Gospodarka azotowa

N w tkankach roślinnych - do 6% suchej masy.

Składnik aa, nukleotydów, bierze udział prawie we wszystkich reakcjach biochemicznych zachodzących w żywych organizmach, jego niedobór - częsty czynnik ograniczający tworzenie nowych tkanek.

Metabolizm N ściśle związany z metabolizmem C, ponieważ szkielety molekularne, do których N wbudowywany i energia potrzebna do tych procesów- z metabolizmu C.

I. Przemiany azotu w roślinach

1. Pobieranie N

N₂ (którego w atmosferze jest około 78%) jest formą dla roślin niedostępną.

Głównymi formami N dostępnymi są NO₃^- i NH₄⁺.

Z energetycznego punktu widzenia jony amonowe korzystniejsze - bo N już zredukowany i nie trzeba wydatkować energii na jego redukcję, jak to jest w przypadku azotanów. Ale dla roślin i tak najważniejszym źródłem N jest azotan.

Kilka słów wyjaśnień dlaczego azotan:

Istotny czynnik ułatwiający pobieranie jonów azotanowych - właściwości sorpcyjne gleby. Koloidy ilaste obecne w glebie wiążą kationy amonowe, natomiast aniony azotanowe pozostają w roztworze glebowym - są więc łatwiej dostępne.

Azotan reguluje aktywność enzymów asymilacyjnych - zatem to podwyższone stężenie tego jonu będzie prowadzić do zwiększenia aktywności enzymów włączających N, natomiast zwiększone stężenie amoniaku - nie.

Duże stężenie amoniaku może być toksyczne dla roślin.

W czasie pobierania amonu następuje znaczny spadek pH gleby, większość roślin źle to toleruje.

Poza tym w większości gleb amon jest szybko i tak utleniany do azotanu przez bakterie chemosyntetyzujące (Nitrosomonas i Nitrobacter).

Azotan pobierany jest na zasadzie transportu aktywnego, co wiąże się z wydatkowaniem energii, stąd w słabo przewietrzanych glebach i w niskiej temperaturze (niekorzystnie wpływa to na oddychanie) mogą wystąpić trudności z pobieraniem azotanów.

2. Asymilacyjna redukcja azotanów

Redukcja azotanów poprzedza ich właściwą asymilację, czyli redukcyjną aminację 2-oksokwasów (α-ketokwasów). 8 elektronowa redukcja, wymaga dużej ilości energii. Proces dwustopniowy.

Pierwszy etap - redukcja azotanu do azotynu.

Reduktaza azotanowa (NR) w cytoplazmie (roślina może mieć więcej niż jedną)

(u większości roślin jest to enzym, którego ekspresja indukowana obecnością azotanów, choć np. u roślin motylkowatych - występują także konstytutywne reduktazy)

Typowym donorem elektronów dla NR jest NADH (choć wykryto także w glonach i w korzeniach traw enzym mogący wykorzystywać NADH lub NADPH. W ogóle w korzeniach odkryto jeszcze co najmniej dwie, zupełnie inne reduktazy zdolne do redukcji azotanów, choć niektóre np. prawdopodobnie redukują azotan do NO).

NR: homotetramer zawierający po jednej cząsteczce FAD, hemu (cyt b₅₅₇) i molibdenopteryny w każdej z 4 podjednostek. Jak przenoszone są elektrony przez ten łańcuch kofaktorów?

(NR - może występować też jako homodimer)

Rośliny pozbawione Mo nie są zdolne do przyswajania azotanów, bo reduktaza nie ma wszystkich kofaktorów (również hodowanie roślin na pożywce z wolframianem powoduje, że wolfram jest wbudowywany do reduktazy zamiast Mo i powstaje nieaktywny enzym)

