Immunologia - prelekcja 19.11.2007

Antygeny zgodności tkankowej - antygeny transplantacyjne

Zaliczamy do nich:

• Antygeny głównego układu zgodności tkankowej (ang. Major Histocompatibility Complex, MHC) czyli produkty genów MHC u człowieka nazywane są HLA (ang. Human Leukocyte Antigen) - są najważniejszymi antygenami zgodności tkankowej.

• Układ KIR (ang. kiler immunoglobulin-like receptor - receptor immunoglobulinopodobny biorący udział w reakcji cytotoksycznej)

• Antygeny grupowe AB0 krwinek czerwonych również działają jako silne antygeny transplantacyjne

• „Słabe” antygeny zgodności tkankowej (ang. minor Histopatocompatibility Complex - mHC) lub nie kodowane przez MHC (np. kodowane na chromosomie Y)

Antygeny MHC/HLA

Występują na niemal wszystkich jądrzastych komórkach ustroju. U ludzi MHC znajduje się na krótszym ramieniu chromosomu 6 (6p21.1-21.3) obejmuje sekwencję 3,8 mln par zasad, co daje 421 genów (252 geny kodowane, 139 pseudogenów) oraz loci mikrosatelitarne. Produkty tych genów to cząsteczki HLA dzielące się na klasy:

• I (HLA-A, B, Cw)

• II (HLA-DP, DQ, DR)

• III (C4A, C4B, Bf, C2, LTB, TNF, LTA)

Dziedziczenie HLA

Jeden zestaw (haplotyp) antygenów MHC kl. I oraz kl. II dziedziczy się w całości od każdego z rodziców zgodnie z prawami Mendla. Allele HLA wykazują kodominujący (współdominujący) sposób ekspresji - wszystkie odziedziczone geny MHC prezentowane są na powierzchni komórki. Dla każdego matczynego i ojcowskiego antygenu kl. I na powierzchni komórki są antygeny kl. I. Dla każdego genu α i β kl. II na powierzchni znajdują się łańcuchy α i β, lecz mogą się one łączyć w cztery różne cząsteczki. Istnieją również geny α i β kl. II kodujące antygeny DP i DQ.

Szansa znalezienia całkowicie zgodnego dawcy wśród:

• Rodzeństwa - w zależności od rodzeństwa posiadanego przez biorcę wynosi p=1-(1-0,35)ⁿ) gdzie n to liczba rodzeństwa.

• Rodziców - mają oni jeden wspólny haplotyp, więc prawdopodobieństwo zgodności w zakresie HLA-A, HLA-B i DRB1 wynosi 2-4,5%, ale będzie mniejsze gdy rodzice są z odległych geograficznie populacji lub różnych grup etnicznych.

• Dzieci

• Innych członków rodziny biorcy - tzw. szerokiej rodziny chorego, ale tylko w przypadku pokrewieństwa małżeństw w rodzinie chorego (p=1-(1-0,0625)ⁿ) lub posiadanie przez chorego przynajmniej jednego częstego haplotypu HLA

Dziedziczenie HLA w populacji:

• Konserwatywne haplotypy - korzystne w generowaniu odpowiedzi odpornościowej przeciwko zespołom chorób

• Nierównowaga sprzężeń - dostosowywanie się układu odpornościowego do zmieniających się układów środowiska - dodatnia, ujemna, bloki haplotypowe.

