Biologia molekularna 7.05.11
Struktura i działanie
Całe RNA
↙ ↘
RNA kodujący RNA niekodujący
↓ ↙ ↙ ↙ ↓ ↓ ↘
pre- mRNA pre-tRNA pre- rRNA sinRNA snoRNA scRNA inRNA
↓ ↓ ↓ oraz różne inne
mRNA tRNA rRNA
snRNa biorą udział w dojrzewaniu innych cząsteczek RNA, często tworzy kompleksy z białkami (snRNP)
snoRNA- mały jąderkowy, bierze udział w dojrzewaniu innych RNA
tmRNA (transportuje informacje)- przypina etykietki peptydowe do białek nieprawidłowo zsyntetyzowanych, wyznacza je do degradacji
rRNA- rybosomalny (80% całego RNA)
tRNA- transportujący, bierze udział w syntezie
hnRNA- heterogenny, jądrowy
Tylko jedna nić dla danego genu jest transkrybowana (nić sensowna)- kierunek translacji 5'-3', gdy druga nić nonsensowna
Geny są na obu niciach….
Polimeraza RNA I- znajduje się w jąderku, odpowiada za syntezę większości prekursorów rRNA
Polimeraza RNA II- znajduje się w nuklepolazmie, odpowiada za syntezę prekursorów mRNA i niektórych małych jąderkowych RNA
Polimeraza RNA III- znajduje się w nukleoplazmie, odpowiada za syntezę prekursorów 5S rRNA, tRNA i innych małych jąderkowych i cytoplazmatycznych RNA
Polimerazy wiążą się z mniejszym rowkiem, a strukturą rozpoznającą jest β-harmonijka.
Charakterystyczne/…….
Enhancery- wzmacniacze transkrypcji, hiperacetylacja N-końców histonów
Silencery- wyciszacze transkrypcji, deacetylacja N-końców histonów
Metylacja DNA hamuje transkrypcję genów. Metylowana jest cytozyna dzięki metylotransferazie DNA w niektórych sekwencjach 5'CG3' (wyspy CpG)- przykład chromatyny nieaktywnej transkrypcyjnie: ciałko Barra.
CPSF- czynnik specyficzności cięcia i poliadenylacji
CstF- czynnik stymulacji cięcia
PAP- polimeraza Poli(A), polimeraza RNA niezależna od DNA
Geny HOUSEKEEPING- utrzymujące porządek w domu
Nie podlegają regulacji
Nie zawierają sekwencji TATA, tylko ok. 30pz obszar bogaty w GC i zawierają miejsca wiązania dla czynnika transkrypcyjnego
Wyspy CpG, w pobliżu których się znajdują kiedy nie są etylowane
Należą tu geny kodujące białka rybosomalne, enzymy cyklu Krebsa
Elongacja
Czynnik elongacyjny |
funkcja |
P-TEFb TFTIS |
Przeciwdziałają pauzowaniu polimerazy RNAIII, która może nastąpić wówczas, gdy enzym przeprowadza transkrypcję regionu, gdzie kompatybilne zasady mogą łączyć się ze sobą w obrębie jednej nici |
ELL TFIT Elongine |
Zapobiegają zatrzymywaniu się polimerazy RNA, która następuje wówczas, gdy polimeraza RNA przedwcześnie uwalnia koniec 3' transkrypcyjny, co może być skutkiem pauzowania |
TERMINACJA:
Polimeraza I- udział białek typu Reblp/TF-1 i PIRF (czynnik uwalniający polimerazę i transkrypt)
Polimeraza II- ciąg reszt Da np. dla genu 5S reszt (????)
Homeodomena- przykład domeny typu helisa-skrypt- helisa (HTH)
Czynniki transkrypcyjne składają się z domeny wiążącej (rozpoznającej) DNA oraz….
