Instrukcja do ćwiczenia:

Chromatografia Cienkowarstwowa (TLC)

Wersja listopad 2007

UWAGA: Na ćwiczenia każdy student powinien przynieść: okulary, fartuch, rękawiczki lateksowe, ołówek, linijkę, nożyczki, taśmę klejąca, arkusz papieru kancelaryjnego. Dodatkowo na grupę - płyn do mycia naczyń i ścierkę. Jest to warunkiem przystąpienia do zajęć!!!!!!!!!!

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC - z ang. Thin Layer Chromatography) jest najbardziej popularną metodą szybkiego sprawdzania postępu reakcji chemicznej i czystości produktu. Może być także wykorzystywana do identyfikacji związków zarówno organicznych jak i nieorganicznych. W chromatografii cienkowarstwowej mieszanina substancji jest rozdzielana na poszczególne składniki ze względu na różnice w szybkości ich przemieszczania się na podłożu wykonanym z aktywnego adsorbenta stanowiącego fazę nieruchomą. Poszczególne składniki mieszaniny z różną siła wiążą się z polarnym adsorbentem, a następnie wymywane są z niego rozpuszczalnikiem stanowiącym fazę ruchomą. Im bardziej polarna jest badana substancja, tym silniej wiąże się z fazą stałą i tym trudniej jest wymywana przez eluent. Im bardziej polarny jest eluent, tym więcej polarnych centrów aktywnych fazy stałej jest przez niego blokowane, co zmniejsza „opory” przesuwania się eluowanych substancji. Jako fazy stałe najczęściej stosowany jest żel krzemionkowy, tlenek glinu i sproszkowana celuloza. Podłoże stanowi zazwyczaj szkło, folia aluminiowa lub poliamidowa.

Faza stacjonarna

Żel krzemionkowy

Żel krzemionkowy jest jednym z najbardziej popularnych adsorbentów stosowanych w chromatografii cienkowarstwowej. Jest on otrzymywany przez hydrolizę krzemianu sodu, jego kondensację i polimeryzację w trakcie prażenia. Jego struktura wyglada w przybliżeniu następująco:

Aktywność żelu krzemionkowego zapewniają grupy Si-OH (silanolowe) obecne na jego powierzchni. Wytwórcy kontrolują aktywność na etapie prażenia. Żel stosowany w TLC ma średnicę ziaren w zakresię 5-10 μm. Typy żelu krzemionkowego oznaczane są często w sposób następujący:

Żel krzemionkowy G - zawiera 13% gipsu jako czynnika wiążącego

Żel krzemionkowy H bez środka wiążącego

Żel krzemionkowy F₂₅₄ z fluorescentem

Żel krzemionkowy UV₂₅₄ z fluorescentem

Jako fluorescent zazwyczaj stosowany jest siarczek cynku.

Żel krzemionkowy ma odczyn lekko kwaśny i może być stosowany do rozdziału sterydów, aminokwasów, węglowodorów, tłuszczów, alkaloidów itp.

Tlenek glinu

Aktywność tlenku glinu związana jest z obecnością zarówno atomów tlenu jak i glinu. Metoda produkcji polega na kondensacji uwodnionego wodorotlenku glinu. Może on być

produkowany w trzech odmianach kwasowości powierzchni: formie kwasowej, zasadowej i obojętnej. Zasadowy tlenek glinu z w/w jest najbardziej popularny. Tlenek glinu jest używany do rozdziału sterydów, barwników, witamin i alkaloidów.

Celuloza

Celuloza jest naturalnym polisacharydem zbudowanym z cząsteczek glukozy połączonych wiązaniami β(1,4) glikozydowymi. Płytki TLC pokryte są cząsteczkami celulozy o podobnej

wielkości ziaren, co powoduje regularny przepływ rozpuszczalnika. Celuloza jest stosowana do rozdziału związków hydrofilowych, rozpuszczalnych jonów nieorganicznych i kwasów nukleinowych, które mogą zbyt silnie oddziaływać z tlenkiem glinu lub krzemionką. Oprócz tych typowych sorbentów w chromatografii cienkowarstwowej stosuje się także proszek poliamidowy, modyfikowane celulozy o właściwościach jonowymiennych oraz żele organiczne o właściwościach sit molekularnych np. Sephadex, BioGel P i inne.

Faza ruchoma

Fazę ruchomą stanowią zazwyczaj rozpuszczalniki organiczne. Powinny one być neutralne w odniesieniu do rozdzielanych substancji, wykazywać znaczną lotność par, co znacznie ułatwia osiągnięcie równowagi ciecz-para, i niską gęstość, co przyspiesza usunięcie rozpuszczalnika z powierzchni płytki. W celu określenia siły oddziaływań pomiędzy fazą ruchomą a powierzchnią nośnika wprowadzono parametr siły rozpuszczalnika e⁰. Jest to energia adsorpcji na jednostkę powierzchni standardowego adsorbenta (e⁰ jest równe zero na tlenku glinu eluowanym pentanem). Generalnie, im większe wartości e⁰ tym silniej rozpuszczalnik oddziałuje z powierzchnią adsorbenta i tym łatwiej cząsteczki związku będą się przemieszczały co prowadzi do większej wartości R_f (Warto zauważyć, iż im większa polarność eluenta, tym większe e⁰). Wartości R_f substancji w każdej fazie ruchomej będą zależne od różnicy w wartości siły rozpuszczalnika. Parametr mocy rozpuszczalnika, który może być zmierzony daje szereg elucyjny rozpuszczalników.