Oznaczanie/typowanie HLA

Analiza na poziomie białka:

• Typowanie serologiczne - test limfocytotoksyczny wg Terasakiego w modyfikacji NIH (National Institute of Health)

• Metody biochemiczne - swoistość białek HLA na podstawie elektroforezy

• Typowanie komórkowe - mieszana hodowla limfocytów - test blastogenezy (Mixed Lymphocyte Culture - MLC)

Analiza DNA

• Hybrydyzacja („dot blot”, „reverse dot blot”)

• PCR-RFLP - analiza polimorfizmu miejsc restrykcyjnych produktu PCR

• PCR-SSP (sequence specific primers) - metoda swoistych primerów

• SSOP (sequence specific oligonucleotide probes) - metoda swoistych sond oligonukleotydowych

• DNA-RSCA (reference stranded conformation analysis) - metoda konformacji z referencyjną nicią DNA

• SBT (sequence based typing) - metoda sekwencjonowania

Test limfocytotoksyczny wg Terasakiego w modyfikacji NIH (National Institute of Health)

• Dostarcza informacji o swoistości i o ekspresji komórkowej antygenów HLA

• Stosowany do:

• Typowania HLA kl. I

• Wykrywania obecności przeciwciał

• Prób krzyżowych przed transplantacjami narządóW

• Zasada testu: badany limfocyt poddajemy działaniu swoistych przeciwciał przeciwko interesującemu nam antygenowi, po czym działamy na niego dopełniaczem. Jeśli badany antygen znajduje się na powierzchni limfocytu, dopełniacz wywoła w nim perforację, co uwidoczniamy przez dodanie błękitu trypanu, który zabarwia komórkę w razie pozytywnego wyniku testu.

Antygeny grup krwi

• Układy grupowe i korelacje

• Antygeny prywatne i publiczne

• Występowanie Ag grupowych:

• Na białkach błony erytrocyta - antygeny grupowe Rh i Kell występują wyłącznie na powierzchni błon erytrocytów, a Ag innych grup (AB, Lewis, MNS, P) - także na powierzchni innych komórek.

• Na białkach dopełniacza

• Na oligosacharydach połączonych z lipidami i białkami

• Rozpuszczone w osoczu i wydzielinach

• Dziedziczenie genów grupowych

• Immunogenność antygenów zależy od budowy chemicznej i gęstości determinant antygenowych

• Aktywność hemolityczna

• Hemoliza wewnątrznaczyniowa

• Hemoliza zewnątrznaczyniowa

• Alloprzeciwciała:

• Odpornościowe

• Naturalne

• Regularne

• Nieregularne - A₂, A₂B

Reakcja potransfuzyjna - niszczenie erytrocytów dawcy w wyniku hemolizy:

• Bezpośredniej - przyłączenie przeciwciał do erytrocyta, wiązanie dopełniacza, hemoliza

• Pośredniej - przyłączanie przeciwciał do erytrocyta, fagocytoza erytrocytów przez makrofagi i ich niszczenie

Układ AB0 i Rh

	AB0	Rh
Geny	Ramię długie chromosomu 9	RHD i RHCE na krótkim ramieniu chromosomu 1 (1/p34-36)
Allele	H/h, A, B, 0, allele sekrecji Se/se	RhD, RhC/c, RhE/e
Liczba Ag	4	49
Produkty genów	Enzymy - glikozylotransferazy (fukozy, N-acetylogalaktozaminy, galaktozy)	Dwa polipeptydy
Budowa Ag	Na komórkach - glikoproteiny, glikolipidy, w osoczu glikosfingolipidy, w wydzielinach glikoproteiny	Polipeptydy wiążące się z białkami szkieletu erytrocyta
Występowanie Ag	Nierozpuszczalne na erytrocytach i innych komórkach oraz rozpuszczalne u tzw. wydzielaczy w płynach ustrojowych (poza OUN i PMR)	Wyłącznie na erytrocytach
Alloprzeciwciała	Naturalne regularne kompletne nie przechodzące przez łożysko	Odpornościowe przechodzące przez łożysko
Klasa	IgM	IgG1

Geny RHD i RHCE są wysoce homologiczne i zlokalizowane są obok siebie na chromosomie 1p34-36. Osoby Rh(-) nie mają genu RHD, zaś Rh(+) - jedną (heterozygoty) lub dwie (homozygoty) kopie. Różnice eksonów między genami polegają na obecności dodatkowej sekwencji w eksonie 10 genu RHD i pojedynczych zmianach nukleotydów między genami RHD i RHCE.

