Podstawy technologii wybranych bioproduktów - materiały uzupełniające

Procesy biotechnologiczne odbiegają od klasycznych procesów chemicznych pod względem:

• rodzaju materiału, w tym jego złożoności, zmienności w czasie procesu i wrażliwości na czynniki zewnętrzne,

• wymagań procesowych w zakresie sterylności i powtarzalności,

• rozpiętości skali produkcji (od kilku gramów do wielu ton) i objętości czynnej bioreaktorów (od kilku m³ do setek m³).

Specyficznością procesów biotechnologicznych jest również:

• skomplikowana kinetyka, z reguły o charakterze nieliniowym,

• wymagania dużej dokładności regulacji parametrów bioprocesu w przestrzeni i w czasie (utrzymanie temperatury, pH, stężenia substratów lub produktów),

• inhibicja bioprocesu metabolitami, wymagająca ciągłego ich usuwania ze środowiska reakcji,

• zmienność materiału biologicznego spowodowana wzrostem i obumieraniem komórek oraz zmianami morfologicznymi organizmów,

• nieniutonowski charakter pożywek i jego zmienność w czasie, niekiedy bardzo drastyczna (np. w produkcji ksantanu lepkość środowiska zwiększa się od kilku do kilku tys. mPa · s),

• występowanie stanów nieustalonych.

Biosynteza mikrobiologiczna zmierzająca w kierunku otrzymywania biomasy lub metabolitów wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych jest prowadzona wieloma sposobami i w różnych warunkach technicznych w zależności przede wszystkim od rodzaju drobnoustroju oraz od przetwarzanego surowca i wytwarzanego produktu. Klasyczne bioprocesy przemysłowe są realizowane w warunkach tlenowych w bioreaktorach umożliwiających kontrolę fizycznych warunków i ich optymalny przebieg (pomiar i regulację parametrów) przy maksymalnym ograniczeniu lub całkowitym wyeliminowaniu zakażeń. Chociaż poszczególne biotechnologie dość znacznie się różnią to jednak mają wiele cech wspólnych. Zazwyczaj należą do nich następujące zasadnicze procesy jednostkowe:

1. Procesy przygotowawcze, które obejmują mycie i dezynfekcję lub sterylizację aparatury, pomieszczeń, przewodów przesyłowych i dozujących składniki pożywek lub podłoży hodowlanych, przygotowanie i sterylizację pożywek lub podłoży, dozowanie sterylnych pożywek i innych cieczy (roztworów regulujących pH, odpieniaczy, dodatkowych porcji pożywek hodowlanych), sterylizację powietrza, namnożenie materiału posiewowego.

2. Biosynteza, w tym: zasilanie bioreaktora, dostarczanie energii (m.in. do mieszania, podgrzewania lub chłodzenia, sprężania powietrza), usuwanie cieczy pofermentacyjnej, ciepła i gazów, kontrolę parametrów fizykochemicznych środowiska, optymalizację warunków rozwoju drobnoustrojów i pozyskiwania metabolitów.

3. Wydzielanie i oczyszczanie bioproduktów. Produkty biosyntezy (białka, lipidy, enzymy, kwasy organiczne, witaminy, aminokwasy, polisacharydy, biosurfaktanty, antybiotyki, przeciwciała) są wydzielane do cieczy pofermentacyjnej lub pozostają w komórkach w niej zawieszonych. Ciecze z mikroorganizmami, rozpuszczonymi metabolitami i niewykorzystanymi substratami często wykazują dużą lepkość, co w połączeniu z niewielkimi wymiarami zawieszonych cząstek i ich bardzo dużą ściśliwością znacznie utrudnia fizyczną separację. Utrzymanie aktywności biologicznej wielu metabolitów, m.in. enzymów, rekombinowanych białek lub witamin, w czasie wydzielania i oczyszczania wymaga odpowiednich warunków środowiska, tj. temperatury, pH, siły jonowej oraz obecności niektórych związków organicznych. Procesy rozdzielania i oczyszczania substratów lub produktów (ang. up-stream i down-stream processing) są ważną częścią przemysłowych bioprocesów, w tym również ekonomiczną (60-90% całości kosztów), a ich specyfika wynikająca m.in. z wrażliwości materiału biologicznego (np. zmiana konformacji białka wystarcza do pozbawienia go specyficznego działania), podobnych właściwości rozdzielanych związków, małego stężenia metabolitów w cieczy pofermentacyjnej, nieokreślonego składu i/lub właściwości mieszanin wymusza dostosowanie klasycznych metod rozdzielania do specyficznych wymagań materiału i opracowanie nowych rozwiązań typowych dla inżynierii bioprocesowej.

Niezależnie od umiejscowienia bioproduktu (wewnątrz lub na zewnątrz komórek), pierwszym etapem przetwarzania cieczy pofermentacyjnej jest wydzielanie biomasy metodą: konwencjonalną - wirowania, filtracji (typu osadowego, dead-end lub membranowej filtracji dynamicznej, cross-flow) lub mikrofiltracji, sedymentacji lub flokulacji, flotacji, koagulacji bądź niekonwencjonalną - powinowactwa, np. immunomagnetyczną. Frakcjonowanie biomasy metodą wirowania jest bardziej efektywne pod względem wydajności i bardziej energochłonne od filtracji i innych sposobów rozdzielania faz. Z cieczy pofermentacyjnej bioprodukty są najczęściej ekstrahowane rozpuszczalnikami lub płynami w stanie nadkrytycznym, wykrystalizowywane, wymrażane, odparowywane próżniowo, oddestylowywane. Natomiast substancje aktywne fizjologicznie, w szczególności antybiotyki, są wydzielane, oczyszczane i frakcjonowane przez flokulację polimerowymi flokulantami. W pozyskiwaniu metabolitów wewnątrzkomórkowych niezbędną operacją jest dezintegracja biomasy metodami fizycznymi (mechanicznymi), chemiczno-ekstrakcyjnymi lub fizjologiczno-biochemicznymi (np. enzymami litycznymi), przy czym ta ostatnia odbywa się we względnie łagodnych warunkach.

W przyszłości najbardziej powszechną formą bioproduktów będą koncentraty enzymów, witamin, hydrolizatów i antybiotyków paszowych, w postaci cieczy, proszków lub mieszanin z wypełniaczami, stanowiące suchą pozostałość (w tym biomasę) cieczy pofermentacyjnej po częściowym jej przetworzeniu (stabilizacji, oczyszczeniu, zagęszczeniu). Wszystkie metody oczyszczania charakteryzują się dużą liczbą operacji jednostkowych wielokrotnie powtarzanych (filtracja zawiesin, dwu- lub trzystopniowa ekstrakcja, krystalizacja, zatężanie roztworów w wyparkach próżniowych, różne metody suszenia), różnorodnością złożonością i wielkością urządzeń. Produkty biosyntezy, w większości złożone związki organiczne, są podatne na działanie czynników zewnętrznych (podwyższonej temperatury, zmian pH roztworu). W celu zmniejszenia strat termolabilnych składników wykazujących aktywność biologiczną zagęszczanie jest prowadzone w niskiej temperaturze w warunkach obniżonego ciśnienia i ograniczonego czasu kontaktu cieczy z powierzchnią.

Wydzielanie i oczyszczanie bioproduktów uwzględnia pozyskiwanie biomasy (ang. cell harvesting), niszczenie ścian komórkowych (ang. disruption), usuwanie pozostałości po dezintegracji biomasy i innych nierozpuszczalnych substancji, koncentrację bioproduktów, wstępne rozdzielanie (ang. clarification), np. metodą strącania, właściwe oczyszczanie (ang. polishing, product purification), np. metodami chromatograficznymi, utrwalanie bioproduktów.

Wydzielanie produktu biosyntezy ze złożonego układu wielofazowego zawierającego mikroorganizmy, pozostałość pożywki i lipidy, utrudnione małą koncentracją metabolitu i niewielkimi różnicami wielkości, wartości ładunków elektrycznych, struktury cząsteczkowej składników danego układu, zależy od jego chemicznych i fizycznych właściwości oraz od efektywności wstępnego oczyszczania cieczy pofermentacyjnej. Metody wstępnego wydzielania/koncentracji są pracochłonne i decydują o właściwościach bioproduktów, ich aktywności i cenie. Z cieczy pofermentacyjnej można otrzymać suchy koncentrat bioproduktu lub rozdzielić ją na biomasę i klarowną frakcję ciekłą z różnymi metabolitami. Niekiedy celem nadrzędnym przetwarzania bioproduktów jest zachowanie właściwości enzymów, budowy strukturalnej bioproduktu, cech przeciwciał zapewniających właściwą reakcję z antygenami, immunogenności szczepionek.

Najczęściej stosowanymi metodami oczyszczania bioproduktów są ekstrakcja i wymiana jonowa. Wiele produktów biosyntezy, np. kwasy organiczne lub niektóre aminokwasy, wydziela się z cieczy pofermentacyjnej metodą krystalizacji, chociaż bezpośredni proces jest zalecany jedynie w przypadku małej zawartości substancji balastowych i barwnych. Znane są sposoby wydzielania metabolitów w postaci soli, np. w czasie neutralizacji kwasu cytrynowego w cieczy pofermentacyjnej wodorotlenkiem wapnia lub kredą powstaje trudno rozpuszczalny cytrynian wapnia. Zaletą często stosowanego wytrącania enzymów rozpuszczalnikami organicznymi jest ich odzyskiwanie, a wadą - mało selektywne separowanie białek.

