Immunologia 2.12.2007

Zasady diagnostyki laboratoryjnej zakażeń wirusowych

Podstawowe cechy wirusów

• Małe niezakaźne patogeny

• Posiadają tylko jeden rodzaj kwasu nukleinowego (DNA lub RNA) otoczony białkową osłonką, czasem zawierającą lipidy i węglowodany. Kwas nukleinowy wraz z białkową częścią wirusa to nukleokapsyd. Kwas może mieć dwie nici - np. u retroviridae będących najczęstszą przyczyną biegunek u dzieci do lat 4, lub jedną - np. DNA B19 powodującego nieimmunologiczny obrzęk płodu.

• We wrażliwej komórce kwas nukleinowy wirusa ukierunkowuje replikację i syntezę swoich składników wykorzystując systemy komórki. Uczestniczą w tym enzymy kodowane przez wirusa oraz komórkowe. Wirusy DNA jako miejsce syntezy wykorzystują jądro, wirusy RNA - cytosol.

• Wirusy mogą odpączkowywać od komórki gospodarza tworząc swą osłonkę fosfolipidową z jej błony bądź powodować jej lizę.

• Tylko wirusy osłonkowe są wrażliwe na czynniki fizykochemiczne takie jak ciepła woda z mydłem - powodują one niszczenie otoczki i pozbawienie wirusa zdolności do zakażania.

• W kapsydach podjednostki białkowe mogą być ułożone wg symetrii helikalnej (spiralnej), co daje kształt wydłużony, lub kubiczej (prawidłowego dwudziestościanu) co daje kształt kulisty.

W klasyfikacji wirusów bierzemy pod uwagę:

• Rodzaj kwasu nukleinowego i jego strukturę - ciągłą lub nieciągłą, kulistą lub segmentowaną

• Polarność genomu wirusa

• RNA dodatni - RNA wirusa może służyć bezpośrednio jako mRNA

• RNA ujemny - RNA wirusa musi przejść uprzednio proces odwrotnej transkrypcji, a następnie ponownej transkrypcji z DNA na mRNA

• Symetrię nukleokapsydu

• Występowanie lub brak osłonki lipidowej

Na diagnostykę zakażeń wirusowych ma wpływ:

• Małe rozmiary wirusa

• Jego budowa

• Replikacja wyłącznie we wrażliwych komórkach - wirusy wykazują tropizm w większości wyłącznie do określonego typu komórek. Np. enterowirusy wnikają przez śluzówkę przewodu pokarmowego, a działają zupełnie gdzie indziej.

• Replikacja w dużych ilościach i na ogół w krótkim czasie

• Charakterystyczne dla danego wirusa drogi zakażenia i wydalanie go z organizmu

• Właściwości immunogenne

Pobieranie i przesyłanie materiału

• Dobór materiału - zależy od celu i czasu badania, a także od rodzaju wirusa.

• Miejsce pobrania - różne, zazwyczaj z miejsca procesu chorobowego. Np. endocarditis wywoływane jest przez enterowirusy, więc w celach diagnostycznych pobieramy kał a nie surowicę. Badanie miana p/ciał przeciw enterowirusom nic nam nie da, ponieważ u każdego jest ono wysokie po szczepieniu przeciw polio, które wywoływane jest przez enterowirusa.

• Ilość - materiału musi wystarczyć do bezpośredniego badania wirusologicznego, w przypadku pobierania próbek krwi do badań serologicznych powinny być one zabezpieczone. Pobieramy co najmniej dwie próbki - w okresie ostrym choroby i podczas rekonwalescencji.

