Enzym restrykcyjny używany na ćwiczeniach:

Pfo I - pierwsza litera od nazwy rodzajowej drobnoustroju - Pseudomonas; dwie kolejne od nazwy gatunkowej drobnoustroju - fluorescens; cyfra rzymska oznaczająca, jako który enzym został wyizolowany z danego szczepu - I (pierwszy enzym wyizolowany z P. fluorescens)

Absorbancja a czystość wyizolowanego DNA

OD - gęstość optyczna

Jeżeli A=1 to: c=50 μg/ml dsDNA

c=36 μg/ml ssDNA

c=40 μg/ml RNA

c=30 μg/ml oligonukleotydów

260/280 - zanieczyszczenie preparatu białkami (wartość prawidłowa 1,8-2,0)

Jeżeli próbka DNA zanieczyszczona jest RNA to wartość A260/A280 jest bliższa 2,0, natomiast, jeżeli próbka zanieczyszczona jest białkami to wartość A260/A280 jest niższa niż 1,8.

Absorpcja mierzona przy długości fali 230 odzwierciedla zanieczyszczenia pochodzące od węglowodorów, białek lub fenolu. W przypadku czystych próbek wartość A260/A230 powinna wynosić 2,2. Absorpcja mierzona przy długości fali 325 nm może być wyznacznikiem wytrąceń w roztworze lub zanieczyszczeń samej kuwety

A260/A240 - zanieczyszczenie solami x<1,4 [znalezione na anglojęzycznej stronie]

A260/A230 - zanieczyszczenie zw. organicznymi

A320 - drobiny komórkowe (tło?)

Podział enzymów restrykcyjnych

Cztery typy, stosujemy II, IIs i IV

Izoschizomery - enzym x rozpoznaje i tnie sekwencję w tym samym miejscu, co prototyp

Neoschizomery - enzym x rozpoznaje tą samą sekwencję, co prototyp, ale tnie ją w innym miejscu

Prototyp - enzym restrykcyjny o określonych parametrach cięcia wyizolowany jako pierwszy

Enzym x pochodzi z innego drobnoustroju niż prototyp

Odpowiedzi z artykułów:

Różnice pomiędzy strategią antysensowną a antygenową

Strategia antygenowa, polegająca na oddziaływaniu ASO z komplementarnym fragmentem dwuniciowej cząsteczki DNA i zahamowaniu powstawania transkryptu mRNA.

Strategia antysensowa, zazwyczaj stosowana do zahamowania translacji zsyntetyzowanego już mRNA.

Odpowiedzi z wykładów:

Białka biorące udział w replikacji DNA:

Topoizomerazy - powodują relaksację superhelikalnego DNA

Gyrazy DNA - wprowadzają ujemne skręty superhelikalne

Helikazy - rozplatają podwójną helisę

Prymazy - syntetyzują startowy odcinek RNA

SSB - stabilizują rejony jednoniciowe

Polimerazy DNA - syntetyzują DNA, usuwają błędne nukleotydy

Ligazy - łączą końce DNA

Przykłady mutacji dynamicznych i choroby

Nie wiem co ona tu chce więc opis + choroby z konkretnymi sekwencjami jakie się powtarzają

Mutacje dynamiczne - zwielokrotnienie sekwencji trójnukleotydowych w obrębie genów; często w obrębie sekwencji mikrosatelitarnych; prawdopodobna przyczyna to ślizganie się polimerazy; mutacje w niestabilnych sekwencjach DNA (czyli powtarzających się)

• Choroba Huntingtona CAG

• Bezład rdzeniowo-móżdżkowy CAG

• Dystrofia miotoniczna CTG

• Zespół kruchego chromosomu X CGG

Enzymy uczestniczące w naprawie bezpośredniej DNA

Ligaza DNA - usuwa pęknięcia jednej nici DNA

Alkilotransferaza - usuwa grupy alkilowe

Fotoliaza DNA - usuwa dimery cyklobutylowe

Naprawa pęknięć dwuniciwych

• HR - rekombinacja homologiczna = naprawa rekombinacyjna - pozwala na naprawę uszkodzeń występujących na obu niciach, niebezpieczna dla genomu bo brak matrycy umożliwiającej odtworzenie zmienionego fragmentu (masło maślane!! )

• NHEJ =Łączenie niehomologicznych końców DNA; (uczestniczy ligaza DNA IV i kompleks białkowy: białko Ku, białko XRCC4, kinaza białkowa DNA-PK_CS); ryzyko połączenia niewłaściwych cząst. DNA; kilkunukleotydowa delecja

Jakie znasz metody naprawy DNA

• Rekombinacja homologiczna = naprawa rekombinacyjna

• Naprawa typu BER (glikozydaza przecina wiązanie glikozydowe, usuwa uszkodzoną zasadę tworząc miejsce AP, które rozpoznaje endonukleaza i przecina wiąz. fosfodiestrowe, polimeraza wypełnia lukę a ligaza łączy nić odtwarzając wiąz. fosfodiestrowe) alkilowe i hydroksylowe modyfikacje zasad