Wydzielanie białek w łagodnych warunkach temperatury i pH, przy względnie małych stratach aktywności, umożliwiają procesy membranowe (dializa, elektrodializa, ultrafiltracja, odwrócona osmoza, mikrofiltracja), z których ultrafiltracja jest najbardziej przydatna do ciągłego wydzielania enzymów z cieczy pofermentacyjnej i do ich oddzielania od reszty produktów w reaktorach membranowych. W ciągłych bioprocesach, ze względu na ich dużą selektywność, walory ekonomiczne i zachowawczość wobec aktywnej substancji, bardzo efektywne jest jednoczesne prowadzenie przemiany chemicznej lub biochemicznej i wydzielanie składników z cieczy pofermentacyjnej w bioreaktorze membranowym. Układ taki składa się z bioreaktora (zazwyczaj mieszalnikowego) i sekcji frakcjonowania z modułami: mikrofiltracyjnym (MF), ultrafiltracyjnym (UF) i perwaporacyjnym (PV), umożliwiającymi rozdzielanie składników układu na frakcje o sterowanym czasie przebywania w strefie reakcji. Tradycyjne techniki membranowe (mikrofiltracja, ultrafiltracja) są przydatne do rozdzielania związków znacznie różniących się masą cząsteczkową i w procesach niewymagających dużej rozdzielczości. Nowe rozwiązania procesowe zwiększają zdolność rozdzielczą membran i wydajność modułów filtracyjnych, np. dzięki zastosowaniu obrotowych tarcz filtracyjnych lub specjalnie ukształtowanych przepływów spiralnych. Szczególne znaczenie przypisuje się zastosowaniu technik ze stycznym przepływem cieczy pofermentacyjnej względem membrany określanym mianem HPTFF (ang. High-Performance Tangential Flow Filtration) do oczyszczania białek przy dużym natężeniu przepływu permeatu oraz ograniczonym zapychaniu i blokowaniu membran (ang. fouling) w porównaniu z klasyczną filtracją okresową w przepływie jednokierunkowym lub membran obdarzonych ładunkiem elektrycznym. Przydatność tych technik w biotechnologii została omówiona w opracowaniu Van Reis i Zydney; m.in. do oczyszczania bioproduktów są proponowane membrany chromatograficzne (sorpcyjne), w których, w odróżnieniu od klasycznej chromatografii przy użyciu nieruchomego złoża sorbentu, nie występują utrudnienia pod wpływem oporów dyfuzyjnych masy w złożu. W procesie ciągłym przy użyciu takich membran, np. jednorazowego użytku niewymagających konserwacji, nawet małe ilości zanieczyszczeń są usuwane z dużą sprawnością.

Metody chromatograficzne: adsorpcja, filtracja żelowa, chromatografia jonowymienna, chromatografia powinowactwa, odwróconej fazy i oddziaływań hydrofobowych, stają się coraz częściej konkurencyjne wobec tradycyjnych technik rozdzielania bioproduktów wykazujących aktywność biologiczną. Dla przykładu chromatografia jonowymienna jest jednym z etapów w niemal wszystkich technologiach otrzymywania enzymów o dużej czystości metodą krystalizacji, wymagającym jednak rozcieńczania roztworów, których powtórna dehydratacja w wyparkach próżniowych lub w liofilizatorze zawsze zmniejsza aktywność enzymów. Duże koszty stosowania chromatografii w skali przemysłowej: inwestycyjne (zakup aparatury) i operacyjne (koszty odczynników zużywanych w procesie produkcji i do konserwacji membran) są systematycznie zmniejszane, dzięki wprowadzaniu nowych materiałów, np. ligandów o dużej selektywności i polimerów o dużej porowatości, do bezpośredniego wydzielania metabolitów z nieklarowanych cieczy oraz doskonaleniu technik procesowych, m.in. wprowadzeniu złóż fluidalnych.

Nowością w tym obszarze są tzw. procesy zintegrowane, w których połączono proces biochemiczny i rozdzielanie (np. destylację, ekstrakcję, sorpcję), zwiększając wydajność (np. fermentacji etanolowej, produkcji kwasów organicznych), dzięki usuwaniu metabolitów hamujących rozwój drobnoustrojów. Separacja technikami membranowymi, np. ekstrakcja lub destylacja membranowa, usuwa produkt z cieczy pofermentacyjnej i eliminuje wpływ niekorzystnych czynników (podwyższona temperatura, rozpuszczalniki organiczne). W niektórych technologiach (wydzielanie kwasu mlekowego metodą elektrodializy, ekstrakcja etanolu z cieczy pofermentacyjnej) procesy zintegrowane są bardziej ekonomiczne niż tradycyjne rozwiązania.

Klasyczne metody separacji (destylacja, ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi) mogą powodować dezaktywację bioproduktów lub, jak chromatografia i krystalizacja, są bardzo kosztowne i mało wydajne, co ogranicza ich przydatność w skali przemysłowej. Często w technologiach wymagających dezintegracji komórek do uwolnienia metabolitów wewnątrzkomórkowych obecność resztek ścian komórkowych i duża lepkość homogenatów utrudniają odwirowanie lub filtrację zanieczyszczeń. „Łagodną" i skuteczną metodą separacji aktywnych bioproduktów jest ekstrakcja w wodnych układach dwufazowych (ang. ATPS - Aqueous Two-Phase Systems), która umożliwia jednoczesne oddzielanie biomasy lub jej pozostałości, usuwanie zanieczyszczeń i koncentrację produktu.

Komputerowe sterowanie bioprocesami i automatyczna kontrola podstawowych parametrów gwarantują utrzymanie właściwych warunków ich prowadzenia oraz uzyskanie dużej produktywności i zmniejszenie kosztów wytwarzania. Kontrola parametrów bioprocesu (temperatury, pH, stężenia rozpuszczonego tlenu i dwutlenku węgla, potencjału redoks, parametrów elektrycznych brzeczki) klasycznymi i nowoczesnymi (np. optycznymi) czujnikami informuje o jego aktualnym stanie i w połączeniu z matematycznym modelem procesu, umożliwiającym dynamiczną interpretację danych, ułatwia podejmowanie działań regulacyjnych. Szczególnie przydatne do tworzenia korelacyjnych modeli procesów są sztuczne sieci neuronowe (SNN), coraz częściej stosowane przez największe firmy biotechnologiczne do optymalizowania składu pożywki, maksymalizowania wydajności różnorodnych metabolitów i do bezpośredniego (tzw. adaptacyjnego) sterowania bioprocesem.

4. Utrwalanie bioproduktów. Bioprodukty są odwadniane do zawartości wilgoci 8-10% w dwuetapowym procesie, najpierw w wyniku usunięcia wody bez zmiany jej stanu fizycznego przez wirowanie, filtrację lub strącanie, a następnie w wyniku jej przemiany fazowej przez zagęszczanie, suszenie (w przypadku termolabilnych bioproduktów - sublimacyjne lub rozpryskowe) bądź wymrażanie.

5. Unieszkodliwianie produktów ubocznych lub odpadowych procesu biotechnologicznego. Rzeczywistością najbliższej przyszłości muszą stać się układy bezodpadowych technologii, czyli procesów przetwarzania materiałów niezanieczyszczających środowiska przyrodniczego i gwarantujących racjonalne wykorzystanie zasobów surowców i energii. Wiąże się to ściśle z odmiennym niż dotychczas ukierunkowaniem działań w polityce gospodarczej i w strategii rozwoju na gospodarkę bezodpadową. Znaczenie przemysłu biotechnologicznego będzie nadal wzrastało wraz ze wzrostem zamożności społeczeństwa i większym zapotrzebowaniem na bioprodukty o dużym stopniu przetworzenia i odpowiednio opakowanych. Zastosowanie odpowiednich technologii oraz właściwe zarządzanie jakością i czynnikami, takimi jak: energia, woda, produkty uboczne, odpady i ścieki, sprzyjają ograniczeniu negatywnego oddziaływania tego przemysłu na środowisko. Obecnie w świecie są wdrażane do praktyki tzw. „czyste technologie" (bezodpadowe), które zapewniają nie tylko uniknięcie degradacji środowiska, lecz również zwiększają efektywność produkcji. Temu celowi służą programy „najlepszych doświadczeń" (ang. best practise schemes) lub „zalecanych praktyk" (ang. good practise techniques) oraz „minimalizacji odpadów" (ang. wastes minimisation), które muszą być koniecznie uzasadnione rachunkiem ekonomicznym. Rachunek ekonomiczny opłacalności stosowania procesów biotechnologicznych zwiększających stopień wykorzystania składników produktów ubocznych powinien uwzględniać nie tylko nakłady inwestycyjne i przyszłe nakłady eksploatacyjne, ale również efekty wyrażone zwiększoną ilością bioproduktów oraz mniejszą dewastacją środowiska, m.in. zmniejszonymi kosztami oczyszczania ścieków. Optymalne zagospodarowanie wszystkich surowców stosowanych w procesie biotechnologicznym może realnie zmniejszyć koszty produkcji, a tym samym producent, który atrakcyjniej i taniej je przetworzy, ma szansę taniej sprzedać bioprodukty.

