OCENA JAKOŚCIOWA I ILOŚCIOWA PREPARATÓW DNA I RNA. TECHNIKI ELEKTROFORETYCZNE.

Stężenia DNA i RNA można określić dwoma sposobami:

1. pomiar absorpcji światła UV

2. wybarwienie preparatu bromkiem etydyny, wykonanie elektroforezy w żelu agarozowym / poliakryloamidowym i porównanie fluorescencji z preparatem o znanym stężeniu

Pomiar absorbancji UV

Do pomiaru absorbancji preparaty muszą być rozcieńczone (najczęściej 100 razy, wodą lub buforem TBE). Wartości absorbancji odczytuje się przy 260, 280 i 320 nm lub wykonuje się widmo w zakresie 200-350 nm.

Przy podanych długościach fali absorbują następujące substancje:

• 260 nm - DNA i RNA

• 280 nm - białka

• 320 nm - tło i zanieczyszczenia

Absorbancja przy 260 nm jest równa 1 dla:

• dwuniciowego DNA (dsDNA) o stężeniu 50 µg/ml

• jednoniciowego DNA (ssDNA) o stężeniu 33 µg/ml

• RNA o stężeniu 40 µg/ml

Różnice w absorbancji są wynikiem różnic w strukturze. Najwięcej światła absorbują wolne zasady, potem jednoniciowy DNA i RNA, a najmniej dwuniciowy DNA.

Absorbancja przy 260nm dla stężenia 1 mg/ml wynosi:

• 20 dla dwuniciowego DNA

• 25 dla jednoniciowego DNA i RNA

Stężenie dsDNA oblicza się wg wzoru:

C (µg/ml) = (A₂₆₀ - A₃₂₀) x 50 x rozcieńczenie

Stężenie ssDNA oblicza się wg wzoru:

C (µg/ml) = (A₂₆₀ - A₃₂₀) x 33 x rozcieńczenie

Stężenie RNA oblicza się wg wzoru:

C (µg/ml) = (A₂₆₀ - A₃₂₀) x 40 x rozcieńczenie

Stosunek wartości absorpcji A₂₆₀ do A₂₈₀ świadczy o zanieczyszczeniu preparatu kwasów białkami. Wartość A₂₆₀/A₂₈₀ w granicach 1,8-2,0 oznacza, że preparaty są wystarczająco oczyszczone, natomiast wartość 1,5 mówi nam, że w preparacie znajduje się 50% białka.

Z kolei wartość 2,0 jest charakterystyczna dla RNA, więc wartości powyżej 1,8 mówią o zanieczyszczeniu próbki DNA właśnie tym kwasem.

[Wychodzi na to, że granica 1,8-2,0 odnosi się ogólnie zarówno do DNA, jak i RNA]

Wartość absorbancji przy 320 nm trzeba odjąć od absorbancji przy 260 nm celem uwzględnienia wartości tła.

Wzór na współczynnik A260/A280 wynosi w takim wypadku:

Elektroforeza

Druga metoda oceny ilościowej polega na porównaniu próbki po elektroforezie w żelu z preparatem o znanym stężeniu. Jest metoda z wyboru w przypadku bardzo małych ilości i objętości preparatów DNA. W odróżnieniu od pomiarów UV, można za jej pomocą określić także jakość preparatów.

• DNA

W celu oceny jakości i ilości DNA stosuje się najczęściej 0,8% żel agarozowy zawierający 0,5 µg/µl bromku etydyny w buforze TBE (Tris, kwas borowy, EDTA) i nakłada się 0,5; 1,0 i 5,0 µg preparatu o znanym stężeniu i preparaty do oszacowania w buforze obciążającym (zawiera fikol, błękit bromofenolowy, cyjanoksylen). Elektroforezę prowadzi się 2 godziny przy napięciu 70V. Po elektroforezie jakość ocenia się na transiluminatorze przy fali 312 nm.

Jeżeli występuje jeden, zwarty prążek świecący na różowo/pomarańczowo - oznacza to, że DNA jest wysokocząsteczkowy, wysokiej jakości. Jeśli natomiast obserwujemy smugę (tzw. smear), to DNA jest zdegradowany.

