Immunologia - prelekcja 29.10.2007

Zastosowanie metod immunodiagnostycznych to:

• Diagnostyka chorób zakaźnych i inwazyjnych

• Ustalanie grup krwi

• Określanie antygenów zgodności tkankowej HLA

• Ocena stanu czynnościowego ukł. odpornościowego

• Oznaczanie poziomu wielu białek w płynach ustrojowych

Techniki immunodiagnostyczne dzielimy na:

• Oparte o reakcje antygen-przeciwciało

• Aglutynacja

• Precypitacja

• Neutralizacja

• Z zastosowaniem znaczników

• Immunomorfologiczne

• Z udziałem dopełniacza

• Immunologii komórkowej

• Ocena poszczególnych subpopulacji komórkowych

Uwarunkowania wyboru testu - zależy on od:

1. Rodzaju materiału:

• Płyn ustrojowy (krew, mocz, limfa, płyn z jam surowiczych, PMR)

• Zawiesina komórek (limfocyty z krwi obwodowej, granulocyty z krwi obwodowej, homogenat tkankowy)

2. Poszukiwanego składnika (antygen, przeciwciało, kompleks immunologiczny) oraz jego występowania (w postaci wolnej lub związanej z komórką lub tkanką)

3. Celu badania - czy określamy obecność poszukiwanego elementu w badanym materiale (metody jakościowe) czy też jego stężenie (metody ilościowe)

4. Spodziewanego stężenia poszukiwanego składnika (od tego zależy czułość metody)

5. Wiarygodności danego testu i jego wartości diagnostycznej

Zasady pobierania materiału

Materiał pobierać należy zgodnie z zasadami aseptyki, czyli przyrządy - w tym nasze ręce - i pojemnki winny być jałowe ;), powinniśmy także pobrać materiał w wystarczającej do badania ilości. Pobieramy go w odpowiednim czasie np. kilka dni po rozpoczęciu infekcji, kiedy zostanie wytworzone odpowiednie miano przeciwciał. Przed wysłaniem do laboratorium powinniśmy również odpowiednio opisać materiał, poprzez dołączenie do niego skierowania.

Pobieranie krwi żylnej

W przypadku pobierania krwi żylnej jednorazowo najczęściej nakłuwa się żyły kończyny górnej, w okolicy zgięcia łokciowego, rzadziej grzbietu dłoni lub przedramienia. Skórę w miejscu planowanego wkłucia badający odkaża np. roztworem alkoholu etylowego. Igła zużyta do nakłucia może być osadzona na strzykawce, wówczas badający pobiera krew przez powolne pociąganie tłoka strzykawki.

Coraz powszechniej stosuje się do pobierania krwi specjalny rodzaj igieł i próbówek próżniowych. Po uzyskaniu potrzebnej ilości krwi (zwykle od kilku do kilkunastu ml), badający uciska miejsce wkłucia wacikiem i szybkim ruchem usuwa igłę z żyły.

Badanie surowicy

Próbówka do której pobieramy krew powinna przez 1-2 godziny przebywać w temperaturze otoczenia. Po wprowadzeniu do niej krwi, odstawiamy próbówkę na 12 godzin do 4 st. C w pionowej pozycji, pozwalając krwi skrzepnąć. Skrzep od ścianek oddzielamy jałową bagietką. Teraz możemy odciągnąć pipetą surowicę.

Jeśli zachodzi taka potrzeba, możemy odwirować próbówkę przy 1-3000 g przez 10 min. a czystą surowicę odciągnąć. Możemy także zamrozić próbkę do temperatury -20 st. C aby zachować ją do późniejszej analizy. Próbki plazmy mogą być również używane do badań serologicznych - w tym celu należy schłodzić krew w kąpieli z lodem i odwirować jak najszybciej. Następnie natychmiast po odwirowaniu oddzielamy plazmę.

W chorobach zakaźnych pobieramy 1 lub 2 próbki krwi (z fazy ostrej i ozdrowieńczej), zarówno do wykonania odczynów klasycznych jak i nowoczesnych.

Badanie krwi pełnej

Krew powinna być pobierana do próbówek z antykoagulantem. Najpopularniejsze środki tego typu to EDTA (sól wapniowo-disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego, wersenian) oraz heparyna. Wybór zależy od charakteru badania, ale najczęściej stosowany jest pierwszy z w/w środków. Krew ostrożnie przenosimy z vacutainer'a lub strzykawki do próbówki z antykoagulantem i mieszamy delikatnie 2-3 razy, mieszając antykoagulant z krwią.