Otrzymywanie białka

Drobnoustroje stosowane do biosyntezy białka powinny charakteryzować się wszechstronnością metabolizowania składników odżywczych pożywki, dobrze rozbudowanym kompleksem enzymów oddechowych i jak najsłabszym kompleksem enzymów fermentacyjnych, odpornością na niekorzystne zmiany składu pożywki oraz cechami technologicznymi ułatwiającymi oddzielenie biomasy od pożywki. Sucha substancja biomasy organizmów jednokomórkowych (ang. SCP - single celi protein) składa się głównie z białka (ok. 70-90% w s.s.), niebiałkowych związków azotowych, lipidów, sacharydów, związków mineralnych i witamin. Skład i budowa ściany komórkowej oraz duża zawartość kwasów nukleinowych w komórce (do 20% w przypadku drożdży) limitują spożycie takiego białka przez człowieka. Dzienne spożycie kwasów nukleinowych przekraczające 2 g podwyższa poziom kwasu moczowego w plazmie krwi, sprzyjając wytrącaniu się jego kryształów, i w następstwie akumulacji w stawach jest przyczyną podagry.

W biosyntezie białka szczególnie przydatne są drożdże Candida, szybko rozmnażające się w pożywkach zawierających produkty uboczne przemysłu rolno-spożywczego i syntezujące enzymy i witaminy z prostych związków. Znane są technologie namnażania biomasy drożdży w pożywce z serwatki lub z permeatu po ultrafiltracji mleka lub serwatki. W większości rozwiązań pożywki z serwatki lub permeatu wymagają pasteryzacji i uzupełnienia składu makro-(fosfor, potas) i mikroelementami (żelazo, miedź, mangan, cynk). Wymóg pasteryzacji eliminuje ultrafiltracja serwatki przy pH 3,2. Efektywnymi rozwiązaniami są technologie Vienna i Bel upowszechnione we Francji. Pierwsza z nich zapewnia wydajność 4,5 g s.s. · dm^-3 · h^-1 w procesie ciągłym (32-33°C; pH 3,4-3,6; napowietrzanie 40 dm³ · dm^-3 · h^-1) prowadzonym w serwatce wzbo gaconej amoniakiem przy użyciu Candida intermedia. W technologii Bel trzy szczepy drożdży, spośród których Kluyveromyces marxianus var. lactis utylizuje laktozę i kwas mlekowy, Kluyveromyces marxianus var. marxianus - laktozę, a C. pintolopesii - etanol, są namnażane łącznie w serwatce odbiałczonej termicznie (90°C; pH 4,5) lub w permeacie. Równowaga populacji jest zależna od zawartości tych źródeł węgla w pożywce. Mieszanina szczepów gwarantuje całkowitą transformację laktozy, kwasu mlekowego, a nawet etanolu, który może pojawić się w niewłaściwie napowietrzanej pożywce. Zaleca się stosowanie serwatki odbiałczonej termicznie lub permeatu po ultrafiltracji serwatki, aby zapobiec flokulacji drożdży na niemetabolizowanych białkach serwatkowych.

Surowce ligninocelulozowe mogą być przydatne jako źródło węgla i energii w bioprocesach do produkcji żywności i pasz, m.in. jako pożywka do produkcji grzybów jadalnych lub biomasy drożdży. W takim rozwiązaniu technologicznym celuloza i hemiceluloza są hydrolizowane do monosacharydów, a w hydrolizacie są namnażane drożdże Candida. W porównaniu z melasą lub tradycyjnymi surowcami skrobiowymi surowce ligninocelulozowe są znacznie trudniej przyswajalne przez drobnoustroje syntetyzujące białko i wymagają wstępnego przygotowania, celem uwolnienia celulozy z kompleksów lignino- i hemicelulozowych. Obecnie taka produkcja jest nieopłacalna, nawet metodą hodowli w stałym podłożu (ang. SSF - Solid State Fermentation) z udziałem słomy zbożowej, ryżowej i rzepakowej, plew zbożowych, kaczanów kukurydzy, wytłoków owocowych, trocin, zaliczanej do technologii bezodpadowych.

Technologie drożdży paszowych i piekarskich są podobne, a różnice dotyczą rodzajów drożdży i pożywek oraz metod i warunków suszenia biomasy. Drożdże paszowe są biomasą drożdży niezarodnikujących Candida, Torula i Monilia, szybko rozmnażających się w ubogich pożywkach (heksozy, inne sacharydy, kwasy organiczne, alkohole, aminokwasy), a podstawowymi surowcami do syntezy są melasa, wywar melasowy, serwatka, ługi posulfitowe i substraty niekonwencjonalne (węglowodory, a zwłaszcza n-alkany, alkohole, gaz ziemny).

Drożdże piekarskie są biomasą wybranych ras Saccharomyces cerevisiae namnażaną metodą okresową lub półciągłą w 30°C w kadzi fermentacyjnej z barboterowym systemem napowietrzania lub z wysokosprawnymi systemami napowietrzania (wirnikowy system Vogelbuscha, krajowy system typu SK, samozasysający system wirnikowy firmy Frings) w rozcieńczonych (końcowe rozcieńczenie 1:12-1:25) albo w gęstych (końcowe rozcieńczenie 1:5-1:10) brzeczkach melasowych. Niekiedy jest stosowana metoda zwrotnego wirowania, polegająca na stałym odbiorze i odwirowaniu części brzeczki drożdżowej oraz na zawróceniu mleczka drożdżowego do kadzi i uzupełnieniu ubytku objętości brzeczki nowymi porcjami pożywki, zwiększająca przerób o ok. 50% przy stałym rozcieńczeniu substratu. W większości znanych technologii biomasa drożdży jest oddzielana od pożywki metodą wirowania, przemywana wodą a w przypadku stosowania pochodnych ropy naftowej 3-krotnie ekstrahowana, celem usunięcia potencjalnie rakotwórczych związków benzopirydonowych, i ponownie odwirowywana. Następnie drożdże piekarskie są odwadniane w bębnowych, obrotowych filtrach próżniowych o działaniu ciągłym, formowane i pakowane w warunkach próżniowych lub w atmosferze gazu obojętnego albo suszone w suszarkach tunelowych, bębnowych lub fluidyzacyjnych w temperaturze do 50°C. Drożdże paszowe są suszone w temperaturze ok. 100°C w suszarkach rozpryskowych (rozpyłowych).

Zwiększenie udziału białka mikroorganizmów w żywieniu ludzi wymaga polepszenia strawności i funkcjonalnych właściwości biomasy przez: 1) zniszczenie ściany komórkowej w operacjach autolizy, plazmolizy, dezintegracji mechanicznej, specyficznej hydrolizy enzymatycznej, 2) wyekstrahowanie białka wodą roztworami słabych zasad, kwasów lub soli, 3) usunięcie kwasów nukleinowych. Przyjmuje się, że koszty uzdatniania biomas stanowią 50-80% całości kosztów.

Białko można wydzielić z biomasy natywnych komórek lub po uprzednim zniszczeniu ich ścian komórkowych. Nienaruszone ściany komórkowe utrudniają przenikanie białka i dlatego wydajność ekstrakcji z takich komórek na ogół nie przekracza 50%, nawet po wstępnym działaniu na biomasę związkami zwiększającymi przepuszczalność ścian, np. anionowymi lub kationowymi środkami powierzchniowo czynnymi, rozpuszczalnikami organicznymi lub roztworami niektórych soli nieorganicznych. Ze zdezintegrowanych komórek biomasy białka są wydzielane ze znacznie większą wydajnością i w warunkach sprzyjających jednoczesnemu usuwaniu kwasów nukleinowych. Największa wydajność ekstrakcji białka z biomasy drożdży, do 80-90% związków azotowych, jest uzyskiwana w zasadowym środowisku (pH 11-11,5), w którym udział kwasów nukleinowych jest podobny do udziału w biomasie. Białko jest selektywnie wydzielane z ekstraktu przez ogrzanie przy pH 4,0-4,5 lub po uprzedniej enzymatycznej degradacji kwasów nukleinowych.

Na etapie namnażania drożdży jest możliwe zmniejszenie zawartości kwasów nukleinowych w biomasie do 3,5%, uniemożliwiając bardzo szybki rozwój populacji (np. antybiotykami) lub prowadząc proces początkowo w pożywce bogatej w substrat, a następnie w warunkach głodu substratowego. Duża część kwasów nukleinowych i produktów ich rozkładu jest usuwana z biomasy metodą selektywnej ekstrakcji rozpuszczalnikami bądź hydrolizy w zasadowym środowisku, bądź pod wpływem endogennych lub dodanych nukleaz. Ekstrakcja komórek drożdży mieszaniną metanolu i amoniaku, a następnie wodą w 55°C w czasie 20 min zmniejsza zawartość kwasów nukleinowych w s.s. biomasy do 1%. Dobre rezultaty zapewnia ekstrakcja drożdży mieszaninami metanolu lub etanolu i kwasu solnego, a także wodnymi roztworami kwasu solnego lub chlorku sodu. Niekorzystnym skutkiem ekstrakcji rozpuszczalnikami są straty białka, które zależnie od rodzaju biomasy i warunków procesu osiągają 20-30%.