• Naprawa typu NER - poprzez wycinanie uszkodzonych nukleotydów (usuwa duże uszkodzenia; zniekształca strukturę helisy) foto-uszkodzenia, addukty DNA, wiązania sieciujące

• MMR - naprawa błędnie sparowanych nukleotydów (rozpoznają je białka hMLH i hMSH2 u eukariota i Mut-S, Mut-H i Mut-L u prokariota; helikaza, egzonukleaza, polimeraza, ligaza)

Dekatenacja - rozdielenie cząsteczek nowo powstałego DNA z udziałem topoizomerazy; zachodzi podczas terminacji replikacji

snRNA - rola w wycinaniu intronów

wymień czynniki transkrypcyjne u prokariota

wymienić klasy enzymów transkrypcyjnych eukariota

		Prokariota	Eukariota
Transkrypcja	Inicjacja	Czynnik sigma - odpowiada za specyficzność wiązania	GTF - ogólne czynniki transkypcyjne: TFII A, B, D, E, F, H STF - specyficzne czynniki transkrypcyjne LXR, SREBP
		Elongacja		S2
		Terminacja	Czynnik rho
	Translacja	inicjacja	IF1, IF2, IF3	eIF 1-6
Enzymy
transkrypcja		Polimeraza RNA	Polimeraza I RNA - rRNA polimeraza II RNA - mRNA, snRNA Polimeraza III RNA - tRNA, rRNA, małe jąderkowe RNA

Nić matrycowa, niekodująca, nonsensowna DNA

mRNA komplementarne do nici matrycowej DNA a identyczne z nicią kodującą

nić kodująca, sensowna DNA

budowa polimerazy

u prokariota - cztery podjednostki z których dwie są identyczne a, a, b, b`

u eukariota - trzy typy; posiadają co najmniej 10 podjednostek, duży rozmiar

wymień metody hybrydyzacji:

Southern Blotting - służy do lokalizacji konkretnej sekwencji DNA po elektroforezie. Na drodze dyfuzji DNA przenoszone jest z żelu na membranę nitrocelulozowa lub nylonową. Inkubuje się ją ze znakowanymi izotopowo sondami komplementarnymi z poszukiwanym fragmentem, który następnie uwidacznia się na zdjęciu rentgenowskim. 
Northern Blotting - czyli elektroforetyczno - hybrydyzacyjna detekcja transkryptów. Służy do poszukiwania sekwencji RNA i badania aktywności pojedynczych genów. Wykorzystuje się w niej sondy DNA wyznakowane radioaktywnie. 

Western blotting - do białek
DNA fingerprinting, czyli metoda genetycznych odcisków palców - wyizolowane DNA trawi się odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, a następnie poddaje elektroforezie i przenosi na filtr nitrocelulozowy, gdzie łączą się z radioaktywnie wyznakowanymi sondami. W ten sposób otrzymuje się „genetyczne odciski palców”, czyli charakterystyczny dla danego osobnika układ pasków DNA. 
Hybrydyzacja in situ (ang. in situ hybridization ISH) 
Z łac. in situ - w miejscu naturalnego występowania. Znakowany polipeptyd tworzy hybrydę z komplementarnymi sekwencjami znajdującego się w komórce kwasu nukleinowego. Metoda ta pozwala wykryć poszukiwaną sekwencję oraz zlokalizować jej położenie w komórce i na chromosomie. Wykonuje się ją bezpośrednio na szkiełku podstawowym po uprzedniej denaturacji DNA chromosomowego oraz sondy dla uzyskania form jednoniciowych (wysoka temperatura, formamid). Preparat oczyszcza się z białek, a w przypadku stosowania sond DNA należy również uprzednio strawić go RNazą. Niezhybrydyzowane lub słabo zhybrydyzowane fragmenty zostają wypłukane przed uwidocznieniem.

W jaki sposób może wiązać się czynnik transkrypcyjny z DNA (motywy białkowe)

Klasyfikacja białek wiążących DNA

• ze względu na domeny wiążące DNA

• HTH (helisa-skręt-helisa)

• Palce cynkowe

• Ze względu na domeny dimeryzacji

• HLH (helisa-pętla-helisa)

• Zamek leucynowy

Farmakogenetyka - badanie wpływu pojedynczego genu na odpowiedź organizmu na lek, obejmującą skuteczność, bezpieczeństwo oraz interakcje między lekami

Farmakogenomika - badanie genetycznej zmienności odpowiedzi na lek będącej wynikiem zróżnicowanej ekspresji wielu genów w kom poszczególnych tk

Metabolizm leków

Enzymy I fazy: członkowie superrodziny ludzkiego chromosomu p450 (CYP); esterazy; hydrolaza epoksydu

Enzymy II fazy: N-acetylotransferaza NAT1 i NAT2; glukuronylotransferaza UGT; hydrolaza epoksydu; S-transferaza glutationu GST; sulfotransferaza ST; metylotransferazy COMT