NR jest jednym z niewielu enzymów roślinnych, których ekspresja jest regulowana egzogennym substratem. Rośliny posiadające indukowalną NR (a nie posiadające konstytutywnych) mają ten enzym tylko wtedy, gdy azotan jest obecny w podłożu. Azotan musi być także stale obecny, by poziom NR był utrzymywany na stałym poziomie, gdyż ten enzym ulega szybkiej degradacji. W wielu typach komórek kation amonowy jest represorem syntezy NR. Aktywność enzymu jest regulowana przez światło (powiązania z systemem fitochromowym (?) ja osobiście czytałam o regulacji poprzez fosforylację enzymu i jego wiązanie z innym białkiem, które zmienia jego aktywność, są także inne mechanizmy) Konieczność ścisłej regulacji NR jest ważna, ponieważ enzym ten tworzy azotyn, który jest dla komórki w większych stężeniach toksyczny (reaguje m.in. z hemem, aminokwasami, zasadami azotowymi) i musi być natychmiast przekształcany „dalej” do amonu przez kolejny enzym - reduktazę azotynową. Reduktaza azotynowa jest z kolei uzależniona od działającego łańcucha transportu elektronów (o czym później) i po ustaniu fotosyntezy - przestaje działać. Konieczne jest zatem wtedy natychmiastowe wyłączenie NR , żeby nie produkowała więcej azotynu, gdy niemożliwa jest natychmiastowa dalsza redukcja tegoż azotynu.

Wracając do samej NR- działa ona u części gatunków zarówno w pędach jak i w korzeniach a u części gatunków albo w pędach albo w korzeniach. Rośliny cienioloubne mają tendencję do redukcji azotanu w korzeniach, światłolubne - w liściach. Mogą występować różne izoformy enzymu. Stężenie NR jest w korzeniach pszenicy większe niż w pędach, ale aktywność NR w pędach 500x przewyższa aktywność enzymu z korzeni.

Drugi etap - redukcja azotynu do amonu

Reduktaza azotynowa (NiR) - kompletna redukcja azotynu do amoniaku

Jako donor elektronów do redukcji wykorzystuje ferredoksynę. Zredukowana ferredoksyna powstaje w wyniku działania fotosyntetycznego łańcucha transportu elektronów, dlatego też redukcja azotynów jest zależna od światła. W tkankach fotosyntetyzujących NiR występuje w chloroplastach.

W tkankach niefotosyntetyzujacych - w plastydach, zredukowana Fd ulega redukcji przez NADPH wytwarzany w oksydacyjnym szlaku pentozowym (u grzybów donorem elektronów zamiast Fd jest bezpośrednio NADPH).

NiR ma bardzo duże powinowactwo do azotynu i kilka a nawet kilkanaście razy większą aktywność od NR, co zapewnia szybką i wydajną redukcję produkowanego przez NR azotynu.

3. Asymilacja właściwa

Czyli włączanie do aminokwasów.

Głównym mechanizmem asymilacji azotu jest tzw. cykl GS-GOGAT - w ten sposób odbywa się przyswajanie co najmniej 90% jonów amonowych. Cykl GS-GOGAT wymaga więcej energii ale enzymy, które go przeprowadzają mają większe powinowactwo do swoich substratów, niż GDH do α-ketoglutaranu. Grupa -NH₂ może być potem przenoszona z Glu na inne α-ketokwasy (pochodzące z metabolizmu węglowodanów) w reakcjach transaminacji - w ten sposób powstają inne aminokwasy.

4. Wydzielanie azotu.

Rośliny oszczędzają swój azot. Tylko w śladowych ilościach mogą wydzielać go w postaci NH₃. Niewielkie ilości aa mogą być wydzielane do gleby przez korzenie. Przed zrzuceniem liści część azotu jest z nich wycofywana. Trochę azotu roślina traci w owocach.

Azot z obumarłych części roślin jest wykorzystywany przez mikroorganizmy, które z powrotem przekształcają go do związków nieorganicznych.

II. Metabolizm azotowy mikroorganizmów

1. Organizmy wiążące N₂

Prokariotyczne organizmy zdolne do wiązania atmosferycznego azotu są bardzo ważnym ogniwem obiegu azotu w przyrodzie.

Wiązanie azotu atmosferycznego polega na jego redukcji, w wyniku której powstają dwie cząsteczki amoniaku. Proces ten jest silnie endoergiczny.

(Azotobacter - na 1g związanego N₂ zużywa 50 g glukozy, Clostridium - bakteria beztlenowa - aż 170 g)

Bakterie brodawkowe - dostarczają roślinie amoniak lub glutaminę, otrzymują związki węgla. Roślina zapewnia im też warunki rozwoju.

Przykłady organizmów zdolnych do wiązania azotu atm.

