpornościowy jako obce, a zatem nie dojdzie do ich odrzucenia po przeszczepieniu i nie będzie potrzeby stosowania środków immunosupresyjnych.
Jest to wyzwanie, z którym badacze zarodkowych komórek macierzystych próbują sobie poradzić za pomocą klonowania terapeutycznego, wykorzystującego technikę transferu jądra somatycznego (SCNT, ang. somatic cell nuclear transfer) w celu uzyskania komórek zarodkowych identycznych z komórkami dawcy (pacjenta). Trzeba zaznaczyć, że klonowanie terapeutyczne również zanotowało w ostatnim czasie kilka znaczących sukcesów na swoim koncie. Jesienią 2007 roku doniesiono o uzyskaniu techniką transferu jądra somatycznego zarodkowych komórek macierzystych naczelnych [11]. W 2008 już roku dowiedziono m.in., że linie zarodkowych komórek macierzystych uzyskać można z pojedynczych blastomerów, pobieranych w jeszcze wcześniejszym stadium rozwoju zarodka niż blastocysta. Co ważne, zarodki takie mogły się dalej prawidłowo rozwijać. [12] (Por. Komórki embrionalne uzyskane bez niszczenia zarodków) Z innych ciekawych osiągnięć, udało się także, poprzez klonowanie terapeutyczne i następne różnicowanie, uzyskać autologiczne komórki nerwowe, które z powodzeniem zastosowano w mysim modelu choroby Parkinsona [13]. (Por. Klonowanie terapeutyczne skuteczne w mysim modelu choroby Parkinsona)
Za ostatecznym zastosowaniem iPS zamiast komórek zarodkowych przemawia stosunkowa prostota metodyki ich otrzymywania, jak również istotne dla wielu, wspomniane już kwestie etyczne. iPS muszą jednak pokonać szereg przeszkód, nim ich praktyczne zastosowanie stanie się czymś powszechnym. Faktem jest, że możliwe jest ich różnicowanie i modyfikacja w celu użycia w terapii. Należy jednak zauważyć, że wciąż długi jest czas trwania procedury oraz czas potrzebny, aby otrzymać wystarczającą ilość komórek, powstających z dość niską wydajnością [10]. Kolejnym minusem jest możliwość zaburzenia funkcji komórek przez integrujące z jej genomem retrowirusy - wektory powszechnie stosowane do wprowadzania wspomnianych czynników pluripotencji do reprogramowanych komórek. Prowadzić to może np. do ich rakowacenia. Być może rozwiązaniem stanie się zastosowanie innych wektorów, wprowadzanie gotowych białek czynników zamiast ich genów [15] czy też chemiczna indukcja odpowiednich endogennych czynników [10]. Z niemałą ostrożnością podchodzono także do stosowania potencjalnego onkogoenu c-Myc pośród używanych czynników, wykazano jednak, że możliwa jest indukcja pluripotencji bez jego wykorzystania [4].
Możliwość uzyskania komórek od dowolnego człowieka czyni iPS atrakcyjnym narzędziem również na polu badań przeróżnych schorzeń, w tym chorób genetycznych. Potwierdzono to, uzyskując iPS z biopsji skóry 8 pacjentów z różnymi schorzeniami genetycznymi. [14]
Przyszłość iPS rysuje się optymistycznie, zważywszy na żywe zainteresowanie środowiska naukowego. I choć początkowy entuzjazm zapewne z czasem przygaśnie, to spodziewać się możemy jeszcze niejednego ciekawego odkrycia. Pozostaje mieć nadzieję, że któreś z nich pozwoli nam wreszcie okiełznać potencjał komórek pluripotencjalnych i wykorzystać je w medycynie.