• Czas pobrania:

• Przed wystąpieniem objawów klinicznych

• W fazie wczesnych objawów klinicznych - to najlepszy moment do badania na obecność antygenów wirusa lub jego hodowlę, do bezpośrednich badań wirusologicznych lub izolacji wirusa - materiał należy pobrać jak najwcześniej, wtedy wirus występuje w dużych ilościach i nie jest jeszcze związany z przeciwciałami

• W fazie rekonwalescencji

• Po udopornieniu czynnym sztucznym lub naturalnym - sprawdzamy skuteczność szczepienia

• Długi czas po zakażeniu

• Prawidłowe zabezpieczenie próbki do badania

• Wirus jest wrażliwy na zmiany pH i detergenty, nie na temperaturę

• Wirusy są bardzo lotne ! zwłaszcza te z wysuszonego materiału

• Uwaga na rozpad komórek i bakterie - to niszczy wirusa i uniemożliwia diagnostykę

• Czas transportu - powinien być jak najkrótszy.

• Opisać materiał, dołączyć skierowanie

Materiał do badania z izolacją i identyfikacją wirusa:

• PMR (neuroinfekcje, ostre porażenia wiotkie OPW)

• Kał (neuroinfekcje, gastroenteritis - rzadko przy objawach, wyj. adenowirusy 40-41, myocarditis, OPW)

• Wymazy ze skóry i błony śluzowej gardła ( wirusy oddechowe, OPW), spojówek

• Wymazy z dróg rodnych (STI, HSV)

• Krew - bardzo rzadko (okres wiremii jest bezobjawowy)

PMR

• Pobrać do jałowych suchych pojemników, bez podłoża transportowego - trzy próbówki

• Ilość różna - u dorosłych 1 ml

• Materiały do izolacji wirusa przechowujemy:

• Do 12 h w temp. 0 - 4 st. C

• > 12 h - zamrożony - -20 lub -70 st. C

• Zawsze w suchym lodzie (stały CO2)

• Diagnostyka neuroinfekcji - izolacja wirusa, wykrywanie Ag wirusa, lub Ab przeciwko wirusowi w PMR

Kał

• Pobieramy w analogiczny sposób jak PMR

• Ilość ok 4-8 g

• Przechowywanie - analogicznie jak PMR

• Wymazy z odbytu - gdy pobieranie kału jest niemożliwe - bo częstotliwość izolacji enterowirusów z wymazu jest 50% niższa niż z kału, poza tym wymaz jest nieprzydatny do badania w mikroskopie elektronowym w kierunku wirusów wywołujących biegunki.

Podejrzenie poliomyelitis, OPW

• Pobieramy dwie próbki kału od chorego w odstępach 24-48 godzin w pierwszym lub drugim tygodniu od porażenia.

• Pobieramy po jednej próbce od co najmniej pięciu osób z najbliższego otoczenia chorego

• Przesyłamy do zakładu wirusologii PZH - badanie jest bezpłatne dla klinik i szpitali

• Eradykacja polyomielitis - zostanie osiągnięta gdy przestaną być stwierdzane zakażenia, oraz stwierdzony zostanie brak wirusa w środowisku.

Wymazy ze zmian skórnych i nosogardzieli

• Materiał musi zawierać komórki

• Odpowiednie podłoże transportowe:

• Zbiorniczek wypełniony płynnym podłożem z odżywką

• Gąbka z antybiotykami do usunięcia bakterii

• Schłodzić do 4 st. C do transportu w suchym lodzie, NIE ZAMRAŻAĆ !

Krew

• Pobrana podczas wiremii

• W ilości nie mniejszej niż 2 ml, przed przelaniem krwi do próbówki zdjąć igłę żeby zapobiec hemolizie - w antycznych metodach ze strzykawką. W cywilizowanych ośrodkach używamy próbówek próżniowych i specjalnej igły.

• Do próbówki z heparyną w razie pobierania strzykawką

• Do próbówko-strzykawki próżniowej - o tym wspominałem wyżej. Obecnie to standard.