Rozpuszczalnik	e^0(Al2O3)	Graniczna przepuszczalność w UV [nm]	Temperatura wrzenia [^oC]
Pentan	0.001	210	36.0
Heptan	0.01	210	98.4
Cykloheksan	0.04	210	81.0
Disiarczek węgla	0.15	380	45.0
Czterochlorek węgla	0.18	265	76.7
Eter diizopropylowy	0.28	220	69.0
Toluen	0.29	285	110.6
Chlorobenzen	0.30	280	132
Benzen	0.32	280	80.1
Eter dietylowy	0.38	220	34.6
Chloroform	0.40	245	61.2
Dichlorometan	0.42	245	41.0
Tetrahydrofuran	0.45	220	65.0
1,2-Dichloroetan	0.49	230	84.0
Aceton	0.56	330	56.2
1,4-Diksan	0.56	220	104.0
Octan etylu	0.58	260	77.1
Octan metylu	0.60	260	57.0
Dimetylosulfotlenek	0.62	270	190.0
Nitrometan	0.64	3809	100.8
Acetonitryl	0.65	210	80.1
Pirydyna	0.71	305	115.5
Izopropanol	0.82	210	82.4
Etanol	0.88	210	78.5
Metanol	0.95	210	65.0
Glikol etylenowy	1.11	210	198.0
Kwas octowy	Bardzo duży	251	118.5

Wykonanie analizy TLC

Badane substancje (10-20 mg) rozpuszcza się w niewielkiej ilości rozpuszczalnika ok. 0.5 ml. Substancja powinna być dobrze rozpuszczalna w zastosowanym rozpuszczalniku, najczęściej stosuje się roztwory w metanolu, acetonie, chloroformie. W przypadku substancji bardzo polarnych np. aminokwasy do roztworu można dodać 1 kroplę wody. Przygotowuje się płytkę chromatograficzną o wymiarach zależnych od ilości substancji jakie zamierza się nałożyć na płytkę. Na przygotowanej płytce zaznacza się przy użyciu zwykłego ołówka punkty, na które następnie nanosi się roztwory substancji badanych, przy pomocy szklanej kapilary, w odległości ok. 0.5 cm od bocznej krawędzi płytki oraz ok. 0.5 cm od spodniej krawędzi. Roztwór nanosi się lekko dotykając powierzchni płytki końcem kapilary(czynność można powtórzyć kilkakrotnie). Dobrze naniesiona substancja tworzy na płytce tzw. „plamkę” o średnicy ok. 2 mm. Po nałożeniu wszystkich substancji płytkę suszy się, a następnie ostrożnie zanurza się dolną krawędzią w roztworze rozwijającym, znajdującym się w komorze chromatograficznej, tak by nie zanurzyć plamek. Komora powinna być umieszczona pod sprawnie działającym wyciągiem. Rolę komory chromatograficznej z powodzeniem spełnia zwykły słoik przykryty szkiełkiem zegarkowym. Dla lepszego nasycenia komory parami rozpuszczalnika, ścianę boczną komory wyściela się paskiem z bibuły. Czoło rozpuszczalnika powoli przemieszcza się po płytce, aż do osiągnięcia linii końcowej tj. ok. 5mm od górnej krawędzi płytki. Wówczas płytkę ostrożnie wyjmujemy z komory. Rozpuszczalnik pozostały na płytce usuwa się za pomocą zwykłej suszarki do włosów. W przypadku związków absorbujących w UV, wizualizację plamek dokonuje się przez włożenie płytki do komory lampy UV, pod warunkiem, że adsorbent znajdujący się na płytce zawiera dodatek fluorescenta. Wtedy na żółto zabarwionej w świetle UV płytce substancje widać jako ciemne plamki. Inna metoda wizualizacji plamek polega na umieszczeniu płytki w komorze jodowej lub krótkotrwałym zanurzeniu w naczyniu z odpowiednim roztworem wywołującym a następnie wygrzaniu płytki w podwyższonej temperaturze (zazwyczaj nie wyższej niż 120 ^oC). Wraz z przesuwaniem się rozpuszczalnika przemieściły się nałożone substancje. Szybkość ich przemieszczania jest ich cechą indywidualną i zależy od ich powinowactwa do podłoża płytki (adsorbcja) i wymywania (desorpcja). W wyniku różnej szybkości migracji poszczególnych substancji w danych warunkach, na płytce chromatograficznej powstaje seria plamek w różnej odległości od linii startowej. Położenie plamek zaznacza się przez lekkie obrysowanie ich krawędzi ołówkiem bezpośrednio po wywołaniu. Następnie obliczamy tzw. współczynnik R_f (współczynnik retencji). Mierzy się odległość środka plamki od linii startowej (w mm) i dzieli przez dystans pomiędzy linią startową i końcową też w mm. Pomiaru i obliczenia R_f dokonuje się dla każdej plamki. Na rys.1 przedstawiono sposób pomiaru R_f.