• RNA

W przypadku RNA elektroforezę należy prowadzić w 1,0% lub 1,5% żelu agarozowym, w warunkach denaturujących w obecności bromku etydyny, przez 2 godziny przy napięciu 70V. Obserwuje się dwie dobrze widoczne frakcje RNA o różnych gęstościach 18S i 28S (28S świeci 2 x silniej od 18S). Świadczy to o niewystąpieniu degradacji. Na żelu może być obecna smuga mRNA oraz frakcja migrująca jako pierwsza (tRNA i niskocząsteczkowy RNA). Nie powinien być widoczny prążek DNA.

Do oceny czystości oligonukleotydów można także wykorzystać elektroforezę na żelu poliakryloamidowym albo HPLC.

Techniki elektroforetyczne pozwalają osiągnąć bardzo wysoki poziom rozdzielczości. Termin elektroforeza stosuje się do określenia ruchu jonów i naładowanych cząsteczek w polu elektrycznym. Elektroforeza jest zjawiskiem elektrokinetycznym, w którym pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego przemieszczają się makrocząsteczki obdarzone niezrównoważonym ładunkiem elektrycznym. Szybkość ruchu zależy od ładunku, wielkości, kształtu oraz oporów ruchu środowiska.

Przyłożenie pola elektrycznego do wodnego roztworu elektrolitu zawierającego makrocząsteczki obdarzone niezrównoważonym ładunkiem elektrycznym (makrojony) powoduje ruch jonów zarówno elektrolitu, jak i makrojonów, w kierunku elektrod o przeciwnym znaku ładunku elektrycznego.

W środowisku wodnym jony i makrojony występują w postaci uwodnionej, co oznacza, że posiadają otoczkę hydratacyjną, której właściwości zależą zarówno od rozmiaru jonu i zgromadzonego na nim niezrównoważonego ładunku elektrycz­nego, jak i od właściwości elektrolitu, tj. jego siły jonowej oraz wartości pH. Siła jonowa jest funkcją stężenia jonów komponujących elektrolit (bufor), a jej wartość definiuje się jako połowę sumy iloczynów stężeń molowych i kwadratu wartościo­wości wszystkich jonów znajdujących się w roztworze. Przewodnictwo elektryczne elektrolitu zależy od siły jonowej, stąd niezmiernej wagi nabiera odpowiedni skład elektrolitów przeznaczonych do elektroforezy. Przy zbyt wysokim stężeniu jonów następuje ograniczenie ich ruchliwości, przy zbyt niskim można zaobserwować niedobór nośników ładunku elektrycznego i związany z tym wzrost oporności elektrycznej.

Wartość pH, będąca miarą stężenia jonów wodorowych w elektrolicie, ma szcze­gólnie istotne znaczenie w odniesieniu do białek i peptydów. Białka i peptydy mają własności amfoteryczne (dwufunkcyjne) - są obdarzone wypadkowym ładunkiem elektrycznym dodatnim lub ujemnym w zależności od warunków środowiskowych. Ponieważ kwasy nukleinowe nie mają właściwości amfoterycznych, ich separacja jest znacznie prostsza.

Kwasy nukleinowe mogą się poruszać w polu elektrycznym dzięki zawartości grup fosforanowych, które nadają im charakter polianionowy.

Zjawisko elektroforezy zachodzi dzięki obecności pola elektrycznego. Siła z jaką pole oddziałuje na ładunek elektryczny jonu, jest proporcjonalna do natęże­nia pola E (y/m), a ta wielkość jest z kolei proporcjonalna do różnicy potencjałów U (V) przyłożonych do elektrod. W zakresie niskich sił jonowych istnieje prosta relacja, wynikająca z prawa Ohma, regulująca zależność pomiędzy przyłożonym napięciem U a płynącym w wyniku tego prądem I (A) oraz oporem elektrycznym (rezystancją) R (Ω) elektrolitu: V = I * R. Podczas przepływu prądu elektrycznego, w wyniku wykonywania pracy przesunięcia ładunku elektrycznego przez pole, na opornościach obwodu tracona jest moc P (W) i wydzielane jest ciepło, zwane cie­płem Joule'a.