Organizmy symbiotyczne

- Rizobia: Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Sinorhizobium (symbioza z roślinami motylkowatymi: łubin, wyka, koniczyna) - są najważniejszą grupą, jeśli chodzi o ilość wiązanego N₂, brodawki korzeniowe i w łodydze,

- Frankia (Actinomycetes) (symbioza z np. olchą, drzewami, krzewami rosnącymi na glebach ubogich w azot), brodawki korzeniowe

- Azospirillum (Actinomycetes) trawy tropikalne - nie tworzą brodawek korzeniowych, tylko pozostają na powierzchni korzenia

• symbiotyczne sinice Anabaena (symbioza z Azolla - paproć wodna, Cycas - sagowce)

• roślina tropikalna Psychotria i Klebsiella rubicarum - brodawki liściowe,

Wolnożyjące:

• sinice np. Anabaena, Nostoc

• niektóre inne bakterie fotosyntetyczne: Rhodobacter, Rhodopseudomonas (względne tlenowce) Chromatium, Chlorobium (bezwzględne beztlenowce)

• niefotosyntetyzujące bakterie: Azotobacter (bezwzględny tlenowiec), Klebsiella, Clostridium(bezwzględny beztlenowiec)

Udział w wiązaniu azotu znacznie mniejszy od symbiotycznych.

2. Bakterie brodawkowe

Zdolność do redukcji azotu jest u nich ściśle związana z symbiozą z roślinami motylkowatymi. Przez część cyklu życiowego bakt. brod. żyją w glebie jako saprofity, zdecydowana większość z nich nie ma wtedy zdolności wiązania N₂. Zdolność ta jest uzyskiwana dopiero po wniknięciu przez włośniki do kory pierwotnej korzenia rośliny motylkowej i rozpoczęciu kooperacji z gospodarzem. Do komórek korzenia bakterie dostają się przez tzw. nić infekcyjną utworzoną przez roślinę z materiału ściany komórkowej . Kiedy nić infekcyjna dotrze przez włośnik do pierwszych warstw komórek korzenia, bakterie zostają z niej uwolnione do wakuol zwanych symbiosomami. Po infekcji bakterie dzielą się intensywnie, jednocześnie pobudzając komórki gospodarza do szybkiego wzrostu - powstają brodawki. W symbiosomach bakterie ulegają znacznym zmianom morfologicznym, przekształcając się z pałeczek w nieregularnie rozgałęzione formy zwane bakteroidami. Wniknięcie bakterii rozpoczyna ciąg procesów prowadzących do wiązania N₂ i eksportu. Niezbędnym warunkiem jest wspólna koordynacja ekspresji genów gospodarza i bakterii oraz wymiana sygnałów pomiędzy nimi.

A jak to się zaczyna? Korzenie roślin motylkowych wydzielają do gleby (izo)flawonoidy, które u bakterii indukują ekspresję genów nod, kontrolujących proces tworzenia brodawek. Flawonoidy wydzielane przez różne gatunki roślin imdukują geny nod u różnych grup bakterii (rośliny strefy umiarkowanej np. koniczyna, groch wydzielają luteolinę i naryngeninę indukujące geny u Rhizobium, a soja - ze strefy tropikalnej, wydziela genisteinę i daidzeinę indukujące ekspresję genów u Bradyrhizobium). Prawdopodobnie szlak biosyntezy flawonoidów ulega modyfikacjom w obecności bakterii - skład flawonoidów w korzeniach zmienia się po inokulacji Rhizobium. Geny nod kodują białka odpowiedzialne za syntezę i transport cząsteczek sygnałowych zwanych czynnikami Nod, które inicjują organogenezę brodawek Czynniki Nod są oligosacharydami lipochitynowymi (N-acetylowane chitooligosacharydy), składają się z 3-5 monoacylowanych cząsteczek N-acetyloglukozaminy połączonych wiązaniami β-1,4. Podstawniki w szkielecie cukrowym decydują o specyficzności czynnika Nod względem gospodarza oraz wpływają na jego stabilność i aktywność biologiczną. Potraktowanie korzeni roślin motylkowatych nanomolowymi stężeniami oczyszczonych czynników Nod wywołuje kilka wczesnych reakcji brodawkowania (np. deformacja włośników korzeniowych, utworzenie merystemu brodawki, podziały komórek kortykalnych) - rozpoznanie sygnału Nod wyzwala u roślin tworzenie brodawki.