Ekstrakcja komórek drożdży roztworami NaOH o pH > 10 sprzyja hydrolizie RNA, ale jednocześnie wywołuje niepożądane zmiany chemiczne reszt aminokwasów w białku oraz pogarsza jego właściwości odżywcze i funkcjonalne. Najczęściej stosowaną metodą otrzymywania białka o małej zawartości kwasów nukleinowych jest ekstrakcja stężonymi roztworami zasad w ok. 60°C, a następnie jego wytrącenie w środowisku kwaśnym. Zastosowanie wewnątrzkomórkowych nukleaz wymaga wzbudzenia ich aktywności, najczęściej przez krótkotrwałe ogrzanie do 60-80°C i inkubację biomasy w temperaturze 45-60°C. Szok termiczny uwalnia rybonukleazy z wakuoli zniszczonych ogrzewaniem bądź inaktywuje labilne białkowe inhibitory enzymu. Często ogrzewanie jest poprzedzone zimnym szokiem w temperaturze 0°C albo zawieszeniem komórek w środowisku kwaśnym lub w roztworach EDTA, fosforanów albo chlorku sodu. Niektóre aniony aktywują nukleazy i ułatwiają usuwanie produktów rozkładu kwasów nukleinowych z niezniszczonych komórek. Przydatność zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych rybonukleaz do zmniejszenia zawartości tych kwasów w białku drożdży ograniczają m.in. intensywna proteoliza białka oraz wysokie ceny preparatów enzymatycznych.

Perspektywicznym rozwiązaniem usuwania kwasów nukleinowych zasocjowanych z białkiem drożdży w postaci kompleksu nukleoproteinowego mogą być metody chemiczne. Polegają one na zniszczeniu oddziaływań jonowych głównie między anionowymi grupami fosforanowymi kwasów i kationowymi grupami aminokwasów, np. przez modyfikację anionowych grup RNA lub grup ε-ΝΗ₂ białka. W tym celu kompleks nukleoprotein po dezintegracji komórek i odwirowaniu nierozpuszczalnego materiału ściany komórkowej jest ekstrahowany w środowisku o pH 8,5-9, a następnie destabilizowany jedną z metod: sukcynylacji bezwodnikiem kwasu bursztynowego, odwracalnej modyfikacji bezwodnikami kwasu cytrakonowego lub maleinowego, sulfitolizy siarczanem(IV) sodu i czterotionianem sodu, fosforylacji tlenochlorkiem fosforu (POCl₃) lub modyfikacji solami chaotropowymi, np. NaClO₄ Białko pozbawione 80-95% kwasów nukleinowych jest wytrącane przy pH 4,0-4,2 (w tych warunkach pH kwasy nukleinowe pozostają w roztworze), odwirowywane, dializowane i suszone metodami konwencjonalnymi.

Otrzymywanie preparatów enzymatycznych

Spośród ponad 150 enzymów stosowanych w przemyśle spożywczym (również do syntezy organicznej i produkcji proszków do prania) największe znaczenie mają enzymy z klasy hydrolaz (głównie amylazy, proteazy, lipazy, poligalakturonazy, celulazy), których wartość produkcji przekracza 80% wartości całej produkcji enzymów.

Podstawowym źródłem enzymów są mikroorganizmy a wydajność produkcji określonego enzymu zależy od:

• predyspozycji wyselekcjonowanych szczepów (udoskonalonych metodami inżynierii genetycznej),

• ich właściwości technologicznych (m.in. temp. optymalnej produktywności, profilu stabilności termicznej, zakresu pH stabilnego działania),

• optymalizacji składu pożywki (źródło C, N, P, itp.)

• warunków hodowli.

Otrzymywanie preparatów enzymatycznych

Spośród ponad 150 enzymów stosowanych w przemyśle spożywczym, ale również do syntezy organicznej i produkcji proszków do prania, największe znaczenie mają enzymy z klasy hydrolaz (głównie amylazy, proteazy, lipazy, poligalakturonazy, celulazy), których wartość produkcji przekracza 80% wartości całej produkcji enzymów. Mikroorganizmy są podstawowym źródłem enzymów, a wydajna produkcja określonego enzymu(ów) zależy przede wszystkim od predyspozycji wyselekcjonowanych szczepów, coraz powszechniej udoskonalonych metodami inżynierii genetycznej, od ich właściwości technologicznych (m.in. temperatury optymalnej produktywności, profilu stabilności termicznej, optymalnego pH, zakresu pH stabilnego działania), optymalizacji składu pożywki (źródło węgla, azotu, fosforu, biostymulatorów, makro- i mikroelementów) i warunków hodowli. Właściwości enzymów można modyfikować pośrednio metodami inżynierii środowiskowej, tj. przez zmianę warunków reakcji umożliwiającą sterowanie selektywnością wydajnością i jej rodzajem (np. kataliza syntezy w mikrowodnym środowisku rozpuszczalników organicznych i płynów nadkrytycznych w przypadku hydrolaz.

Źródłem enzymów są grzyby strzępkowe (rodzaje: Aspergillus, Penicillium, Mucor, Trichothecium), bakterie (rodzaj Bacillus), drożdże (rodzaj Saccharomyces) i promieniowce. Syntetyzowane enzymy mogą pozostawać w komórce drobnoustrojów (wewnątrzkomórkowe enzymy dawniej określane jako endoenzymy) lub są wydzielane na zewnątrz (zewnątrzkomórkowe enzymy dawniej określane jako egzoenzymy). W pierwszym przypadku odzyskuje się je z biomasy, a w drugim z cieczy pofermentacyjnych. Do przemysłowej produkcji są zalecane szczepy wydajnie syntetyzujące enzymy pozakomórkowe, np. hydrolazy - enzymy najbardziej przydatne w przemyśle spożywczym. Szczegóły technologii preparatów enzymatycznych stanowią tajemnicę producentów i są chronione patentami.

Produkcja enzymów obejmuje następujące procesy jednostkowe:

1. Otrzymanie biomasy drobnoustrojów lub cieczy pofermentacyjnej o dużej zawartości określonego enzymu metodą: powierzchniową lub wgłębną (okresową półciągłą lub ciągłą) w ciekłej pożywce bądź w stałym podłożu (ang. SSF - Solid State Fermentation). Najczęściej są stosowane tanie pożywki zawierające produkty uboczne przemysłu rolno-spożywczego.

2. Wydzielanie białek enzymów w postaci kompleksów lub pojedynczych enzymów z biomasy oraz ich oczyszczanie. Wewnątrzkomórkowe enzymy są oddzielane od niebiałkowych związków komórki (głównie łączących się z białkami enzymatycznymi) i od białek nieenzymatycznych, które oddziaływują na ich aktywność (bezpośrednio na enzym bądź na substrat lub produkt reakcji). Nieliczne z nich są stosowane z pominięciem izolowania z komórki i oczyszczania. Do otrzymania preparatów enzymatycznych o dużej czystości wymagane jest zastosowanie 6-12 operacji, po których aktywność specyficzna enzymu wzrasta setki, a nawet tysiące razy, lecz jej straty mogą przekroczyć nawet 90% wskutek inaktywacji pod wpływem ogrzewania, proteolizy, pH środowiska, oksydacji, związków denaturujących, niedoboru kofaktorów i koenzymów. Proteoliza rodzimymi lub pochodzącymi z obcej mikroflory proteazami zachodzi we wczesnych etapach produkcji enzymu, tj. ekstrakcji i oczyszczania. Preparaty enzymatyczne stosowane w przemyśle są oczyszczane w ograniczonym stopniu, co jest możliwe dzięki optymalizacji warunków biosyntezy lub częściej dzięki doborowi wydajnych mutantów otrzymanych metodą inżynierii genetycznej. Zawartość enzymu w nieoczyszczonym preparacie powinna przekraczać 10%. Niektóre preparaty enzymatyczne są stosowane w postaci biomasy (wewnątrzkomórkowe enzymy) lub skoncentrowanej pożywki hodowlanej (zewnątrzkomórkowe enzymy) z dodatkami stabilizującymi aktywność. Najczęściej preparaty enzymatyczne są produkowane w postaci zagęszczonych roztworów lub proszku.

Początkowe operacje wydzielania i oczyszczania enzymów obejmują filtrację, wodne systemy dwufazowe i wirowanie, przy czym dwa pierwsze rozwiązania są przydatne do usuwania zbędnych komórek lub ich resztek, podczas gdy wirowanie - do gromadzenia biomasy. W skali przemysłowej stosuje się wirówki różnych typów, które umożliwiają ciągłe doprowadzenie cieczy pofermentacyjnej, ciągłe usuwanie supernatantu i okresowe, półciągłe lub ciągłe usuwanie biomasy. W okresowym lub półciągłym usuwaniu biomasy jest ona automatycznie spłukiwana wodą lub pożywką co powoduje jej rozcieńczenie utrudniające dalsze przetwarzanie. Koagulanty i flokulanty poprawiają skuteczność wirowania dzięki eliminowaniu ładunków elektrycznych, np. wskutek zmiany pH lub wiązania przeciwnie naładowanych cząstek.