Zasilacze stosowane do elektroforezy zwykle mogą utrzymywać stałą wartość jednego z parametrów: prądu I, napięcia U lub mocy P. Dla pozostałych parame­trów ustala się tylko górny limit wartości. Podczas trwania elektroforezy oporność elektrolitu się zmienia. Zwykle obniża się ze wzrostem temperatury wynikającym z ciepła Joule'a.

Utrzymywanie temperatury na zadanym poziomie, odpowiednim dla danego procesu, jest konieczne do osiągnięcia zadowalających i powtarzalnych wyników elektroforezy. Dla przykładu, podczas polimeryzacji akryloamidu wydzielane jest ciepło związane z zachodzeniem egzotermicznych reakcji chemicznych. Uwolnione ciepło może przyczynić się do powstawania prądów konwekcyjnych w całej obję­tości polimeryzującego akryloamidu i mogą pojawiać się nieregularności w sieciowaniu i porowatości nośnika. Wpływ wydzielanego ciepła polimeryzacji jest często bagatelizowany w praktyce laboratoryjnej, co jest uzasadnione tak długo, jak długo przygotowywane żele mają małą gęstość. Jednak w przypadku żeli 15-procentowych i gęstszych oraz żeli gradientowych brak odprowadzania ciepła polime­ryzacji powoduje silne niejednorodności struktury nośnika i złe wyniki separacji. Nadmiar ciepła uwalnianego podczas samego procesu elektroforezy może również stanowić poważne problemy natury praktycznej. Często obserwuje się nierówno­mierne przemieszczanie się frontu elektroforezy, co ze względu na kształt deforma­cji bywa nazywane uśmiechającym się rozdziałem. W tym przypadku makrojony w centralnej części nośnika migrują znacznie szybciej niż ich odpowiedniki znaj­dujące się przy bocznych krawędziach nośnika. W sytuacji znacznego gradientu temperatury pomiędzy początkiem i końcem żelu można zaobserwować, że nie­które prążki migrują jako dublety, a inne są znacznie poszerzone. Przy zastoso­waniu zbyt dużych mocy można zaobserwować topnienie żeli agarozowych, a w innych rodzajach elektroforezy może dojść do pękania szklanych płyt czy nawet uszkodzenia aparatu przez termiczne odkształcenia jego plastikowych elementów. Dlatego współcześnie użytkowane dobre aparaty do elektroforezy mają możliwość aktywnego odprowadzania lub rozpraszania nadmiaru ciepła z całej objętości żelu.

Rozdziały elektroforetyczne mogą być prowadzone bezpośrednio w objętości elektrolitu; rozwiązanie takie stosowane jest często w elektroforezie kapilarnej lub w nośniku elektroforetycznym wypełnionym odpowiednim elektrolitem. Nośnik elektroforetyczny (bibuła, azotan celulozy, agaroza, poliakryloamid i inne) nie tylko stabilizuje elektrolit, ale często przyczynia się do lepszej separacji makrocząsteczek. Szczególnie zastosowanie porowatych nośników (agaroza, poliakryloamid) potęguje efekt separacji przez dodatkowe frakcjonowanie makrocząsteczek

na zasadzie sita molekularnego. Żele agarozowe i poliakryloamidowe mają postać 17 przestrzennie usieciowanych struktur i choć zajmuje ona zaledwie około 0,5-1,0% objętości całego nośnika (reszta przypada na elektrolit), to jednak rozmiary poro­watości porównywalne są z rozmiarami typowych makrojonów, a co za tym idzie, większe z nich doznają większych oporów ruchu w polu elektrycznym. Na efekt separacji ze względu na różną ruchliwość makrojonów, związaną z ich rozmiarami i uwodnieniem, nakłada się efekt separacji ze względu na opory ruchu w stosunku do nośnika. Ponieważ oba efekty działają w tym samym kierunku, rozdział makro­jonów w porowatym nośniku jest bardzo dobry. Jeszcze lepsze efekty rozdziału można uzyskać w porowatych nośnikach o narastającej, wraz z dystansem migracji, gęstości sieciowania (żele gradientowe).

Akryloamid pozwala przygotować nośniki o bardzo gęstym usieciowaniu i niewielkich porach, co umożliwia separację polinukleotydów o wielkości 5-2000 pz.