Krew do badań serologicznych

• Czas pobrania - zależy od celu i sposobu badania

• Przed wystąpieniem objawów klinicznych - screening, ustalenie czy doszło do zakażenia

• W czasie wczesnych objawów klinicznych i w fazie rekonwalescencji - określienie czynnika chorobotwórczego, monitorowanie przebiegu choroby.

• Po udopornieniu czynnym sztucznym lub naturalnym - sprawdzamy skuteczność szczepienia, stan uodpornienia

• Długi czas po zakażeniu - w celu rozpoznania zakażenia przewlekłego

• Sposób pobierania

• Krew żylna do suchej, jałowej próbówki lub próbówkostrzykawki bez śrokkór konserwujących i przeciwkrzepliwych, nie zamrażać w lodówce bo będzie hemoliza a taką krew możemy od razu wyrzucić

• Objętość próbówki - zależy od liczby i rodzaju przewidywanych testów serologicznych - nie mniej niż 5 ml na jedno badanie.

Diagnostyka laboratoryjna zakażeń wirusowych

• Ujawnienie obecności wirusa - wyizolowanie, namnażanie, identyfikacja (metody klasyczne)

• Wykrycie antygenu wirusa

• Wykrycie kwasu nukleinowego wirusa - szczególnie wirusy onkogenne

• Ocena odpowiedzi immunologicznej organizmu na zakażenie wirusowe poprzez stwierdzenie w surowicy:

• Pojawienia się swoistych Ab IgM i/lub IgG

• Wzrostu 4x miana Ab dla pary surowic pobranych w okresie ostrym i rekonwalescencji (metody klasyczne serologiczne)

Namnażanie wirusów w:

• Zarodkach ptasich

• Organizmach zwierzęcych

• Wrażliwych komórkach eukariotycznych - najczęściej.

Typy hodowli komórkowej

• Pierwotne - ze świeżo pobranych tkanek

• Półciągłe - ograniczony okres życia (diploidalny zestaw chromosomów - użycie do produkcji szczepionek)

• Ciągłe - ustabilizowane linie komórkowe pasażowane wielokrotnie in vitro w sposób nieograniczony

Najczęściej - linie w tkankach zarodków zwierzęcych lub tkankach nowotworowych; w obu przypadkach są to głównie komórki nabłonka lub fibroblasty.

Klasyczne metody izolacji wirusów - zastosowanie:

• Diagnostyka zakażeń ektowirusami (polio), arbowirusami, herpeswirusami (HSV, CMV)

• Replikacja wirusów szczepionkowych

• Badania epidemiologiczne

• Ocena nowych metod diagnostycznych

Metody wykrywania wirusów w hodowlach komórkowych i zarodkach ptasich

• Mikroskopowo - ocena efektu litycznego / cytopatycznego

• Zmiany degeneracyjne wewnątrz komórek

• Ciałka wtrętowe

• Komórki olbrzymie

• Uszkodzenie warstw komórek

• Makroskopowo

• Metoda łysinkowa - stosowana do wykrywania arbowirusów, wirusów grypy - hodowlę wirusów zalewamy barwionym agarem który nie pozwala im zakażać kolejnych komórek - giną tylko te zakażone tworząc „łysinki”

• Hemaglutynacja - niektóre wirusy mają zimne hemaglutyniny, oceniamy ich wpływ na krwinki, NIE MA TU ŻADNYCH PRZECIWCIAŁ !

• Hemadsorpcja

Obserwacja komórek hodowlanych

• Zmiany cytopatyczne lub liza - już po 48 godzinach (enterowirusy, HSV), po 14 tygodniach dla CMV

• Wirusy replikujące w hodowlach komórkowych nie wywołują efektu cytopatycznego - uwidaczniamy je próbując nadkazić komórki drugim wirusem, np. - zakażone komórki nie są na to wrażliwe. Przykład: różyczka uodparniająca komórki na ortowirusy.

Enterowirusy - lizujące, zaokrąglenie komórki i rozpad, np Er 71 - hodowla komórek nerki małpy zielonej.