Wewnątrzkomórkowe enzymy są uwalniane z komórek po dezintegracji mechanicznej, rozcieraniu z piaskiem kwarcowym lub ziemią okrzemkową bądź ultradźwiękami. Niektóre komórki są dezintegrowane w łagodnych warunkach (Gram-ujemne bakterie), podczas gdy inne (Gram-dodatnie bakterie, drożdże, grzyby strzępkowe) są bardzo oporne na dezintegrację. Dezintegracja jest prowadzona w środowisku o kwasowości zapewniającej maksymalną stabilność enzymu. Niemechaniczne metody niszczenia komórek (szok osmotyczny, zamrażanie-rozmrażanie, zimny szok, osuszanie, chemiczna liza, enzymatyczna liza za pomocą lizozymu, celulaz, cytaz lub proteaz, autoliza) są atrakcyjnymi i ekonomicznymi rozwiązaniami umożliwiającymi uwalnianie enzymów w łagodnych warunkach. Autoliza jest często stosowana w skali przemysłowej, mimo długotrwałości i potencjalnego zagrożenia zakażeniami mikrobiologicznymi. Enzymatyczna liza prowadzona najczęściej za pomocą lizozymu lub enzymów litycznych drożdży Cytophaga jest kosztowna. Liza roztworami kwasów i zasad, rozpuszczalnikami organicznymi oraz surfaktantami (np. Triton X-100), stosowanymi pojedynczo lub w kombinacji z czynnikami chaotropowymi, np. guanidyną-HCl, jest przydatna do uwalniania enzymów związanych z błoną komórkową. Są to jednak związki kosztowne i trudne do usunięcia z produktu końcowego. Bardzo często różne metody są stosowane łącznie, np. autolizę poprzedza mechaniczne rozdrobnienie lub zniszczenie struktury komórek, a działaniu ultradźwięków lub hydrolaz jest poddawany materiał zamrożony i rozmrożony bądź rozcierany. Rozpuszczalniki organiczne, np. aceton lub etanol, działając na ścianę komórki w niskiej temperaturze, powodują jej destrukcję wskutek odwodnienia. Preparaty enzymatyczne wydzielone acetonem nie tracą aktywności przez długi okres i są przydatne do produkcji enzymów o dużej czystości. Enzymy są stosunkowo łatwo wydzielane z cytoplazmy, w której występują w postaci rozpuszczonej. Większe trudności sprawia ich wydzielenie ze struktur komórkowych, np. jąder, błony komórkowej, mitochondriów, mikrosomów, z których są najpierw uwalniane butanolem, roztworami detergentów (cholan, deoksycholan, sól sodowa siarczanu(VI) dodecylu - Tween) bądź hydrolazami, a następnie ekstrahowane kolejno wodą roztworami buforowymi lub soli obojętnych, rozpuszczalnikami organicznymi (aceton, alkohole alifatyczne) lub ich wodnymi roztworami, niekiedy zaś rozcieńczonymi roztworami zasad lub kwasów, podobnie jak w przypadku zewnątrzkomórkowych enzymów. Ekstrakcja jest prowadzona nadmiarem rozpuszczalnika (od 2 do 10 objętości na jednostkę masy biomasy) długotrwale w niskiej temperaturze (2-5°C) lub przez 2-3 h w 30-45°C. Niepożądana aktywność enzymatyczna jest usuwana przez ogrzewanie w warunkach zależnych od wrażliwości na denaturację i precypitację, a balastowe białka i zanieczyszczenia enzymów (lipidy, sacharydy, kwasy nukleinowe) usuwa się przez zmianę kwasowości środowiska i frakcjonowaną denaturację cieplną w łagodnych warunkach w przypadku termostabilnych enzymów. Białka nieenzymatyczne wytrącone w punkcie izoelektrycznym, np. nukleoproteidy, są odwirowywane, a niezwiązane z białkiem lipidy - łatwo oddzielane dzięki ich nierozpuszczalności w wodzie. Usunięcie lipidów związanych wymaga ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi (eterem, mieszaniną etanolu i eteru) w temp. do -50°C do -60°C, po zamrożeniu lub po termicznym zdenaturowaniu biomasy. Obecne w preparatach wewnątrzkomórkowych enzymów kwasy nukleinowe zwiększają lepkość środowiska i dlatego są usuwane przez strącanie białkiem o zasadowych właściwościach, tzn. zawierającym dużą liczbę grup o dodatnim ładunku (arginina, lizyna), np. protaminą bądź metodami chemicznymi lub enzymatycznymi (hydroliza nukleazami: RNA-azą i DNA-azą). Przydatne do tego celu wytrącanie siarczanem(VI) amonu jednocześnie usuwa inne białka. Bardziej specyficzne związki wytrącające (np. polietylenoimina, siarczan(VI) streptomycyny, siarczan(VI) protaminy), zazwyczaj o dodatnim ładunku, które tworzą kompleksy z ujemnie naładowanymi resztami fosforanowymi kwasów nukleinowych, są drogie, niekiedy toksyczne (zwłaszcza siarczan(VI) streptomycyny) i mogą tworzyć niepożądane kompleksy z niektórymi enzymami. Wytrącanie enzymów przydatne do ich koncentracji w skali przemysłowej, zwłaszcza w początkowym etapie, jest w małym stopniu, w odróżnieniu od metod chromatograficznych, uzależnione od obecności substancji przeszkadzających i może następować albo w punkcie izoelektrycznym, albo w obecności dużych ilości soli, np. siarczanu (VI) amonu lub nadmiaru rozpuszczalników organicznych mieszających się z wodą np. acetonu lub etanolu. Izolowanie białka powinno w minimalnym stopniu powodować jego zmiany denaturacyjne, co wyklucza stosowanie czynników działających drastycznie, m.in. stężonych kwasów i zasad, zbyt wysokich temperatur, niektórych rozpuszczalników organicznych. Wstępne frakcjonowanie homogenatu w celu oczyszczenia i koncentracji enzymów obejmuje najczęściej wysalanie siarczanem(VI) amonu przy odpowiednio dobranych stopniach wysycenia i odwirowanie wytrąconych frakcji w temperaturze ok. 0°C. Alternatywą soli są rozpuszczalniki organiczne (metanol, etanol, propanol, aceton), zmniejszające stałą dielektryczną środowiska i w konsekwencji - rozpuszczalność białka. Ich zastosowanie ogranicza przyspieszona denaturacja białka w wyższych temperaturach. Wodne układy dwufazowe, np. glikolu polietylenowego i dekstranu (roztwór o stężeniu 10% mas. glikolu polietylenowego 4000 i roztwór o stężeniu 2% obj. dekstranu T500), hydroksypropylowych pochodnych skrobi, i solne układy dwufazowe są przydatne do wydzielenia zewnątrzkomórkowych enzymów z cieczy pofermentacyjnej w procesie ciągłej ekstrakcji z zawracaniem faz. Komórki i ich fragmenty, białka oraz inne związki są rozdzielane do dwóch faz w zależności od pH środowiska i jego siły jonowej. Enzymem jest wzbogacana jedna faza, najczęściej górna, a z dolnej zawierającej niepożądane komórki i enzymy, jest on ponownie ekstrahowany solami lub polimerami w nowym układzie dwufazowym. Połączone rozdziały w wodnych układach dwufazowych i powinowactwa (ligandy powinowactwa, np. barwniki triazyny, znacznie zwiększają specyficzność reakcji) są przydatne do dalszego oczyszczania enzymu.