Nośniki agarozowe charakteryzują się znacznie uboższym usieciowaniem i większymi porami. Pozwala to na separację znacznie większych fragmentów kwasów nukleinowych (30-50 000 pz).

Przy poszukiwaniu nowego rodzaju nośnika należy pamiętać, że powinien on być elektrycznie obojętny. Występowanie związanego z nośnikiem ładunku elektrycznego prowadzi do niekontrolowanych oddziaływań makrojonów z tym ładunkiem i w rezultacie zmiany prędkości ich migracji, aż do całkowitego zatrzymania makrojonu. Jednocześnie istnienie takiego ładunku elek­trycznego przyczynia się do migracji cząsteczek wody w kierunku katody (elektroendoosmoza). Wynika stąd, że obecność związanego z powierzchnią nośnika ładunku elektrycznego prowadzi do znaczącego obniżenia rozdzielczości.

Elektroforezę ze względu na sposób umieszczenia nośnika można podzielić na kilka rodzajów:

1. elektroforeza kapilarna (HPCE)

• Elektrolit wypełnia kapilarę. Do jej końców przykłada się wysokie napięcie. Przeznaczeniem są rozdziały analityczne i preparatywne. Ilość nanoszonego materiału to zaledwie kilka nanogramów. Czas trwania wynosi 10-20 minut. Detekcja rozdzielonych grup makrocząsteczek odbywa się u ujścia kapilary za pomocą detektora o konstrukcji zbliżonej do przepływowego detektora stosowanego w chromatografii cieczowej.

2. elektroforeza pionowa

• Stosowana najpowszechniej. Nośnik wypełnia szklane rurki (e. rurkowa) lub znajduje się pomiędzy dwoma płytkami rozdzielonymi przekładkami dystansowymi. ). Górna część nośnika musi być przykryta warstwą buforu elektrodowego (elektrolitu). W tym rozwiązaniu istnieje naturalna tendencja do wyciekania buforów z górnego naczynia, co wymaga uwagi podczas trwania rozdziału. Brak kontaktu elektrolitu z żelem powoduje przerwanie obwodu elektrycznego i w związku z tym przerwanie procesu elektroforezy. Inną niedogodnością tego rozwiązania jest trudność z odpro­wadzeniem ciepła generowanego przez przepływający prąd. W przypadku elektro­forezy płytowej możliwe jest odprowadzanie ciepła przez ściankę kontaktującą się z jedną z płyt.

3. elektroforeza pozioma

• W elektroforezie poziomej nośnik umieszczony jest w płaszczyźnie poziomej. Zaletą tego rozwiązania jest brak wycieków elektrolitu oraz możliwość łatwego odprowadzenia ciepła generowanego w trakcie przepływu prądu. Do rozdziału kwasów nukleinowych w agarozie zwykle stosuje się technikę zatopionego żelu (ang. submarine). Natomiast do rozdziałów w żelach poliakryloamidowych, tak dla rozdziałów kwasów nukleinowych, jak i białek i peptydów, stosuje się tech­nikę półsuchą, w której bufory elektrodowe zamknięte są w zestalonej agarozie lub w warstwach bibuły filtracyjnej. Pozwala to na znaczne ograniczenie zużycia che­mikaliów niezbędnych do przygotowania buforów.

Najczęściej stosowana jest elektroforeza strefowa. Odbywa się na nośniku, w którym elektrolit ma w całej objętości stałe pH. W polu elektrycznym przy lekko zasadowym pH ujemnie naładowane DNA i RNA migrują w kierunku anody. Duże cząstki migrują wolniej niż małe. Rozdzielczość można ponadto regulować żelem o określonej wielkości porów.

Niekiedy do buforu dodaje się czynnik denaturujący, który usuwa strukturę drugorzędową (formamid, mocznik).

Zwiększenie natężenia prądu przyspiesza migrację, ale towarzyszy temu wzrost temperatury, a to prowadzi do tworzenia smug i zmiany kształtu prążków.