Oznaczanie grup krwi

• Pobieranie i przygotowywanie krwi do badań serologicznych

• Wykonanie badania na: szkiełkach podstawowych, płytkach szklanych, w próbówkach, w żelu - mikrometody

• Zawsze do jednej kropli surowicy dodaje się jedną kroplę zawiesiny krwinek (pipeta pod kątem 45 stopni)

• Interpretacja wyników - nasilenie aglutynacji wg skali Dunsforda

Mikrometody w diagnostyce immunohematologicznej

• Mikropróbówki mogą być wypełnione:

• Ziarnami szklanymi (BioVuc System Ortho)

• Żelem dekstranowym (DiaMed):

• Serologicznie obojętnym

• Z surowicą antyglobulinową

• Z surowicami diagnostycznymi

• Możliwości oznaczeń:

• Grupy krwi (AB0, antygen D i inne Ag grupowe)

• Wykrywanie alloprzeciwciał

• BTA

• Próba zgodności

• Wykonanie i interpretacja:

• Badaną surowicę i badane krwinki nakraplamy do próbówki

• Inkubacja i wirowanie

• Cienie krwinek nad surowicą - wynik dodatni, krwinki na dole próbówki pod supernatantem z surowicy- wynik ujemny

Wykaz używanych skrótów:

PTA - pośredni odczyn antyglobulinowy

BTA - bezpośredni odczyn antyglobulinowy

PBS - buforowany fizjologiczny roztwór NaCl

LISS - roztwór NaCl o niskiej sile jonowej 0,03mol/l

LEN - odczynnik przygotowany doraźnie: mieszanina LISS i odczynnika papainowego w stosunku 2:1

PEG - glikol polietylenowy

Metody ułatwiające aglutynację erytrocytu:

• Zmniejszenie ładunku ujemnego błony erytrocytu przez trawienie jego błony enzymami

• Zmniejszenie potencjału dzeta błony przez „zagęszczenie” kationów (protamina) wokół erytrocytu

• Zwiększenie zasięgu ramion IgG poprzez chemiczną modyfikację regionu zawiasowego

• Neutralizacja ładunku dodatniego wokół erytrocytu (albumina)

(w poniższej części sporo jest schematów do omawiania, postaram się z grubsza przybliżyć ich treść słownie)

Oznaczanie grup krwi układu AB0

W celu detekcji grupy krwi należy oznaczyć antygeny na badanych erytrocytach poprzez aglutynację z surowicami wzorcowymi anty-A, anty-B i antyA+B, a także alloprzeciwciała w badanej surowicy poprzez aglutynację z krwinkami wzorcowymi grup 0, A1, B, czyli per saldo wykonujemy sześć prób. Jeśli badana surowica reaguje z krwinkami wzorcowymi 0 znaczy to, że są w niej inne alloprzeciwciała nie należące do w/w układu. Nie powinny także zachodzić reakcje pomiędzy badaną surowicą a krwinkami z grupy takiej samej, jak grupa krwinek badanych określona w pierwszej części testu.

Modyfikacja tego testu u noworodka - wykonujemy cztery próby z krwinkami noworodka:

• Surowica wzorcowa antyA

• Surowica wzorcowa antyB

• Surowica wzorcowa antyA+B

• Surowica noworodka lub surowica grupy AB - tu nie powinno być aglutynacji

Grupy krwi układu AB0 i ich odczyny z surowicami/krwinkami wzorcowymi, w teście dolichotest - patrz tabelka z katedry

Oznaczanie antygenu D z grupy Rh

Służą do tego:

• Testy enzymatyczne:

• Bez pośredni test papainowy - metoda szkiełkowa

• Pośredni test papainowy - metoda próbówkowa LEN

• Test antyglobulinowy PTA-LISS

• Metody z użyciem odczynnika monoklonalnego

• Szkiełkowa

• Próbówkowa

• PTA-LISS

• Mikrometody w żelu

• Metody genetyczne (odmiany cz. Rh, ocena ryzyka konfliktu)

Alloprzeciwciała odpornościowe

Wykrywanie (w testach odpornościowych lub mikrometody):

• Metody enzymatyczne LEN

• Metody z użyciem surowic antyglobulinowych

• PTA-LISS

• PTA-PEG

Przygotowujemy sześć prób w środowisku LEN, w 1-4 surowica badana:

• Krwinki wzorcowe 0+CCDee

• Krwinki wzorcowe 0+ccDEE

• Krwinki wzorcowe 0+ ccddeeK

• Krwinki badane

W 5-6 standard anty-D:

• Krwinki wzorcowe 0Rh+

• Krwinki wzorcowe 0Rh-

Przed każdym przetoczeniem krwi wykonujemy próbę zgodności serologicznej, która obejmuje:

• Kontrolę układów AB0 dawcy i biorcy

• Kontrolę antygeny D u biorcy (u dawcy też - o ile biorca jest D-ujemny)

• Wykonanie próby zgodności surowicy biorcy z krwinkami dawcy w teście LEN i PTA-LISS

• Przeprowadzenie badań w kierunku obecności alloprzeciwciał odpornościowych w surowicy biorcy w teście LEN i PTA-LISS

• Weryfikacja wyników badań przy łóżku chorego z zastosowaniem „karty do szybkiej kontroli grupy krwi” lub odczynników monoklonalnych do oznaczania grup krwi układu AB0 produkcji Bioscot Ltd.

Odległe powikłania potransfuzyjne:

Spowodowane odp. immunologiczną na antygeny krwi	Hemoliza
		Choroba „przeszczep przeciw gospodarzowi” (GVH)
		Małopłytkowość
		Immunomodulacja
	Nie związane z odp. immunologiczną	Przeniesienie chorób zakaźnych
		hemochromatoza

Badania serologiczne dawców:

Obligatoryjne:

• Anty HIV 1 i 2 (p24 antygen)

• HBsAg

• Anty-HCV

• Kiła (TPHA)

Dodatkowe:

• Anty-CMV (IgM i IgG)

• Anty-Toxo (IgM i IgG)

• HTLV-1 - nie w Polsce

Immunologia transplantologiczna

Cząsteczki MHC klasy I (HLA-A,B) i II (HLA-DR) mogą być docelowymi antygenami odpowiedzi immunologicznej - są to silne antygeny transplantacyjne, czyli główne Ag rozpoznawane przez organizm biorcy w procesie odrzucania przeszczepu. Cząsteczki MHC II są głównymi Ag odpowiedzialnymi za reakcję przeszczepu przeciw gospodarzowi.

Do głównych ograniczeń transplantacji należą:

• Dostępność narządów

• Dobór antygenowy dawca-biorca

• Brak w krążeniu biorcy przeciwciał przeciwko antygenom dawcy

Wskazania do przeszczepu narządów:

Nerka	Krańcowe statium niewydolności nerek
Serce	Skrajna niewydolność serca
Płuca lub płuca+serce	Nadciśnienie płucne, mukowiscydoza
Wątroba	Marskość wątroby, rak, atrezja dróg żółciowych
Rogówka	Dystrofia, zapalenie rogówki
Trzustka/wyspy Langerhansa	Cukrzyca (typu I)
Szpik kostny	Niedobór immunologiczny, białaczka
Jelito cienkie	Rak
Skóra	Oparzenia

Ustalanie zgodności tkankowej dawcy i biorcy:

• Zgodność w głównych grupach krwi (AB0)

• Erytrocyty są badane ze standardami anty-A i anty-B

• Obecność Ab grupowych w surowicy badanej osoby określa się w teście z krwinkami 0 znanej grupy krwi tj. grupy A i grupy B.