Wydzielone enzymy są najczęściej oczyszczane metodami frakcjonowania rozpuszczalnikami organicznymi lub obojętnymi solami, metodami adsorpcji, chromatografii jonowymiennej i krystalizacji. Frakcjonowanie enzymów rozpuszczalnikami organicznymi (etanol, izopropanol, aceton, metanol, dioksan) jest prowadzone w neutralnym środowisku o małej sile jonowej w temperaturze od -5°C do -20°C. Powszechne jest kilkakrotne frakcjonowanie obojętnymi solami, najczęściej siarczanem(VI) amonu, rzadziej siarczanem(VI) magnezu lub sodu oraz octanem sodu lub magnezu. Koncentraty enzymów są oczyszczane techniką chromatografii: jonowymiennej, powinowactwa i żelowej, zazwyczaj w tej kolejności. Dwie pierwsze umożliwiają szybkie oczyszczanie dużych ilości „surowych" enzymów, ale niższe ceny jonitów przemawiają za ich stosowaniem we wcześniejszym etapie oczyszczania. Jonity polistyrenowe są szczególnie przydatne do oczyszczania enzymów w skali przemysłowej. Metoda chromatografii powinowactwa, wykorzystująca specyficzne interakcje między nimi a immobilizowanym ligandem, którym może być substrat bądź współzawodniczący inhibitor enzymu, bądź barwnik lub przeciwciało, daje możliwość oczyszczenia enzymu kilka tysięcy razy, jednak ze względu na bardzo duże koszty nie jest ona jeszcze powszechna w skali przemysłowej. Uwarunkowania ekonomiczne ograniczają potencjalną przydatność w skali przemysłowej metody chromatografii oddziaływań hydrofobowych realizowanej przy użyciu hydrofobowych adsorbentów z grupami oktylowymi lub fenylowymi, której zaletą jest wyeliminowanie, wskutek silnych interakcji hydrofobowych w roztworach o dużej sile jonowej, odsalania roztworów enzymów. Końcowe oczyszczanie enzymów jest prowadzone relatywnie długotrwałą metodą chromatografii ekskluzji w żelu usieciowanym dekstranami (Sephadex seria G, Sephacryl seria S, Pharmacia Ltd), poliakryloamidami (Biogel seria Ρ, BioRad Ltd), pochodnymi sacharozy (Sepharose CL, Superose, Pharmacia Ltd), mieszaninami poliakryloamid-agaroza (Ultragel AcA, LKB Instrument Ltd), kopolimerami glikol etylenowy-metakrylan (Fractogel HW, Toyo Soda Company-TSK). Metoda żelowa ma najmniejszą wydajność spośród omówionych, a uzyskane rozcieńczone roztwory enzymu muszą być zagęszczone. Bardzo wydajną ale i kosztowną metodą jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (ang. HPLC - High Performance Liquid Chromatography), przydatna jedynie w otrzymywaniu drogich enzymów o dużej czystości. Enzymy można również frakcjonować w roztworach z jonami metali ciężkich (ołowiu, rtęci, cynku, żelaza), najczęściej w połączeniu z innymi metodami, np. z frakcjonowaniem alkoholami lub solami. Niezwiązane jony metali są oddzielane od białek metodami membranowymi (dializa, ultrafiltracja), przez obniżenie pH środowiska lub na kationitach. Największą przyszłość ma selektywna adsorpcja enzymów realizowana techniką kolumnową: pozytywna - gdy enzym jest adsorbowany z roztworu, a balastowe białka w nim pozostają i negatywna - gdy enzym nie jest adsorbowany, a białka zanieczyszczające enzym są „wychwytywane" z roztworu. Odsalanie roztworów enzymów jest prowadzone metodą sączenia na żelach, najczęściej sefadeksach. Zaadsorbowany enzym jest eluowany w środowisku zasadowym (bufory fosforanowe lub boranowe) roztworami o stosunkowo dużym stężeniu wielowartościowych anionów i przy wzrastającym stężeniu eluującego chlorku sodu. Niekiedy eluowanie powoduje stopniowa zmiana pH. Frakcjonowanie enzymów metodą wymiany jonowej polega na oddziaływaniach elektrostatycznych między naładowanymi grupami jonitu i grupami o przeciwnym ładunku znajdującymi się na powierzchni cząsteczek białka. Wiązania te zostają rozerwane w czasie eluowania wskutek zmiany pH eluentu lub zwiększenia jego siły jonowej. W końcowym etapie oczyszczania enzymów stosuje się ich krystalizację, najczęściej z roztworów siarczanu(VI) amonu, rzadziej z roztworów wodnoacetonowych lub wodnoalkoholowych, a niekiedy dodatkowo - rekrystalizację. W przypadku kilku metabolitów o dużym stężeniu należy je rozdzielić, np. ciecz pofermentacyjna po hodowli wgłębnej Streptomyces griseus zawierająca pronazę i streptomycynę jest klarowana fosforanem wapnia, a następnie, w celu adsorpcji antybiotyku, przepuszczana przez kationit karboksylowy o dużym stopniu usieciowania. W kolejnej kolumnie z kationitem karboksylowym o małym stopniu usieciowania następuje sorpcja enzymu, który po wyeluowaniu jest wysalany siarczanem(VI) amonu, wytrącany acetonem i ewentualnie wykrystalizowany.

3. Przygotowanie enzymów do dystrybucji. Często klarowne roztwory zewnątrzkomórkowych enzymów pozbawione większości składników o małej masie cząsteczkowej (sacharydów, soli mineralnych) po zagęszczeniu metodami membranowymi, np. metodą ultrafiltracji lub w wyparce próżniowej o działaniu ciągłym w temp. 28-32°C do postaci syropu o aktywności 4-5-krotnie większej od początkowej i dodaniu substancji ochronnej, są wprowadzane do obrotu handlowego w postaci zagęszczonej. Alternatywą są preparaty enzymatyczne w postaci sproszkowanej.

Oczyszczony i skoncentrowany enzym wymaga standaryzacji aktywności, którą zapewniają: 1) stabilizatory (albuminy osocza, jony metali, sole, polisacharydy, poliole), 2) kowalentna modyfikacja anionami kwasów tłuszczowych i detergentami, 3) immobilizacja. Enzymy otrzymane metodą suszenia sublimacyjnego lub tańszego - rozpryskowego w obecności substancji ochronnych (skrobia, sacharoza, karboksymetyloceluloza, laktoza, inne polielektrolity) są dużo bardziej trwałe niż enzymy w roztworze i dlatego generalnie przechowuje się je w postaci proszku lub kryształów w temperaturze ok. 0°C. Enzymy mogą być stabilizowane właściwymi im substratami lub analogami substratów, które łączą się z centrum aktywnym białka, usztywniając jego strukturę i związkami redukującymi wiązania dwusiarczkowe, np. merkaptoetanolem lub cysteiną oraz substratami i produktami reakcji, innymi białkami (np. balastowymi), koenzymami i specyficznymi inhibitorami, które modyfikują centrum aktywne enzymu, albo wiążąc się bezpośrednio z nim, albo je blokując, albo w inny sposób zmieniając jego stan, np. skrobia i produkty jej hydrolizy stabilizują amylazy, a hydrolizaty białek - proteazy. W czasie oczyszczania enzymów takie składniki są usuwane, co zazwyczaj zmniejsza ich trwałość.

Preparaty farmaceutyczne wymagają wielokrotnej filtracji ekstraktów i wytrącania enzymu rozpuszczalnikami organicznymi, a preparaty o bardzo dużej czystości - dodatkowo selektywnej adsorpcji na żelach lub jonitach i krystalizacji.

Otrzymywanie kwasów organicznych

Zapotrzebowanie na kwasy organiczne otrzymywane metodami biologicznymi będzie systematycznie wzrastało, chociaż są one droższe niż otrzymywane metodami chemicznymi. Jednakże, biorąc pod uwagę dążenie społeczeństwa do ograniczenia udziału „chemii" w żywności, mogłyby one znaleźć nabywcę gotowego płacić wyższą cenę za produkty naturalne.

Otrzymywanie kwasu mlekowego

Surowcami do produkcji kwasu mlekowego są: skrobia ziemniaczana lub zbożowa po scukrzeniu amylazą, sacharoza, glukoza, melasa, serwatka, permeat mleka lub serwatki, ługi posulfitowe. Fermentacja w pożywce zawierającej 10-13% sacharydu, związki azotowe, biostymulatory (kiełki słodowe, niechmieloną brzeczkę słodową, zarodki żytnie i pszenne, autolizaty drożdżowe, wyciągi z fasoli lub wyki) oraz makro- i mikroelementy jest najczęściej prowadzona przez bakterie Lactobacillus, np. L. delbrueckii ssp. bulgaricus), wymagające do wzrostu złożonej mieszaniny aminokwasów, które rozwijają się intensywnie w 50°C, wytwarzając ponad 2% kwasu mlekowego, lub Streptobacterium i Lactococcus rozwijające się w pożywkach z solami amonowymi. W celu utrzymania kwasowości pożywki w granicach pH 5,5-6,0 jest dodawany węglan wapnia (kreda) w ilości stechiometrycznej w stosunku do syntetyzowanego kwasu. Kwasowość można regulować wodorotlenkiem wapnia lub amonu w sposób ciągły, co umożliwia utrzymanie pH na optymalnym poziomie i przyspieszenie fermentacji. W pierwszej dobie odfermentowuje 4-5% sacharydu, reszta zaś stopniowo przy szybkości fermentacji malejącej w kolejnych dniach.

W klasycznej technologii ciecz pofermentacyjna zawierająca 10-12% mleczanu wapnia, związki organiczne i nieorganiczne (nieprzefermentowane sacharydy, białka, sole metali) jest alkalizowana wodorotlenkiem wapnia do pH 9-10, ogrzewana do 80-90°C w celu oddzielenia komórek bakterii, białek, kiełków, zarodków i odbarwiana węglem aktywnym. W roztworze zagęszczonym (do 25% mleczanu wapnia) w wyparce próżniowej jest prowadzona krystalizacja soli. Z kryształów mleczanu wapnia kwas mlekowy jest uwalniany kwasem siarkowym(VI), a po oddzieleniu wytrąconego osadu gipsu w filtrach próżniowych zagęszczany do wymaganego stężenia i oczyszczany. Tę metodę stosuje się rzadko ze względu na duże koszty i trudności w przeprowadzeniu krystalizacji i oddzieleniu osadu gipsu. Kwas mlekowy jest oczyszczany metodą zależną od jakości surowca użytego do fermentacji i jego przeznaczenia. W przypadku tzw. surowców czystych (glukoza, sacharoza) jest stosowane oczyszczanie bezpośrednie, polegające na usunięciu metali ciężkich sześciocyjanożelazianem(III) potasu, sodu lub wapnia i na częściowym odbarwieniu węglem aktywnym. Często smak i zapach kwasu mlekowego polepsza się utleniaczami, np. nadtlenkiem wodoru, a lotne składniki usuwa się sprężonym powietrzem. Natomiast w przypadku surowców nieoczyszczonych lub odpadowych (melasa, serwatka) są wymagane bardziej złożone metody oczyszczania. Techniczny kwas mlekowy jest uzyskiwany w pożywce z melasy, podobnie jak kwas spożywczy, z pominięciem etapu oczyszczania zagęszczonego kwasu, a kwas farmaceutyczny - bądź z kwasu spożywczego po jego zagęszczeniu do 90% i wyekstrahowaniu eterem, bądź z cieczy pofermentacyjnej po dodaniu siarczanu(VI) cynku, odwirowaniu kryształów mleczanu cynku, wydzieleniu kwasu z mleczanu stężonym H₂S0₄ i ekstrakcji eterem. Kwas mlekowy po oddestylowaniu eteru i kilkustopniowej ekstrakcji jest zagęszczany w wyparkach próżniowych. Roztwór kwasu mlekowego po zagęszczeniu do wymaganego stężenia można również oczyszczać metodami: ekstrakcji rozpuszczalnikiem organicznym (np. eterem etylowym) i filtracji na węglu aktywnym po jego oddestylowaniu, przeciwprądowej estryfikacji metodą ciągłą, destylacji (w próżni, pod ciśnieniem atmosferycznym w obecności pary przegrzanej do 230-240°C, przy użyciu pary przegrzanej o temperaturze do 160°C, w 40-80°C strumieniem powietrza o temp. 120-130°C), chromatografii jonowymiennej obejmującej demineralizację cieczy na jonicie w formie wodorowej i rozkład mleczanu wapnia do kwasu lub elektrodializy.