Blokowanie replikacji poprzez tworzenie połączenia pomiędzy dwoma niciami DNA lub dodanie dużych grup alkilowych uniemożliwiających postęp replikacji. Związki dołączające grupy alkilowe (najczęściej do guaniny):

• Metanosulfonian metylowy MMS

• Metanosulfonian etylowy EMS

• Dimetylonitrozoamina

Terapeutyczne zastosowania strategii antysensu 102-119

• leki antysensowne oddziałują z mRNA lub genem kodującym dane białko

• hybrydyzacja ASO (antysensowny oligonukleotyd - krótki, jednoniciowy fragment kwasów nukleinowych) do komplementarnego DNA lub RNA hamuje replikację/transkrypcję/translację

• Strategia antygenowa, polegająca na oddziaływaniu ASO z komplementarnym fragmentem dwuniciowej cząsteczki DNA i zahamowaniu powstawania transkryptu mRNA. Dzieje się to poprzez stabilizację trypleksu ASO/DNA przez wiązania wodorowe między zasadami trzeciej nici a zasadami purynowymi dwuniciowej cząsteczki DNA, tzw. wiązania Hoogstena. Utworzony trypleks może inhibować proces transkrypcji w zależności od miejsca hybrydyzacji poprzez uniemożliwienie tworzenia się kompleksu inicjującego DNA-polimeraza lub przez zablokowanie odczytu informacji DNA

• Strategia antysensowa, zazwyczaj stosowana do zahamowania translacji zsyntetyzowanego już mRNA. W tym przypadku ASO przyłącza się do komplementarnego fragmentu mRNA, tworząc dupleks z mRNA za pomocą wiązań typu Watsona-Cricka. W ten sposób dochodzi do zablokowania dostępu rybosomu do informacji zakodowanej w mRNA. Dupleks DNA/mRNA może również aktywować działanie endogennego enzymu, RNazy H, która przecina mRNA, uniemożliwiając w ten sposób proces biosyntezy białka przez degradację matrycy.

• Strategia rybozymowa, w której ASO stosowane są jako syntetyczne rybozymy - katalityczne oligonukleotydy degradujące RNA. Skutkiem ich działania jest eliminacja lub ograniczenie populacji cząsteczek RNA niepożądanych w komórce. Strategia degradacji RNA jest ukierunkowana głównie na geny kodujące białka onkogenne, czynniki wzrostu, receptory powierzchniowe oraz na cząsteczki przekazujące sygnały komórkowe. Także wirusowe RNA stanowią potencjalne sekwencje docelowe

• Strategia aptamerowa, która wykorzystuje krótkie fragmenty kwasów nukleinowych (uzyskiwane drogą selekcji in vitro), wykazujące wysokie powinowactwo i specyficzność wiązania ze ściśle określonymi biomolekułami. Określenie aptamer pochodzi od łacińskiego słowa „aptus”, co oznacza „pasować”. Aptamery mogą pełnić rolę inhibitorów białek, których funkcją jest rozpoznawanie i oddziaływanie z kwasami nukleinowymi (np. polimeraz wirusowych), jak i białek, które w warunkach fizjologicznych z RNA nie oddziałują. Mogą również pełnić funkcje katalityczne czy też rolę ligandów wiążących inne molekuły, takie jak aminokwasy, nukleotydy, antybiotyki czy witaminy. Do tej pory uzyskano bardzo wiele aptamerów wobec całego szeregu molekuł, począwszy od małych nieorganicznych cząsteczek, a skończywszy na organizmach jednokomórkowych.

• Dotyczy głównie onkologii, angioplastyki naczyń wieńcowych, chorób neurologicznych, wirusowych i pasożytniczych

Faza	Nazwa leku	Na co lek
III	DNA G3139 Oblimersen sodu	Hamuje aktywność białka antyapoptycznego Bcl-2; komórki nowotworowe są bardziej podatne na chemioterapię
I	OGX-011	Obniża aktywność klasteryny hamując jej translację (jest zła bo hamuje Bax które każe kom nowotworowym się zabić); zwiększa efektywność chemioterapii
I odbytnica trzustka czerniak /II mózg	AP 12009	Hamuje ekspresję genu kodującego czynnik wzrostu nowotworu TGF-beta2 (eksplozyjny wzrost guza, przerzuty, ochronna warstwa przed ukł immun); rozbicie warstwy ochronnej guza - ukł immun zjada guz, hamowanie przerzutów
I	VRX496	HIV; blokowanie replikacji wirusa lub zablokowanie ekspresji niektórych genów w zakażonych kom
II	ISIS 301012	Inhibicja ApoB (każe LDL iść do tętnic i jest zły cholesterol); obniżenie poziomu LDL
II	ATL 1102	Stwardnienie rozsiane; inhibicja VLA-4 hamuje wnikanie leukocytów do ukł nerwowego; zatrzymanie rozwoju choroby
przedkliniczne	ATL 103	Hamuje ekspresję receptora hormonu wzrostu -> obniża poziom hormonu wzrostu we krwi

---