Elektroforezę kwasów nukleinowych prowadzi się zwykle w żelach agarowych, agarozowych lub poliakryloamidowych. Żele agarowe i agarozowe przygotowuje się przez ogrzanie granularnego materiału w odpowiednim buforze elektrolitowym, wylanie żelu i zastygnięcie po oziębieniu. Rozdzielczość żeli zależy od stężenia rozpuszczonego agaru lub agarozy. Do rozdziału dużych cząsteczek DNA i RNA stosuje się rozcieńczone żele (0,9-1,5%), a bardziej stężone do rozdziału cząste­czek niskomolekularnych (3-4%). Rozdział dwuniciowego DNA w agarozie zachodzi w pH lekko zasadowym; w tych warunkach DNA wykazuje ładunek ujemny i próbki nałożone na żel przy katodzie wędrują w kierunku anody. Ruchliwość elektroforetyczna zależy od wielkości fragmentu oraz jest prawie niezależna od sekwencji fragmentu i składu zasad. Żele agarozowe wykorzystywane są do analizy dwuniciowych fragmentów DNA o wielkości 50-30 000 pz w żelach 1-4-procentowych, a nawet do 800 000 pz w żelach 0,1-procentowych. Żele poliakryloamidowe służą do rozdziałów niewielkich fragmentów o wielkości 5-2000 pz w 3-20-procentowym poliakryloamidzie. Najmniejsza wykrywana ilość DNA, nieznakowanego radioaktywnie, zbliżona jest do 1 ng.

Żele agarozowe

Żele agarozowe przygotowywane są z agarozy, wielocukru pochodzącego z agaru. Agaroza w postaci handlowej jest białym proszkiem. Rozpuszcza się bardzo łatwo we wrzącej wodzie i pozostaje w stanie płynnym aż do temperatury ok. 40°C. Poniżej tej temperatury zestala się w postać porowatego żelu. Po zestaleniu pozo­staje w tej postaci nawet w podwyższonych temperaturach sięgających kilkudzisięciu stopni Celsjusza. W temperaturze wrzenia wody ulega ponownie topnieniu. Rozmiary porowatości można regulować, stosując agarozę w różnych stężeniach.

Im wyższe stężenie agarozy, tym bogatsze jest usieciowanie i drobniejsze są pory. Zwykle przygotowuje się żele o stężeniach agarozy w przedziale 0,9-3% i stosuje się je w aparatach do elektroforezy poziomej. Zaletą żeli agarozowych jest łatwość i szybkość ich przygotowania oraz możliwość separacji dużych makrocząsteczek. Wadą zaś jest słaba wytrzymałość mechaniczna żeli oraz trudność ich utrwalania po rozdziale. Zwykle stosuje się żele o grubości 3-6 mm. W celu przygotowania żelu odważoną porcję agarozy wsypuje się do określonej objętości buforu do elektrofo­rezy (dla uzyskania odpowiedniego stężenia agarozy) i rozpuszcza się przez dopro­wadzenie do wrzenia (kuchenka mikrofalowa, elektryczna lub inne źródło ciepła). Przy wyjmowaniu agarozy należy postępować ostrożnie, ponieważ gorąca agaroza bardzo łatwo, po delikatnym wstrząśnięciu, zaczyna ponownie wrzeć. Nąstępnię chłodzi się agarozę do ok. 60°C, wylewa na przygotowane saneczki umieszczone na wypoziomowanym stole, zwracając uwagę, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza. Następnie umieszcza się grzebień i pozostawia w temperaturze pokojo­wej do zastygnięcia (przez ok. 1 godz.). W przypadku rozdziału DNA na dużych żelach (20 * 20 cm) niektórzy badacze dodają do agarozy 0,1% hydroksyetylocelulozy (HEC) celem zmniejszenia dyfuzji DNA, a co za tym idzie zwiększenia ostrości prążków.