W produkcji kwasu mlekowego z serwatki lub jej permeatu laktoza jest fermentowana w 30-35°C przez mezofile, np. L. lactis. Tradycyjne wydzielanie kwasu z cieczy pofermentacyjnej przez krystalizację mleczanów wapnia lub cynku i jego uwalnianie z mleczanów kwasem siarkowym(VI) jest pracochłonne i dlatego w tej technologii do uwalniania kwasu z mleczanu amonu i absorbowania kationów z pożywki są proponowane kationity o silnie kwaśnych grupach funkcyjnych. Fermentacja laktozy w serwatce lub w permeacie realizowana w procesie okresowym przy użyciu wolnych komórek bakterii mlekowych jest hamowana produktem końcowym, co przyczynia się m.in. do: 1) małego stężenia komórek, 2) małej szybkości tworzenia mleczanu, 3) trudności jego wydzielania z cieczy pofermentacyjnej, decydujących o małej produktywności i dużych kosztach. Mniej pracochłonne, a bardziej produktywne technologie zakładają ciągłe usuwanie metabolitu z cieczy pofermentacyjnej w zintegrowanych systemach fermentacyjno-separacyjnych, np. w membranowym bioreaktorze recyrkulacyjnym (ang. MRB - membrane recycle bioreactor), integrującym fermentację prowadzoną przez L. lactis ssp. bulgaricus i separację biomasy. Takie rozwiązanie sprzyja osiąganiu dużej gęstości komórek, dzięki czemu z po żywki o zawartości 100 g·dm^-3 laktozy uzyskiwano 89 g·dm^-3 mleczanu przy produktywności 22,0 g · dm^-3 · h^-1. Produkt może być usuwany z cieczy pofermentacyjnej w warunkach aseptycznych przez: 1) adsorpcję na węglu aktywnym lub polimerowych żywicach i ciągłe usuwanie adsorbentu nasyconego kwasem mlekowym, np. w reaktorze fluidalnym węgiel aktywny z biofilmem homofermentatywnych bakterii Lactococcus salivarius ssp. thermophilus efektywnie adsorbuje kwas z cieczy, zwiększając produktywność do 12 g· dm^-3 ·h^-1; 2) wymianę jonową z zawracaniem do bioreaktora wycieku po przepuszczeniu cieczy pofementacyjnej z biomasą komórek przez kolumnę jonitową. To rozwiązanie umożliwia intensywny wzrost komórek oraz otrzymanie stężonych roztworów kwasu, wskutek stworzenia mniej inhibujących warunków w ciekłym filmie wokół cząstek jonitu. Kwas mlekowy jest eluowany z jonitu (np. anionitu Amberlite IRA 400 w formie OH^-) w końcowej fazie procesu, dzięki czemu jego produktywność jest ok. 5-krotnie większa w porównaniu z klasycznym procesem okresowym. W rozwiązaniach z okresowym dozowaniem substratu przy zastosowaniu jonowymiennej separacji można osiągnąć do 265 g · dm^-3 kwasu w cieczy pofermentacyjnej. Chociaż jonity ułatwiają szybkie usuwanie metabolitów w postaci jonów, to ich toksyczność wobec bakterii bardzo utrudnia usuwanie produktu in situ. Składniki jonowe cieczy i inne metabolity adsorbowane na jonicie zmniejszają skuteczność oddzielania kwasu, co jest szczególnie niekorzystne w przypadku drogich jonitów; 3) ekstrakcję w układzie ciecz-ciecz, realizowaną bądź przez ciągły przepływ w cieczy pofermentacyjnej rozpuszczalnika, np. alkoholu oleilowego zawierającego 15% aminy trzeciorzędowej lub alkoholu izoamylowego, bądź przez recyrkulację cieczy przez jednostkę ekstrakcyjną z rozpuszczalnikiem do bioreaktora po usunięciu kwasu. Efektywnym rozwiązaniem jest neutralizacja kwasu organicznymi aminami trzeciorzędowymi w kombinacji z ekstrakcją otrzymanych soli chloroformem lub alkoholami bądź przepuszczenie gazowego metanolu przez wodny roztwór kwasu mlekowego, skroplenie oparów i hydrolizę mleczanu metylu do kwasu.

Chociaż w ekstrakcyjnej biokonwersji kwasu mlekowego on-line z ciekłymi membranami na nośnikach zwanej pertractive by conversion osiągnięto 5-krotny wzrost produktywności w porównaniu do metody konwencjonalnej, to mała trwałość fizyczna takich membran wyklucza ich stosowanie w dużej skali. Zaletą metody jest możliwość prowadzenia bioprocesu w stężonych pożywkach.

Nieoczyszczone surowce skrobiowe są wykorzystywane do biosyntezy kwasu mlekowego w dwuetapowym procesie oddzielnej hydrolizy i fermentacji (ang. SHF - Separate Hydrolysis and Fermentation) lub w jednoetapowym procesie jednoczesnego scukrzania i fermentacji (ang. SSF - simultaneous saccharification and fermentation). Większa produktywność kwasu jest osiągana w procesie fermentacji poprzedzonej scukrzaniem (ang. CHF - combined hydrolysis and fermentation), w którym substrat skrobiowy jest hydrolizowany w optymalnej temperaturze (45°C) 10-15 h przed fermentacją prowadzoną przez L. delbrueckii NRRL B-445. Duże nadzieje na przyszłość rokują ligninocelulozy, zawierające ok. 90% celulozy, które po rozdrobnieniu, 1-godzinnej de lignifikacji w temperaturze wrzenia w środowisku kwasu octowego, wody i HCl w proporcji 95:4,8:0,2 (stosunek ciecz-ciało stałe 10:1) i spęcznieniu w 4-proc. wodnym calności.

Problemy związane z produkcją kwasu mlekowego dotyczą: - silnie korozyjnego działania kwasu wymuszającego właściwą jakość materiałów do budowy bioreaktorów, - dużej niestabilności stężonych roztworów mleczanu (powyżej 20%) wynikającej z jego polimeryzacji do cyklicznego dimeru - laktydu lub liniowych polimerów o różnej długości łańcucha - samoistnej estryfikacji mleczanów spowodowanej obecnością grup hydroksylowych i karboksylowych.

Ksantan - Xanthan, guma ksantanowa

Ksantan, czyli guma ksantanowa zbudowana jest z polisacharydów (wielocukrów). Otrzymywana jest w procesie fermentacji cukrów, przy udziale bakterii Xanthomonas campestris. Ksantan jest polimerem, czyli związkiem wielkocząsteczkowym, złożonym z mniejszych jednostek budulcowych, zwanych monomerami. Masa cząsteczkowa ok. 2000 000. W przypadku ksantanu monomerami są: glukoza, kwas glukuronowy, mannoza, zestryfikowane kwasem octowym i pirogronowym. W formie czystej ma postać proszku, najczęściej kremowego, bezwonnego. Guma ksantanowa w wodzie pęcznieje, tworzy z nią kleiste roztwory, o dużej lepkości. Posiada spore właściwości wiążące. W żołądku ksantan pęcznieje, dając uczucie pełności żołądka, co zmniejsza poczucie głodu. Ksantan utrudnia wchłanianie cholesterolu. Peczniejąc ułatwia pasaż treści pokarmowej, regulując wypróżnienia. Ksantan nie tworzy żelu, ale w połaczeniu z mączką chleba świętojańskiego wytwarza elastyczny żel. Guma ksantanowa jest szeroko wykorzystywana w przemyśle spożywczym, kosmetycznym i farmaceutycznym. Dodany do tabletek, pełni rolę substancji wiążącej i zapewniającej stopniowy rozpad tabletki oraz powolne uwalnianie składników czynnych. W produktach spozywczych pełni rolę zagęstnika, np. w jogurtach. W przemyśle kosmetycznym jest stabilizatorem emulsji. Zwiększa lepkość preparatów, np. w pastach do zębów. Istnieje wiele suplementów i leków zawierających ksantan, zalecanych w terapii otyłości i zaburzeń defekacji. W żywności ksantan ma symbol E 415. Dodawany jest do napojów, soków, sosów, produktów mlecznych, zup w proszku, kremów, deserów, lodów i in.