Synteza Nod - w wyniku ekspresji genów, których ekspresja indukowana flawonoidami. Bakteryjne geny brodawkowania można podzielić na tzw. wspólne - com (common) nod i specyficzne względem gospodarza - hsn (host-specific nodulation) nod. Wspólne nod występują u wszystkich gatunków bakt. brod. - oznacza się je: A, B, C i D. Nod D ulega konstytutywnej ekspresji w symbiotycznych i wolnożyjących bakteriach wiążących N₂ - białko Nod D jest aktywatorem transkrypcji pozostałych genów nod. Białka Nod z różnych gatunków bakterii wykazują bardzo duży stopień homologii, ale mogą oddziaływać tylko z określonymi flawonoidami. Nod D po związaniu flawonoidu ulega aktywacji - i aktywuje transkrypcję Nod A, B i C potrzebnych do syntezy czynników Nod - odpowiedzialne są one za syntezę głównego szkieletu łańcucha cukrowego , geny nod A, B, C znajdują się na dużym plazmidzie Rhizobium lub na „chromosomie” Azo- i Bradyrhizobium. Nod C - łączy monomery N-acetylo-D-glukozaminy, Nod B - odłącza grupę acetylową od nieredukującego końca cukru pozycji R₃, zaś Nod A przyłącza w tym miejscu cząsteczkę kwasu tłuszczowego. Powstały łańcuch ulega dalszym modyfikacjom z udziałem białek stanowiących produkty genów hsn nod. Geny nod E i F decydują o długości łańcucha i stopniu nienasycenia kwasu tłuszczowego. Inne geny hsn kontrolują wprowadzanie do głównego łańcucha cukrowcowego specyficznych podstawników. Spora część z nich modyfikuje pozycję R₁ na redukującym końcu cząsteczki. Czynniki Nod działają w niskich stężeniach (10^-7-10^-12 mola/dm³) i są bardzo specyficzne - stąd postuluje się obecność specyficznych receptorów u roślin. Pierwsze odpowiedzi na sygnał Nod można zaobserwować w komórkach włośników już po kilku minutach. Błona komórkowa ulega depolaryzacji, mniej więcej po 10 min pojawiają się pulsacje cytoplazmatycznego poziomu Ca^2+, po nich następuje reorganizacja cytoszkieletu. W późniejszych stadiach rozwoju brodawki w odpowiedzi na zmniejszanie stężenia tlenu w jej wnętrzu aktywowane są inne klasy genów bakteryjnych: nif i fix. Inne białka kontrolują przebieg infekcji i wiązania N₂.

W najwcześniejszych stadiach symbiozy, zanim dojdzie od wiązania N₂ w epidermie korzeni zachodzi ekspresja wczesnych roślinnych genów nodulinowych ENOD, kodujących białka zwane wczesnymi nodulinami. Noduliny biorą udział w procesie infekcji i morfogenezie brodawek. Najwcześniej aktywowane geny kodujące peroksydazę i białka bogate w prolinę, prawdopodobnie wchodzące w skład ściany komórkowej nici infekcyjnej.. Białka kodowane genami ENOD - wiele różnych funkcji m.in. indukcja podziałów komórkowych, tworzenie zapory tlenowej brodawki zabezpieczającej nitrogenazę przez dostępem tlenu, transport Fe i Mo do bakteroidów. Jest też grupa genów jądrowych ulegających ekspresji dopiero, gdy rozwój brodawki zaawansowany - tuż przed rozpoczęciem i w trakcie wiązania N₂ - tzw. późne geny nodulinowe NOD. Niektóre z powstających transkryptów oddziałują swoiście z komórkami zawierającymi bakteroidy, inne - z niezainfekowanymi. Kodują one leghemoglobinę (charakterystyczne białko brodawki) oraz enzymy (lub podjednostki) katalizujące asymilację wydzielanego przez bakterioidy amoniaku i transport powstających amidów lub ureidów. Rośliny motylkowe strefy umiarkowanej - np. koniczyna, bób - transportują głownie amidy, Gln i Asn. Motylkowate ze strefy tropikalnej - np. fasola, soja- transportują azot w formie ureidów -alantoiny, kwasu alantoinowego i cytruliny. Związki te powstają z puryn, które są syntetyzowane w komórkach zainfekowanych i utleniane w komórkach sąsiednich. Po dotarciu do pędu ureidy są przekształcane z wydzielaniem amoniaku włączanego ponownie do związków organicznych w cyklu GS-GOGAT. Najintensywniejsze wiązanie N₂ - przed okresem kwitnienia gospodarza. Po kwitnieniu - natężenie wiązania słabnie, brodawki rozpadają się a bakterie wydostają się do gleby. Rośliny motylkowate najlepiej poznaną grupą roślin żyjących w symbiozie z bakteriami wiążącymi atmosferyczny azot - ze względu na ich szerokie wykorzystanie rolnicze (zielony nawóz - np. łubin, wyka, koniczyna; pasze), ale są także inne pary - roślina-bakteria (patrz wyżej, na koniec p.1).