Żele poliakryloamidowe

Żele poliakryloamidowe przygotowywane są z roztworu monomerów akryloamidu i substancji sieciujących (ang. cross-linkers). Akryloamid w postaci monomerycznej jest bardzo silną neurotoksyną i nawet po procesie polimeryzacji stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia, ze względu na pozostałości swobodnych monome­rów w żelu. Jako substancję sieciującą stosuje się najczęściej N,N'-metylenobisakryloamid (bisakryloamid). Reakcję polimeryzacji, będącą w istocie reakcją polimeryzacji, można zainicjować chemicznie lub fotochemicznie. Przy chemicznej inicjacji procesu najczęściej stosuje się nadsiarczan amonu (APS) w obec­ności katalizatora N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED). Fotochemiczne wyzwolenie procesu polimeryzacji zachodzi w obecności ryboflawiny pod działa­niem długofalowego światła UV i jest katalizowane przez TEMED.

Ze względu na wydzielanie się znacznych ilości ciepła podczas polimeryzacji akryloamidu, dla właściwego przebiegu procesu należy przestrzegać odpowiedniego dozowania substancji inicjujących i katalizujących, tak aby czas polimeryzacji nie był krótszy niż 30 min. W szczególnych przypadkach, gdy zawartość akryloamidu przekracza 15%, należy zapewnić efektywne odprowadzanie powstałego ciepła przez umieszczenie kasety z polimeryzującym żelem w łaźni wodnej. Gęstość sie­ciowania oraz rozmiary porów można regulować, dobierając odpowiednio stężenie akryloamidu i bisakryloamidu.

Właściwości żelu opisuje się dwoma parametrami:

• całkowite stężenie akryloamidu

• dopełniającym parametrem jest wagowy stosunek ilości substancji sieciującej do sumy akryloamidu i substancji sieciującej

Szeroki zakres porów o kontrolowanej i powtarzalnej wielkości prowadzi do powszechnego wykorzystania żeli poliakryloamidowych. Najczęściej stosuje się żele 2-20%. Zwykle elektroforeza w żelu poliakryloamidowym prowadzona jest dla względnie małej objętości próbek lub małych ilości DNA lub RNA, lecz może być zwiększona do skali preparatywnej.

Przygotowanie żeli poliakrvloamidowych iest bardziej skomplikowane od przygotowania żeli agarozowych. Jeżeli jednak elektroforezę wykonuje się rutynowo, ich przygotowanie nie stanowi problemu. Roztwory powinny być odgazowane (pompa wodna lub próżniowa), ponieważ pozostające w żelu pęcherzyki powietrza zaburzają rozdział elektroforetyczny. Po dodaniu TEMED oraz nadsiarczanu amonu (APS), natychmiast, po delikatnym wymieszaniu, należy wylać żel pomiędzy przy­gotowane płyty. Następnie od góry, pomiędzy płyty, wprowadza się grzebienie. Polimeryzacja żeli trwa 30-120 min. Przygotowane żele mogą być przechowywane przez kilka dni w lodówce lub, w temperaturze pokojowej, zabezpieczone przed wyschnięciem.

W wielu przypadkach odległość, którą przebyła cząsteczka w polu elektrycz­nym, jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu dziesiętnego masy cząsteczkowej. W przypadku kwasów nukleinowych wpływa na to jednak wiele czynników obej­mujących skład zasad i strukturę drugorzędową, stąd by poprawnie oznaczyć wiel­kości, należy prowadzić elektroforezę w warunkach całkowicie denaturujących.

Elektroforeza DNA znajduje szerokie zastosowanie, poczynając od rozdziału DNA całych chromosomów (elektroforeza w pulsacyjnym polu elektrycznym) aż do określenia sekwencji nukleotydowej (żele sekwencyjne lub kapilary). Do analizy jednoniciowych fragmentów DNA wykorzystuje się żele denaturujące, w których fragmenty migrują w zależności od wielkości. Zastosowanie żeli o wzrastającym gradiencie denaturującym sprzyja uzyskaniu większej rozdzielczości; dochodzi wówczas do silnego obniżenia ruchliwości w miejscu żelu, w którym następuje roz­dzielanie się komplementarnych nici. Ostateczne położenie fragmentu DNA w żelu zależy i od sekwencji i od wielkości.