Rys. 1. Sposób pomiaru i obliczania R_f.

Tabela 4. Roztwory stosowane do wizualizacji substancji na płytkach TLC

Związek chemiczny	Układ wywołujący
Aldehydy alifatyczne	Chlorowodorek hydrazonu 3-metylo-2-benzotiazolinonu
Alkaloidy	Heksachloroplatynian potasu, ninhydryna
Antybiotyki	Ninhydryna
Aminokwasy	Ninhydryna
Węglowodany	Roztwór kwasu siarkowego w metanolu
Lipidy	Chlorek antymonu(III), błękit tymolowy, ninhydryna, rodamina B
Kwasy karboksylowe	Zieleń bromokrezolowa
Fenole	Chloranil, kwas fosfomolibdenowy
Terpeny	Kwas fosfomolibdenowy

Dobór rozpuszczalnika dla analizy TLC

Dobór układu rozpuszczalnika opiera się na zasadzie: podobny rozpuszcza się w podobnym. Zazwyczaj wykonuje się kilka prób (zmieniając polarność eluenta), dążąc do osiągnięcia wartości R_f pomiędzy sąsiednimi plamkami przynajmniej 0.1. Przy czym najniższa z plamek powinna przesunąć się z linii startowej przynajmniej o kilka milimetrów.

Wykonanie ćwiczenia

Ćwiczenia składa się z trzech części.

I Wpływ polarności fazy ruchomej na R_f

Z dużej płytki należy wyciąć dwa paski o długości 8 cm i szerokości 1,5 cm. Ołówkiem nanosi się, na każdym z nich, w odległości ok. 10 mm od dolnej krawędzi płytki, punkt startowy. Za pomocą kapilary nanosi się na każdą płytkę kilka mikrolitrów roztworu aminy aromatycznej a następnie, po wysuszeniu, ostrożnie zanurza się dolną krawędź płytki w roztworze rozwijającym. Pierwszą z płytek rozwija się w układzie: heksan:octan etylu (1:1) (roztwór A), drugą: metanol: chloroform:r-r amoniaku (1:1: 0.03) (roztwór C). Gdy czoło rozpuszczalnika osiągnie poziom ok. 5mm od górnej krawędzi, płytkę należy wyjąć z komory, odrysować czoło fali i po wysuszeniu umieścić w komorze jodowej. Po wybarwieniu plamki należy zakreślić ołówkiem a następnie obliczyć R_f.

II Analiza jakościowa - reakcje barwne związków organicznych

Przed tym ćwiczeniem każdy otrzymuje indywidualną próbkę do analizy, zawierającą jedną z substancji: aminokwas, amina aromatyczna, monosacharyd.

Przygotować dwie płytki o wymiarach 2 cm x 1,5 cm.

Na pierwszą nanosimy próbkę aminokwasu oraz otrzymaną próbkę a na drugą monosacharyd oraz otrzymaną próbkę. Płytkę pierwszą wywołuje się przez spryskanie roztworem ninhydryny a następnie wygrzewanie w podwyższonej temperaturze. Aminokwasy wybarwiają się na kolor czerwony do fioletowego. Płytkę z naniesionym monosacharydem wybarwia się przez spryskanie roztworem waniliny i wygrzanie w podwyższonej temperaturze. Monosacharydy wybarwiają się na kolor od zielonego do czarnego. Porównać reakcje barwne wzorców z próbką.

Uwaga: wygrzewanie należy przeprowadzić ostrożnie, zbyt gwałtowne ogrzanie może doprowadzić do ściemnienia całej powierzchni płytki co uniemożliwi obserwację plamek.

III Analiza jakościowa - właściwa analiza TLC

Na płytce o wymiarach 4 x 3 cm zaznaczamy cztery punkty startowe w odległości ok. 0,5 cm jeden od drugiego. Na zaznaczone punkty nanosimy roztwory wzorcowe w kolejności: aminokwas, monosacharyd, amina aromatyczna oraz roztwór próbki badanej. Płytkę umieszczamy w komorze zawierającej roztwór B metanol:chloroform (20:80). Po rozwinięciu, wywołujemy osuszoną płytkę w jodzie. Obrysowujemy powstałe plamki. Obliczamy R_f. Na podstawie względnego położenia plamek i ćwiczenia II należy określić prawdopodobną przynależność związku nieznanego do jednej z trzech klas: aminokwasy, aminy aromatyczne, monosacharady.

Zaliczenie ćwiczenia

Zaliczenie ćwiczenia następuje po poprawnym wykonaniu wszystkich trzech składowych elementów analizy TLC, na podstawie opracowanego sprawozdania (wnioski!!!), oraz pozytywnym napisaniu kolokwium zaliczeniowego.

6

---