Sinice - jeśli rosną na podłożu pozbawionym azotu. Nitkowate Anabaena, czy Nostoc tworzą w regularnych odstępach heterocysty - duże, grubościenne, wyspecjalizowane komórki pozbawione niektórych składników aparatu fotosyntetycznego - PSII) W heterocystach zachodzi wiązanie N₂ z udziałem ATP i związków redukujących powstałych w wyniku fotosyntetycznego transportu elektronów. Sinice mogą być wolnożyjące, ale mogą też wchodzić w symbiozę z różnymi roślinami np. mchami, paprociami i roślinami nasiennymi. Próbowano stworzyć sztuczne układy symbiotyczne, z gatunkami roślin cennymi z rolniczego punktu widzenia, ale nie zakończyło się to powodzeniem.

3. Mechanizm wiązania azotu.

Podobny w różnych organizmach. Specjalny kompleks enzymatyczny - nitrogenaza. Składa się ona z dwóch enzymów, będących metaloproteinami. Obydwa białka udało się oczyścić i scharakteryzować.

Większe białko - zwane dinitrogenazą -lub białkiem MoFe zawiera miejsce redukcji N₂. Heterotetramer - α₂β₂. Łączna masa cząsteczkowa 180-225 kDa w zal. od gatunku. Dwie pary nietypowych klastrów metalosiarkowych - pierwsza z tych par jest silnie związana z białkiem i występuje we wszystkich nitrogenazach - kompleks 8Fe-7S, atomy Fe związane 6 wiązaniami kowalencyjnymi z Cys białka. Druga para klastrów związana z białkiem znacznie słabiej i może ulec oderwaniu. W bakteriach wchodzących w związki symbiotyczne z roślinami np. Rhizobium i Bradyrhizobium - klastry te występują w postaci 1Mo-3Fe-3S i 4Fe-3S i są powiązane ze sobą 3ma dodatkowymi atomami S nieorganicznej. Atom Mo jest połączony z homocytrynianem. Nitrogenaza bakterii symbiotycznych zawsze zawiera Mo - zatem jest on niezbędny do symbiotycznego wiązania N₂. Bakterie wolnożyjące w przypadku braku Mo, mogą go zastępować wanadem lub Fe. Powstające w ten sposób nitrogenazy alternatywne V-nitrogenaza i Fe-nitrogenaza słabiej redukują azot natomiast wytwarzają więcej H₂.

Mniejsze białko - reduktaza dinitrogenazy, zwana też białkiem Fe, jest zbudowana z 2 identycznych podjednostek o masie 30-72 kDa, koordynujących symetrycznie pojedyncze centrum 4Fe-4S. Jego funkcją jest wiązanie ATP i dostarczanie elektronów dinitrogenazie.

Do działania dinitrogenazy konieczna obecność ATP i Mg²⁺.

Jak wygląda cykl pracy nitrogenazy?

1. Białko Fe przyjmuje elektrony od zredukowanej Fd lub flawodoksyny (Fld)

2. Następnie tworzy kompleks z dwoma Mg²⁺ i dwoma ATP.

3. W tej postaci tworzy kompleks z białkiem MoFe i przekazuje mu elektrony. Redukcja białka MoFe jest sprzężona z hydrolizą związanego ATP. Białko MoFe ma także związaną w centrum aktywnym cząsteczkę N₂

W dinitrogenazie elektrony najpierw ulegają akumulacji w klastrze żelazowym, a następnie zostają przekazane na klaster żelazowo-molibdenowy. W ten sposób powstaje aktywny enzym zdolny do wiązania i redukcji N₂.