• Typowanie tkankowe w celu określenia HLA

• Próba krzyżowa w celu określenia czy surowica biorcy zawiera przeciwciała przeciwko HLA dawcy (w następstwie wielokrotnych transfuzji, wcześniejszych transplantacji, wielu przebytych ciąż) - można wykonać test limfocytotoksyczności zależnej od dopełniacza z wykorzystaniem limfocytów dawcy jako komórek docelowych dla Ab obecnych w surowicy biorcy

Typy przeszczepów:

• Autograft - z jednej okolicy ciała do drugiej, np. z tułowia do ramienia

• Izograft - pomiędzy osobnikami identycznymi genetycznie np. bliźniakami jednojajowymi lub w obrębie szczepu wsobnego

• Allograft - pomiędzy różnymi osobnikami tego samego gatunku

• Ksenograft - pomiędzy osobnikami różnych gatunków

Fazy odpowiedzi ukł. immunologicznego na obce antygeny:

• Faza indukcji

• Prezentacja antygenu

• Rozpoznanie antygenu

W zależności od czasu trwania odrzucanie przeszczepu może być nadostre, ostre bądź przewlekłe:

Typ reakcji	Czas odrzucania	Przyczyna
Nadostra	Minuty-godziny	Wytworzone wcześniej przeciwciała przeciw dawcy, dopełniacz
Przyspieszona	Dni	Reaktywacja uczulonych limfocytów T
Ostra	Dni-tygodnie	Pierwotna aktywacja limfocytów T
Przewlekła	Miesiące-lata	Różne przyczyny (Ab, KI, wolna reakcja komórkowa, nawrót choroby)

Działanie na przeszczep poprzez:

• Komórkową reakcję cytotoksyczną - limfocyty CD8 aktywowane IL-2 i INF gamma z Th

• ADCC, zmiany lityczne z zamknięciem naczyń - przeciwciała produkowane przez limfocyty B, aktywowane IL-2, 4 i 5, działanie dopełniacza

• Mediatory zapalenia - dopełniacz, działanie monocytów i makrofagów stymulowanych przez TNF beta i IFN gamma

• Efektem odrzucenia nadostrego i ostrego jest martwica, często połączona z masywnym krwotokiem

• W odrzucaniu przewlekłym szczególna rola proliferacji kom. śródbłonka i mięśniówki gładkiej naczyń oraz procesów włóknienia i angiodestrukcji - obrazem są zmiany podobne do miażdżycy tętnic

Konflikt serologiczny matczyno-płodowy

Zachodzi gdy dziecko odziecziczyło po ojcu antygeny grupowe nieobecne na krwinkach matki, a krwinki płodu przedostały się do organizmu matki np. podczas krwawień matczyno-płodowych w okresie ciąży i porodu. Indukuje to wytworzenie przez organizm matki przeciwciał przeciw krwinkom płodu, które podczas kolejnej ciąży przechodzą przez łożysko (IgG) i niszczą krwinki płodu w mechanizmie immunofagocytozy i ADCC. Daje to powikłania w postaci niedokrwistości hemolitycznej noworodków, ciężkiej żółtaczki noworodków oraz uogólnionego obrzęku płodu i łożyska.

Najbardziej immunogennym z antygenów Rh jest antygen D odpowiedzialny za większość przypadków choroby hemolitycznej noworodków (1-5/1000 żywo urodzonych noworodków). Zaraz po nim lokują się antygeny K, c i E. Typowe układy mogące powodować konflikt serologiczny to:

Układ	Ojciec	Dziecko	Matka
Rh	D	D	D
		CDE	CDE	ccddee
	AB0	A	A	0
		B	B	0
Kell	Kell+	Kell+	Kell-
Duffy	Fya	Fya	Fyb
MNSs	S	S	s