Zmiany morfologiczne i degeneracyjne w czasie zakażenia to efekt cytopatyczny. Dotyka on właściwie wszystkich organelli komórki. Dla wirusów specyficzne są tzw. ciałka wtrętowe mogące leżeć wewnątrz jądra lub cytoplazmy, oraz pojawienie się olbrzymich komórek wielojądrowych (syncytia, zespólnie).

Cytopatie - pod mikroskopem:

• Badanie cytologiczne - cytodiagnostyka ginekologiczna

• Koliocyty - HPV

• Barwienie metodą Tzazcha - wirus opryszczki

• Badanie histopatologiczne

• Ciałka wtrętowe, tzw. „sowie oczy” w biopsji nerki - CMV

Identyfikacja namnożonych wirusów:

• Odczyn neutralizacji - dodajemy swoiste przeciwciała i jeśli brak efektu (wirus przestaje działać) w odniesieniu do próby kontrolnej - rozpoznajemy wirusa.

• Hamowanie hemaglutynacji

• Hamowanie hemadsorpcji

• Immunofluorescencja

Metody szybkiej identyfikacji wirusa:

• Mikroskopia elektronowa (diagnostyka gastroenteritis)

• Immunofluorescencja bezpośrednia

• Odczyny immunoenzymatyczne

• Odczyn lateksowy

• Metody genetyczne wykrywania RNA i DNA

Zalety wykrywania wirusa:

• Potwierdzenie zakażenia w jego anatomicznej lokalizacji

• Potwierdzenie zakażenia w przypadku immunosupresji, gdy przeciwciała są nieobecne

• Szybkie rozpoznanie czynnika etiologicznego - umożliwia włączenie swoistej terapii

• Ilościowy PCR - ilościowe określenie wirusa w próbce - wskaźnik do leczenia

• Wykrywanie szczepów opornych na lek

Diagnostyka zakażeń spojówek - adenowirusy

• Wymaz

• Hodowla wirusa, ME, immunofluorescencja

• Test EIA

• PCR

Owrzodzenie rogówki - HSV

• Wymaz

• ELVIS - Enzyme Linked Viral Induced System - preparat odciskowy na szkiełku

Gastroenteritis

• Odczyn lateksowy

• ELISA

• ME - adenowirus typ 41, norawirus, rotawirus

• DNA wirusa

• Co umożliwia:

• Szybkie wprowadzenie leczenia (nawadnianie bez antybiotyków)

• Szybka izolacja osób zakażonych / nosicieli w celu ograniczenia rozprzestrzeniania się zakażeń szpitalnych / epidemii

• Spadek liczny przypadków biegunek nieznanego pochodzenia

Diagnostyka grypy - PZH Warszawa - typ i podtyp wirusa

• Wymazy z nosa, nosogardzieli

• Popłuczyny z gardła

• Aspirat z nosogardzieli

• Popłuczyny oskrzeli

• PMR

• Wysięk z ucha

• Bioptat

• Zarodki - 3 pasaże

• Izolacja

• DIF

• RT-PCR

Szybka diagnostyka grypy

• Zstatflu - wykorzystuje aktywność enzymatyczną wirusowej neuraminidazy (grypa A i B) - rozkład substratu, niebieski precypitat - wynik dodatni

• Nie wymaga stosowania koniugatu znakowanego enzymem

Zakażenia RSV

Szybkie metody	Hodowla	CPE bad. HD
spectRSV	Mixed Cells RMIX Gruczolakorak+kom. płucne	DIF-RSV CPE-RSV

Wykrywanie przeciwciał

• ELISA

• Western blot

• OZH

• Neutralizacja

• Immunofluorescencja bezpośrenia

PNEUMOSLIDE - immunofluorescencja bezpośrednia - jednoczesne wykrywanie Ig (G,A,M) przeciw najczęstszym patogenom dróg oddechowych.

---