4) redukcja cząsteczki N₂

(dzięki obecności Fe procesy zachodzące w białku MoFe i białku Fe można badać metodami spektroskopowymi - spektroskopią EPR oraz mössbauerowską. In vitro jako czynnika redukcyjnego używa się Na₂S₂O₄ a N₂ można zastąpić acetylenem lub cyjanowodorem - obydwa związki mają wiązanie potrójne. Redukcja acetylenu do etylenu jest reakcja charakterystyczną dla nitrogenazy i służy do oceny jej aktywności zarówno in vitro jak i in vivo).

Potrzebne 8krotne „obrócenie” się cyklu pracy nitrogenazy, by zredukować 1 cząsteczkę N₂. Przez ten czas redukowana cząsteczka jest przytrzymywana w centrum aktywnym.

Wyizolowana nitrogenaza równolegle z redukcją N₂ katalizuje wydzielanie H₂

8H⁺ + 8e^- + N₂ -> 2NH₃ + H₂

W nienaruszonych komórkach wydzielanie wodoru jest zazwyczaj niewielkie, gdyż powstający H₂ jest natychmiast rozkładany w reakcji odwrotnej (H₂ -> 2H⁺ + 2e^-) katalizowanej przez hydrogenazy.

Hydrogenazy różnią się umiejscowieniem w komórkach i należą do 3 odrębnych klas w zależności od składu grup prostetycznych. Zawierają centra: Fe-S, Ni/Fe-S lub Ni/Fe-S/Se. Sinica Anacystis nidulans ma dwie różne hydrogenazy - jedną w tylakoidach a drugą w błonie. Zainteresowanie organizmami zdolnymi do fotosyntetycznej produkcji wodoru - bo się zastanawiają nad wykorzystaniem ich do produkcji energii. Efekty jednak na razie są raczej mierne.

Redukcja N₂ nie może zachodzić w obecności tlenu. Reduktaza dinitrogenazy jest bardzo wrażliwa na tlen - inaktywuje on ją nieodwracalnie w czasie kilkudziesięciu s. Proces wiązania azotu musi się odbywać w warunkach beztlenowych. Organizmy żyjące w warunkach tlenowych np. sinice muszą sobie stworzyć mikrośrodowisko pozbawione tlenu - do tego właśnie „służą im” heterocysty. Sinice nie wytwarzające heterocyst mogą wiązać azot tylko w warunkach beztlenowych.

Anabaena żyjąca w symbiozie z Azolla na polach ryżowych - ok. 80 kg N₂/ha na rok.

Niektóre sinice (np. Gleotheca) rozdzielają czasowo fotosyntezę i wiązanie azotu. Azot wiążą w nocy, gdy fotosynteza nie produkuje tlenu.

Wiele organizmów zarówno symbiotycznych, jak i niesymbiotycznych zmniejsza stężenie tlenu w komórkach bardzo intensywnie oddychając.

Komórki roślin symbiotcznych wytwarzają leghemoglobinę z dużą wydajnością wiążącą tlen (leghemoglobina wykazuje homologię i podobieństwo strukturalne do hemoglobiny. Leghemoglobina nadaje różowy kolor brodawkom zawierajacym bakteroidy. Jego stężenie w cytoplazmie zainfekowanych komórek może być rzędu milimolowego. Postulowane role: leghemoglobina - podwójna rola - kontroluje stężenie wolnego tlenu, chroniąc nitrogenazę ale też ułatwia dyfuzję tlenu z cytoplazmy do oddychających bakteroidów - uczestniczy w dostarczaniu tlenu bakteriom.

W Streptomyces thermoautotrophicus odkryto nowy mechanizm wiązania azotu. Bakterię tę odkryto w glebie okrywającej stosy żarzącego się węgla drzewnego. W wyniku utleniania CO powstaje ponadtlenek utleniany przez oksydoreduktazę ponadtlenkową zawierającą Mn. Przekazuje ona elektrony z ponadtlenku na nitrogenazę. Ta nitrogenaza zawiera klastry FeS i Mo, ale jest niewrażliwa na tlen a także niezdolna do redukcji acetylenu.

4. Przemiany związków azotu prowadzone przez mikroorganizmy glebowe.

Metabolizm azotowy mikroorganizmów (w nawiasach podawana ΔG reakcji w kJ/mol substancji, jeśli ΔG ujemna to mikroorganizmy korzystają energetycznie).