Bufory

W przypadku żeli poliakryloamidowych i agarozowych bardzo często stosuje się bufor TBE (89 mM Tris-boran, 2 mM EDTA, pH 8,0), jednak dla agarozy, ze względu na tworzenie kompleksów boran-agaroza, nie jest to bufor optymalny, cho­ciaż bardzo często stosowany. Trudno jest również eluować DNA z żeli rozdziela­nych w buforze TBE. Można też stosować bufory Tris-fosforanowe o zróżnicowanej pojemności buforowej (np. 50 mM Tris-NaH₂PO₄, pH 7.5-8.0) lub tańsze, wyma­gające jednak mieszania (50 mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ pH 7,5-8.0). Bufory przygotowuje się w postaci stężonej (5-25 razy, najczęściej 10 razy). Bufory fosforanowe ograniczają możliwość wytrącania DNA etanolem. Z kolei Tris podczas, elektrofo­rezy utlenia się, przyjmując formę absorbującą UV, a bufory oparte na chlorkach prowadzą do powstawania chloru. Stosowane są również bufory oparte na octanie (np. 50 mM Tris-octan lub 50 mM octan sodu-kwas octowy, pH 7,5-8,0). Octan podczas elektroforezy podlega utlenieniu do węglanu, co zwiększa pH, ale sprzyja elucji DNA z żelu. We wszystkich buforach stosowany jest EDTA (1-5 mM).

Wiele buforów może być użytych do elektroforezy w warunkach denaturujących. Wybór czynnika denaturującego, którym może być mocznik lub formamid, zależy od rodzaju żelu. W żelach agarozowych nie stosuje się czynników chaotropowych, takich jak formamid, a w żelach poliakryloamidowych należy ograniczyć stosowa­nie zasad. Metoda alkaliczna najlepiej sprawdza się w przypadku żeli agarozowych. Agarozę rozpuszcza się w wodzie destylowanej i po ochłodzeniu do 60°C dodaje się stężonego buforu NaOH-EDTA, do uzyskania końcowego stężenia 30 mM NaOH i 2 mM EDTA. Najczęściej jednak wykorzystuje się 7 M mocznik.

Przygotowanie próbek do nałożenia na żel

Maksymalna ilość DNA, którą można włożyć do kieszonki zależy od wielu czynników:

• objętość kieszonki

• wielkości fragmentu (pojemność żelu gwałtownie maleje ze wzrostem wielkości fragmentu, szczególnie powyżej kilku tysięcy par zasad)

• rozkładu wielkości fragmentów DNA (największa pojemność żelu występuje, gdy liczba różnych fragmentów DNA jest równomierna)

• gradientu napięcia (większy gradient prowadzi do słabszego rozdziału, a tym samym do niższej pojemności, szczególnie dla większych fragmentów DNA)

Większość preparatów DNA w buforach o niskiej sile jonowej i stężeniu poniżej 1 µg/µl może być bezpośrednio nakładana na żel po dodaniu 0,1 objętości mieszaniny Stop (np. 30% Ficoll, 0,25% oranż G, 0,5 M EDTA, 10* stężony bufor do elektroforezy). Można stosować również błękit bromofenolu (0,025%), a dla żeli alkalicznych zieleń bromokrezolu (0,025%) i cyjanoksylen (0,025%). Ponieważ barwnik migruje podobnie jak niskocząsteczkowe fragmenty DNA, to zapewnia możliwość śledzenia ich migracji. Natomiast EDTA zapewnia wiązanie dwuwartościowych kationów. Dodanie mieszaniny stop po hydrolizie DNA enzymami restrykcyjnymi prowadzi do zatrzymania przebiegu reakcji. Przy nakładaniu frag­mentów DNA faga lambda wskazana jest denaturacja fragmentów w temp. 65⁰C przez 5 min i następnie gwałtowne oziębienie próbki w celu denaturacji lepkich końców. Próbki DNA o dużej zawartości soli powinny być odsolone.

Markery wielkości

Do określania wielkości analizowanych fragmentów należy zastosować wzorce o znanej wielkości mas cząsteczkowych. Do wstępnego oszacowania wielkości niskocząsteczkowych fragmentów DNA wystarczają barwniki - oranż G lub błękit bromofenolowy. Do oznaczania większych fragmentów stosuje się odpowiednio przygotowane fragmenty powstające w wyniku hydrolizy DNA faga lamba lub plazmidów.