Otrzymywanie ksantanu

W technologii ksantanu syntetyzowanego przez Xanthomonas campestris NRRL B-1459 są wyodrębnione dwa zasadnicze procesy jednostkowe:

1. Biosynteza ksantanu, uwzględniająca przygotowanie inokulum (skosy, hodowla wstrząsana) i fermentację w bioreaktorze (skład pożywki, typ bioreaktora, metoda hodowli, warunki biosyntezy: temperatura, pH, zawartość tlenu rozpuszczonego, mieszanie, kontrola warunków operacyjnych).

Proces jest prowadzony metodą okresową w pożywce z glukozą lub sacharozą (20-40 g · dm^-3), azotem (organicznym lub nieorganicznym) i mikroelementami, w 25-34°C w czasie 40-144 h. Bakterie są namnażane w środowisku o pH 7,0 i przy stosunku C:N większym niż w fazie biosyntezy ksantanu, w której w następstwie wydzielania polimeru z komórki kwasowość środowiska obniża się do pH ok. 5,0. Pożywka jest mieszana z szybkością 200-400 obr/min i napowietrzana (0,3-1,5 dm³ · dm^-1 · min^-1). W drugiej fazie znacznie zwiększa się lepkość cieczy pofermentacyjnej, utrudniając transport tlenu, co wymusza zwiększenie szybkości mieszania do 1000 obr/min celem utrzymania stężenia tlenu powyżej 10% wartości nasycenia.

2. Wydzielanie biopolimeru. Wydzielanie ksantanu z cieczy pofermentacyjnej, zawierającej 10-30 g·dm^-3 ksantanu, 1-10 g· dm^-3 komórek, 3-10 g· dm^-3 niewykorzystanych składników odżywczych i innych metabolitów, jest trudnym i kosztownym procesem poprzedzonym pasteryzacją lub sterylizacją w celu inaktywacji komórek i zwiększenia wydajności biopolimeru. Zbyt wysokie temperatury pasteryzacji są często przyczyną termicznej degradacji ksantanu. Ogrzewanie cieczy pofermentacyjnej w odpowiednich warunkach (80-130°C, pH 6,3-6,9, 10-20 min) zmniejsza jej lepkość, a zwiększa rozpuszczalność ksantanu.

Ze względu na dużą lepkość cieczy jest ona rozcieńczana wodą, rozpuszczalnikami organicznymi (np. alkoholami, ketonami) lub roztworami alkoholu o małym stężeniu bądź ogrzewana i filtrowana przez filtr o wielkości porów 0,45 μm lub wirowana. Ksantan jest wydzielany ze środowiska w wyniku zmniejszenia rozpuszczalności polimeru metodą odparowania lub przy użyciu rozpuszczalników organicznych mieszających się z wodą, np. alkoholi i ketonów o małej masie cząsteczkowej (metanolu, etanolu, izopropanolu, n-butanolu, acetonu), albo wielowartościowych soli, względnie kombinowanego działania tych czynników. Najczęściej do wstępnego wydzielania i oczyszczania ksantanu jest stosowane wytrącanie niższymi alkoholami (np. izopropanolem lub etanolem w stosunku, odpowiednio, 3 i ≥ 6 objętości na 1 objętość cieczy pofermentacyjnej) lub acetonem (w stosunku 3 objętości na 1 objętość cieczy). W reakcji wytrącania ksantanu solami wapnia w środowisku zasadowym, w zakresie pH 8,5-12, solami aluminium lub czwartorzędowymi solami amonowymi powstają nierozpuszczalne sole polimeru, które muszą być przekształcone w rozpuszczalne sole sodu lub potasu. Wytrącanie ksantanu mieszaniną izopropanolu i soli, zwłaszcza dwuwartościowych, skutkuje mniejszym zużyciem alkoholu, np. dodatek NaCl w ilości 1 g · dm ^-3 zmniejsza jego objętość o 50%. Po odfiltrowaniu polimeru lub oddestylowaniu rozpuszczalników ksantan jest przemywany mieszaniną izopropanolu i wody, suszony do zawartości 10% wody w procesie okresowym lub ciągłym w warunkach zmniejszonego ciśnienia lub w środowisku gazu obojętnego, mielony i pakowany w opakowania nieprzepuszczające wody.

Otrzymywanie bioproduktów przy użyciu mikroorganizmów ze zrekombinowanym DNA

Inżynieria genetyczna może być przydatna do konstruowania szczepów efektywnie produkujących obce oraz własne białka i/lub polipeptydy kodowane przez pojedyncze geny. Zastosowanie technologii rekombinowanego DNA w procesach mikrobiologicznych, których końcowy produkt nie jest białkiem, ale powstaje w wieloetapowym szlaku metabolicznym z udziałem kilku lub kilkunastu
enzymów, np. w biosyntezie aminokwasów lub antybiotyków, jest bardzo złożone. Szczególnie trudne jest klonowanie genów biosyntezy antybiotyków, w której obok problemów z konstruowaniem „superszczepu" występuje problem opracowania dogodnego systemu gospodarz-wektor, zwłaszcza do biosyntezy penicylin i cefalosporyn -metabolitów grzybów. Znacznie łatwiejsze okazało się klonowanie odpowiednich genów w komórkach promieniowców, gdyż są one zlokalizowane obok siebie w jednym lub w dwóch miejscach genomu.

Najczęściej biorcą genów są komórki E. coli, mają one jednak wady technologiczne wynikające z braku dobrze rozwiniętych mechanizmów sekrecji białka i gromadzenia metabolitów białkowych we wnętrzu komórki w postaci granul (białek inkluzyjnych) lub w przestrzeni peryplazmatycznej. Produkt biosyntezy jest wówczas niejednorodny, nieaktywny i trudny do oczyszczenia z enterotoksyn bakteryjnych. Przykładem handlowych produktów wytworzonych przy udziale E. coli zawierających zrekombinowany DNA są: insulina, interferony α-2a, α-2b oraz β, ludzki hormon wzrostu, szczepionki Coli. Bakterie laseczki siennej B. subtilis z uwagi na zdolność wydzielania białek z komórki (obecność układu transportu białek na zewnątrz błony cytoplazmatycznej) mogą zastąpić E. coli, umożliwiając większą produktywność obcych białek oraz otrzymywanie ich w natywnej formie rozpuszczalnej. Ograniczeniem możliwości stosowania tych bakterii są: mała stabilność strukturalna wektorów, niedokładna ekspresja wprowadzonych genów obcych oraz wytwarzanie i wydzielanie do pożywki proteaz hydrolizujących produkowane białka. W zastępstwie zaproponowano inne bakterie (rodzaje: Bacillus, Brevibacterium, Clostridium, Lactobacillus, Pseudomonas, Serratia), promieniowce (Streptomyces) oraz grzyby wydzielające metabolity białkowe poza komórkę.

Korzystniejsze efekty otrzymano, wykorzystując drożdże S. cerevisiae, które nie tylko wydzielają białko do pożywki, ale są również wyposażone w systemy ich glikozylacji. Transformanty S. cerevisiae są stosowane do produkcji:

• antygenów wirusowych (antygenów wirusa zapalenia wątroby typu B, grypy, wścieklizny, HIV),

• hormonów (czynników wzrostu, β-endorfiny, insuliny),

• cytokin (interferonów, interleukiny 2),

• enzymów (chymozyny, karboksypeptydaz, lipaz, celulaz, lizozymu, proteazy HIV, tkankowego aktywatora plazminogenu - tPA),

• inhibitorów enzymów.

Otrzymywanie antybiotyków

Antybiotyki są naturalnymi metabolitami komórek drobnoustrojów. Informacja genetyczna niezbędna do biosyntezy antybiotyków jest naturalnie zakodowana w komórce, chociaż często antybiotyki izolowane z pożywki są później modyfikowane chemicznie. Wszystkie antybiotyki naturalne, jako tzw. metabolity drugorzędne, są syntetyzowane przez żywą komórkę, jednakże nie uczestniczą w dalszych szlakach metabolicznych, stanowiąc swojego rodzaju produkt uboczny metabolizmu komórek. W przeciwieństwie do białek, których synteza jest związana ze ściśle określonym genem, wytworzenie antybiotyku warunkuje wiele genów. Stąd zmiana struktury jednego genu metodami inżynierii genetycznej rzadko powoduje ilościowe i jakościowe zmiany produktywności szczepu. Zwykle biosyntezą jednego antybiotyku steruje od 10 do 30 genów. Dodatkową trudnością w manipulacjach genetycznych producentów antybiotyków jest brak precyzyjnej znajomości szlaków metabolicznych ich biosyntezy.

Otrzymywanie antybiotyków obejmuje następujące etapy produkcyjne:

1) wstępną hodowlę wyselekcjonowanych drobnoustrojów w odpowiednich pożywkach w skali laboratoryjnej i półtechnicznej,

2) biosyntezę w bioreaktorach przemysłowych,

3) izolowanie i oczyszczanie za pomocą procesów fizykochemicznych oraz nadanie bioproduktowi wymaganej postaci farmaceutycznej.

Największe znaczenie praktyczne w produkcji antybiotyków mają promieniowce, zwłaszcza z rodzaju Streptomyces, oraz grzyby z rodzajów Penicillium, Aspergillus, Cephalosporium, Fusarium.

---