Zazwyczaj α-helisa jest domeną rozpoznającą
Przeważnie oddziałują z większym rowkiem
Wyjątek: domena TBP
Niektóre czynniki transkrypcyjne mogą tworzyć dimery, mogą powstawać różne rodzaje homodimerów.
Introny mogą ulegać samo wycinaniu- jest to przykład enzymu RNA, czyli rybozymu (introny w rRNA….., w genomie mitochondrialnym i chloroplastowym w pre-mRNA i rRNA)
Rybozym- cząsteczka RNA wykonująca funkcje katalityczne
Splicing
Wycinanie różnych fragmentów i powstają różne efekty końcowe, czyli białka. Umożliwia zaoszczędzenie miejsca w genomie.
AMPLIFIKACJA
Enzymy i białka biorące udział w replikacji:
Polimeraza DNA
Helikaza DNA
Topoizomerazy
Białka destabilizujące heliks
Synteza DnA rozpoczyna się od starterów RNA
Tm- temperatura w której 50% cząsteczek posiada przyłączone startery
Ta niższa od Tm o 5-10 ͦC
Termostabilne polimerazy DNA są wyszukiwane przez izolację i klonowane. Są również mutanty charakteryzujące się odmiennymi właściwościami, odmiana polimerazy Vent, która nie posiada aktywności egzoimzomerazy 3'-5'
Polimeraza |
Aktywność |
Źródło |
Taq |
- |
Thermus aquaticus T1/2 w 95 ͦC - 1,6h |
Pfm |
+ |
Pyroceus furiosus |
Vent |
+ |
|
Termo stabilne polimerazy charakteryzują się dużą częstością błędu. Polimerazy nie posiadające egzonukleazy 3'-5' charakteryzują się większym błędem.
PCR- rozwiązywanie problemów metodycznych
Brak produktu PCR lub jego małe stężenie
Sekwencje startera
Sprawdź komplementarność startera względem matrycy
Starter powinien mieć zbliżoną Tm
Sprawdź możliwość tworzenia struktur szpilki do włosów w sekwencji startera
Unikać komplementarności sekwencji startera na 3'
Stężenie substratów
Optymalne 0,1-0,5 mM
Zmniejszyc stężenie
Jakość ekstraktu
Inhibitory tj, DMSO, heparyna, EDTA, zalecana precypitacja etanolem
Pary GC w matrycy
Jeśli matryca zawiera >50% GC należy użyć….
Stężenie matrycy
By uzyskać produkt po 25-30 cyklach PCR należy zastosować (?) 104 kopie DNA
Za dużo powoduje inhibicję PCR
Stężenie Mg2+- wiązane przez startery, matrycę, polimerazę i DTP- dokładnośc reakcji PCR jest proporcjonalna do stężenia wolnych jonów Mg, zastosowanie stężenia przewyższającego stężenie dNTP zwiększa dokładność polimerazy. Zalecana jest optymalizacja stężenia
Temperatura anilingu
Wartość kalkulacyjna
Optymalizacja: zacząć od 5 ͦ C
Profil termiczny
Za krótki czas denaturacji
Nieprecyzyjny produkt PCR
Sekwencja starterów
Stężenie starterów
Obniżyć stężenie
Zweryfikować stężenie wyjściowe
Jakość ekstraktu
Możliwa kontaminacja egzogennym DNA
Stężenie Mg2+
Obniżyć stężenie
Profil termiczny
Zwiększyć temperaturę przyłączania starterów
Zredukować czas przyłączania starterów
Zredukować liczbe cykli
Zastosować metodę „hot-start”
Aktywność polimerazy
Za duzo jednostek
Ważne w reakcji PCR:
Jakość i czystość odczynników
Czystość podczas pracy- sterylne końcówki
Fizyczne oddzielenie amplifikacji i izolacji
Dokładność opisu próbek (pomyłki podczas izolacji)
Błędy podczas rozpipetowania matrycy do probówek reakcyjnych
Błędne rozcieńczenie matrycy
Błędy w protokole