Równania sumaryczne:

Amonifikacja

2CH₂NH₂COOH + 3 O₂ -> 4 CO₂ + 2H₂O + 2 NH₃ (-42,0)

Nitryfikacja

Bakterie nitryfikacyjne to chemosyntetyzujące bakterie czerpiące energię z utleniania amoniaku.

2 NH₃ + 3 O₂ -> 2HNO₂ + 2 H₂O (-15,8) Nitroso-

2HNO₂ + O₂ -> 2HNO₃ (-4,2) Nitro-

Denitryfikacja

Bakterie denitryfikacyjne to bakterie, które w warunkach beztlenowych lub ograniczonego dostępu tlenu przeprowadzają oddychanie z wykorzystaniem azotanów jako akceptorów elektronów w oddechowym łańcuchu transportu elektronów.

C₆H₁₂O₆ + 6 KNO₃ -> 6CO₂ + 3H₂O + 6KOH + 3N₂O (-130,2)

5C₆H₁₂O₆ + 24KNO₃ -> 30 CO₂ + 18H₂O + 24KOH + 12N₂ (-136,1)

Wiązanie azotu

N₂ -> 2N (+ 38,2)

2N + 3H₂ -> 2NH₃ (-3,0)

Reakcje przekształcania związków azotu - w procesach pozyskiwania energii.

Azot organiczny - dostaje się do gleby w postaci szczątków roślinnych i zwierzęcych. Organiczne formy azotu w glebie - zasadniczo niedostępne dla roślin. Jedynym organicznym związkiem azotu, który rośliny mogą przyswajać w znacznych ilościach jest mocznik (rośliny mogą też pobierać z otoczenia śladowe ilości niektórych aminokwasów np. Ala, Asp, wyjątkiem są rośliny z rejonów arktycznych, które są zdolne do pobierania znaczących ilości aminokwasów, w chłodnym klimacie mineralizacja i nitryfikacja przeprowadzana przez organizmy glebowe przebiega zbyt powoli, by „zaspokoić” potrzeby roślin, stąd konieczne było wykształcenie zdolności pobierania związków nie rozłożonych).

Bakterie i grzyby rozkładają związki organiczne np. aminokwasy z wydzielaniem amoniaku (proces amonifikacji).

Amoniak może pozostać w glebie związany w postaci soli amonowych, może także zostać utleniony najpierw do azotynu a potem do azotanu w procesie nitryfikacji przez autotroficzne bakterie glebowe.

Pierwszy etap - utlenianie amoniaku do azotynu przeprowadzają bakterie z grupy Nitroso, a drugi - utlenianie azotynu do azotanu - bakterie z grupy Nitro. Nie ma bakterii zdolnych do przeprowadzania naraz obydwu etapów, stąd obydwie grupy bakterii są od siebie wzajemnie zależne (bakterie Nitro- potrzebują, by bakterie Nitroso- dostarczyły im substratu, z kolei azotyn, jak pamiętamy, jest trujący, więc bakterie Nitroso też potrzebują, by ktoś im tworzony przez nie azotyn usuwał) i występują zawsze razem - zjawisko to nazywamy parabiozą.

Azotan może być ponownie pobrany przez rośliny, ale może też być redukowany do wolnego azotu w procesie denitryfikacji. W warunkach beztlenowych np. słabo przewietrzanych glebach lub ubogich w tlen wodach działają bakterie denitryfikujące - wykorzystujące azotan jako akceptor elektronów w łańcuchu oddechowym. Takie bakterie to np. Thiobacillus denitrificans, Micrococcus denitryficans. Powstałe produkty: NH₄⁺, NO₂^-, tlenki azotu i N₂ - wydzielane do otoczenia.

Nitryfikacja - z jednej strony lotny amoniak przekształcany do łatwo pobieranego przez rośliny azotanu, z drugiej strony jednak intensywna nitryfikacja prowadzi do zanieczyszczania wód gruntowych azotanami. Ponadto to nitryfikacja jest głównym źródłem N₂O emitowanego do atmosfery. Tworzy się on jako produkt uboczny, na skutek niekompletnego utleniania amoniaku. W atmosferze w reakcjach fotochemicznych ulega dalszemu utlenieniu w reakcjach fotochemicznych do NO i NO₂, które niszczą ozon.

Denitryfikatory usuwają azot z gleby, z drugiej strony jednak zapobiegają nadmiernemu gromadzeniu się azotu w oceanach.