Choroba hemolityczna noworodków w układzie AB0 jest wywołana przeciwciałami matczynymi anty-A i anty-B, jest częstsza niż izoimmunizacja Rh, ale ma łagodniejszy przebieg i nie nasila się podczas kolejnych ciąż. Ukłąd gdy matka jest 0 a dziecko A lub B występuje w 15% ciąż, ale tylko w 3% rozwija się ChHN. Hemoliza krwinek zaczyna się w ostatnich tygodniach ciąży i jest słabo wyrażona klinicznie - żółtaczka zwykle w 2 dobie życia, w rozmazie mikrosferocytoza. Niezgodność w układzie AB0 chroni przed immunizacją w układzie Rh - zanim dojdzie do prezentacji antygenów D, C, E płodu limfocytom matki, dochodzi do eliminacji erytrocytów płodu z krwi matki.

Na rozpoznanie ChHN składa się:

• Jakościowe i ilościowe badanie serologiczne przeciwciał we krwi i płynie owodniowym.

• Badanie hematologiczne, ocena stopnia niedokrwistości płodu we krwi pępowinowej pobranej w trakcie kordocentezy

• Badanie USG (ocena wykładników obrzęku płodu, przepływ w tętnicy środkowej mózgu)

• Badanie biochemiczne stężenia bilirubiny w płynie owodniowym poprzez ocenę gęstości optycznej

Profilaktyka konfliktu serologicznego

Podane przeciwciała anty-D blokują determinanty antygenowe na powierzchni erytrocytów, jednak stosowana dawka pozwala na zasłonięcie zaledwie kilkudziesięciu procent antygenu D. Jednak przeciwciała te mogą także stymulować odpowiedź antyidiotypową, hamującą wytwarzanie przeciwciał anty-D, a IgG wiążąc antygen mogą hamować inicjację odpowiedzi humoralnej przekazując sygnał supresyjny limfocytom B poprzez FcγRIIB.

Diagnostyka serologiczna

Bezpośredni test antyglobulinowy (BTA) - erytrocyty chorego opłaszczone in vivo przeciwciałami poddajemy działaniu p/ciał przeciwko ludzkiej IgG, aglutynacja oznacza wynik dodatni. Wykorzystanie diagnostyczne - u noworodków z podejrzeniem ChHN i u chorych z podejrzeniem niedokrwistości autoimmunohemolitycznej (NAIH), a także u biorców krwi w badaniach powikłań poprzetoczeniowych.

Pośredni test antyglobulinowy (PTA) - erytrocyty zdrowego dawcy inkubowane z surowicą chorego poddajemy działaniu p/ciał przeciwko ludzkiej IgG, aglutynacja oznacza obecność p/ciał przeciw krwinkom dawcy i wynik dodatni. Zastosowanie - wykrywanie alloprzeciwciał odpornościowych we krwi ciężarnych oraz biorców i dawców krwi. Modyfikacją testu jest jego wykonanie w środowisku glikolu polietylenowego. Związek ten:

• Wzmacnia reakcję antygen-przeciwciało

• Zwiększa szanse wykrycia śladowych ilości alloprzeciwciał w teście PTA-PEG

• Ułatwia formowanie kompleksów immunologicznych

• Wypiera z roztworu cząsteczki mogące być przyczyną reakcji nieswoistych.

Test wykonujemy jak powyżej w punkcie „Alloprzeciwciała odpornościowe”, z tym że w środowisku PEG.

Myśląc o przeszczepach warto posiadać wiele rodzeństwa, co jest kwestią motywacji i możliwości rodziców chorego.

W takim wypadku zawsze możemy pocieszyć chorego mniejszym prawdopodobieństwem zapadnięcia na choroby o podłożu dziedzicznym, w tym niektóre nowotwory.

Szczególnie skuteczne w populacjach tolerujących szeroko pojęte kazirodztwo

Reklama dźwignią handlu...

1