Wielkość fragmentów rozdzielonych w żelu określa się dzięki porównaniu z wielkością znanych fragmentów. Najczęściej przygotowuje się wykres zależności dystansu migracji fragmentów od ich mas lub wielkości mierzonej liczbą zasad. W skali logarytmiczno-liniowej zależność tę można przedstawić jako liniową. Obecnie dużym ułatwieniem są programy komputerowe automatycznie generujące krzywą kalibracyjną na podstawie odczytanych danych z żelu.

Barwienie żeli

Stosuje się metodę wizualizacyjną. Żele mogą być natychmiast po elektroforezie barwione bromkiem etydyny (0,5µg/ml). Żele agarozowe (1%) o grubości 5 mm powinny być bar­wione przez ok. 30 min z delikatnym kołysaniem. Należy stosować go ostrożnie, gdyż jest silnym mutagenem. Dla zmniejszenia tła zaleca się przemycie (lub dwukrotne przemycie) buforem elektrodowym przez 30 min z delikatnym kołysaniem. Zbyt długie przemywanie prowadzi jednak do wymycia bromku z kompleksów dwuniciowego DNA. Jednak często żele przygotowuje się już z dodatkiem bromku etydyny, można wówczas obserwować migrację DNA w trakcie elektroforezy i natychmiast po jej zakończeniu.

Znacznie lepiej interkaluje do dwuniciowego DNA, może być zbyt mało czuły dla niektórych analiz jednoniciowego DNA.

Kompleks bromek etydyny-DNA może być łatwo uwidoczniony fluoprescencyjnie w świetle UV. Fluorescencja bromku etydyny związanego z DNA jest 10 razy silniejsza od bromku niezwiązanego. Maksimum emisji przypada na 590 nm. Do odczytu wykorzystuje się lampy o długości fali 254 nm, 302 nm i 366 nm (jednak światło o długości 254 uszkadza DNA, dlatego najczęściej stosuje się pobudzenie w 302 nm).

Bardzo wysoką detekcję można uzyskać poprzez znakowanie izotopami radioaktywnymi - izotopy fosforu ³²P, ³³P lub siarki ³⁵S.

Barwienie DNA srebrem

Oprócz barwienia DNA tą metodą można też barwić oligonukleotydy.

Srebro w postaci azotanu (V) srebra stosuje się do barwienia DNA, białek i lipopolisacharydów. Jest to znacznie czulsze od barwienia bromkiem etydyny, gdyż umożliwia detekcję 1-10 pg DNA na 1 mm² (10 ng na prążek). Jest to technika fotochemiczna podobna do reakcji wykorzystywanych w fotografii.

• Pierwszy etapem jest utrwalenie, które polega na odwodnieniu żelu w roztworze etanolu lub metanolu (ewentualnie z dodatkiem kwasu octowego). Żel staje się wtedy bardziej podatny na działanie kolejnych roztworów, a jednocześnie DNA zostaje utrwalony w żelu, co zapobiega jego wypłukiwaniu na dalszych etapach reakcji. Z żeli denaturujących z mocznikiem należy przed utrwalaniem mocznik wypłukać, gdyż bardzo silnie wiąże on srebro.

• Drugim krokiem jest utlenianie DNA kwasem azotowym (V), aby DNA łatwiej wiązał srebro. Do barwienia stosuje się srebro w formie rozpuszczalnych soli (azotan (V) srebra). Dodanie formaldehydu do roztworu azotanu (V) srebra powoduje redukcję srebra do formy metalicznej. Metaliczne srebro wiąże się z DNA, tworząc nierozpuszczalne sole. Ważne jest, aby po barwieniu bardzo dokładnie wypłukać niezwiązane srebro, którego pozostałości w żelu dają silne tło.

• Dalsza redukcja srebra węglanem sodu i formaldehydem, czyli wywoływanie, pozwala uwidocznić strąty. Zredukowane srebro przyjmuje kolor brązowy.

Redukcje zatrzymuje się obniżając pH (np. kwasem octowym). Zaletą jest trwałość uzyskanego wyniku. Można także ekstrahować DNA do dalszych analiz, nawet po dłuższym przechowywaniu. Wadą jest duża wrażliwość na zanieczyszczenia nieorganiczne, które powodują powstawanie dużego tła.

---