5. Inne

N- 4te miejsce ilościowo, do 15% masy białek

Azotan - azot na + V

Amoniak - na -III

Reduktaza azotanowa redukująca azotan do azotynu wymaga dużo energii.

Sole amonowe są nietrwałe i lotne.

Azotyn - nie pobierany z gleby, w większych stężeniach toksyczny.

Molibden w NR jest wykorzystywany ze względu na wielość możliwych stopni utlenienia i liczb koordynacyjnych.

Niedawno odkryto oprócz formy cytoplazmatycznej, formę błonową - udział w redukcji azotu niewielki, za to udział w pobieraniu przez komórki roślinne Fe - ta forma błonowa raczej redukuje Fe z 3+ do 2+. Może regulować procesy transportu różnych jonów.

Pteryny, FAD, hem - absorbują światło niebieskie,

Neurosopra crassa, konidia - reduktaza azotanowa w błonie, regulacja transkrypcji przez substrat - dodanie azotanu 5-100x wzrasta mRNA, światło działa modulująco.

U roślin - aktywność NR regulowana też hormonalnie: cytokiny - pozytywnie, ABA - negatywnie

Regulacja potranslacyjne - fosforylacja, defosforylacja (na Ser, Thr)

Proteoliza - etap regulacji przez endoproteinazy serynowe (NR stosunkowo szybko degradowana)

Są też białkowe inhibitory aktywności NR.

Dużo mniej wiadomo o reduktazie azotynowej.

Dygresja:

Fenyloalanina - substrat do syntezy związków fenolowych: barwniki roślinne - antocyjany, ligniny (polifenole), związki sygnałowe (np. w odpowiedzi na atak patogenu), fitoaleksyny.

Antocjany - objawy stresu abiotycznego - np. chłodem, brakiem substancji mineralnych, zbyt dużym naświetleniem, stresem wodnym, osmotycznym. (koniec dygresji)

Obieg azotu zależy od metabolizmu bakterii.

Niepełna nitryfikacja może prowadzić do powstawania N₂O (częściej) lub NO (rzadziej), tlenki azotu są niekorzystne:

• reakcja z ozonem

• kwaśne deszcze

Nitryfikacja głównym źródłem N₂O wydzielanego do atmosfery (dygresja - N₂O - ilość w atm wzrasta z szybkością 0,2%/rok)

Niepożądany skutek przenawożenia - eutrofizacja, (głownie w lipcu). Do tego dochodzi przenawożenie związkami fosforowymi.

Wiązanie azotu: 90% - biologicznie, 10% - procesy fizykochemiczne (np. wyładowania elektryczne), przemysł.

Wiązanie azotu wymaga bardzo dużo energii i zredukowanych związków pochodzących z oddychania. Azotobacter na asymilację 1 g N zużywa 50 g glukozy a Clostridium - 170 g.

Symbiotyczne bakterie produkują np. glutaminian na eksport a gospodarz dostarcza im cukry. Wzajemna aktywacja genów bakterii i roślin. Rhizobium w glebie żyją saprofitycznie i nie mają zdolności wiązania azotu, uzyskują tę zdolność po wniknięciu do komórek gospodarza.

Czynnik nod oznaczane E do Z są specyficzne dla gospodarza lub mikroorganizmu.

Wnikanie bakterii brodawkowych - nić infekcyjna budowana jest z materiału roślinnego normalnie wykorzystywanego do syntezy ściany, po wniknięciu do komórek bakterie uwalniane do apoplastu, ale nić infekcyjne rośnie dalej i może się dalej rozgałęziać. Na końcu nici tworzone i wydzielane do wnętrza korzenia pęcherzyki infekcyjne zawierające bakterie.

Czynniki Nod aktywują roślinne geny brodawkowania ENOD - wczesne, NOD - późne (bakteryjne czynniki - Nod, roślinne NOD).

Nitrogenaza - kofaktor molibdenowy: Cys, His w miejscu aktywnym, homocytrynian, centrum Fe-S, Mo

Azotobacter hodowany na podłożu bez Mo może zamiast niego wykorzystywać wanad. Azotobacter vinelandii hodowany bez molibdenu i wanadu może syntetyzować nitrogenazę zawierającą TYLKO centra Fe-S - taka nitrogenaza produkuje więcej wodoru.

Szlaki zmiatające wolne rodniki - askorbinianowo-glutationowe.

1

---