Izolacja limfocytów z krwi obwodowej w gradiencie Ficoll-Uropolina i test „E” rozetkowy

Limfocyty z krwi obwodowej możemy izolować z krwi obwodowej w gradiencie mieszaniny Ficollu z Uropoliną o ciężarze właściwym 1077 poprzez odwirowanie:

• Do próbówki wirowniczej dodajemy 2 mg gradientu Ficoll-Uropolina o c.w. 1077

• Nawarstwiamy heparynizowaną krew w objętości 1-3x większej niż gradient

• Wirujemy przez 20 min. z szybkością 2800 obr/min.

• Po zebraniu osocza ostrożnie odciągamy kożuszek komórek z interfazy i umieszczamy w próbówce z 1 ml płynu Hanksa

• 2x po 5 min przepłukuje się w wirówce komórki płynem Hanksa w obj. ok. 3 ml z szybkością 1000 obr/min.

Test rozetkowy wykorzystuje fakt, że limfocyty T posiadają na swojej powierzchni receptory dla erytrocytów barana CD2. Tymocyty tworzą trwałe rozety w temperaturze 4 st. C jak i 37 st. C, natomiast limfocyty T krwi obwodowej - tylko w 37 st. C. Po inkubacji obu typów komórek dochodzi do połączeń między nimi, w wyniku czego tworzą się tzw. rozetki. Prawidłowa ilość limfocytów we krwi obwodowej wynosi 60-80% w teście odczytywanym po 18 godz. Obniżone wartości (38±10%) obserwujemy w chorobie nowotworowej, chorobach wirusowych, chorobach wątroby, stanach pooperacyjnych, zawale serca.

Odporność swoista

Typ odpowiedzi

Każda odpowiedź swoista indukuje powstanie obu typów odpowiedzi - zarówno humoralnej jak i komórkowej (CMI), jednak decydującą rolę w skutecznej eliminacji antygenu odgrywa najczęściej tylko jedna z nich. Np. w przypadku prątków, Riketsji czy Chlamydii efektywna jest tylko CMI, odpowiedź humoralna pozostaje bez znaczenia. To, który typ odpowiedzi odegra większą rolę zależy od:

• Typu Ag

• Obecności cytokin podczas stymulacji Ag

• Genetycznego uwarunkowania układu odpornościowego

• Czynników środowiskowych

I tak stymulacja endogennym antygenem i/lub obecność interleukin IL-12, IL-18 lub IFN gamma powoduje stymulację Th1 i wywołanie odpowiedzi komórkowej CMI, natomiast stymulacja egzogennym antygenem i/lub obecność IL-4 czy IL-10 powoduje stymulację Th2 i wywołanie odpowiedzi humoralnej.

Odporność komórkowa

Skierowana jest głównie przeciw antygenom położonym w błonach komórkowych. Jest ona szczególnie efektywna w usuwaniu komórek zakażonych wirusami lub bakteriami wymagającymi w swym cyklu życiowym obecności komórki gospodarza (wewnątrzkomórkowymi), a także niektórymi grzybami i pierwotniakami, oraz niszczeniu komórek nowotworowych. Odgrywa także ważną rolę w procesie odrzucania przeszczepu. Odporność komórkowa nabyta jest rodzajem odpowiedzi nie angażującej przeciwciał. Odporność komórkowa chroni organizm poprzez:

• Aktywację antygenowo swoistych cytotoksycznych limfocytów T (CTLs)

• Aktywację makrofagów i komórek NK (LGL)

• Stymulację komórek do wydzielania licznych cytokin, które nie wpływają na funkcje innych komórek zaangażowanych w procesy odporności wrodzonej i nabytej.

Dojrzewanie limfocytów T

Dzieli się ono na cztery fazy, w zależności od eksponowanych przez tymocyty markerów. Wyjściowymi komórkami są zlokalizowane w korze grasicy tymocyty potrójnie ujemne CD4-CD8-TCR-. Po kontakcie z grasiczymi APC zaczynają one eksponować receptor TCR oraz markery CD4 i CD8, po czym przechodzą selekcję pozytywną: nadal ujemne komórki zostają zabite, a do rdzenia grasicy. przechodzą już komórki podwójnie dodatnie CD4+CD8+. Zbyt łatwe wiązanie limfocyta T z komórką mogłoby jednak doprowadzić do autoimmunizacji, tak więc podwójnie dodatnie komórki podlegają selekcji negatywnej, która pozostawia już dwa różne typy komórek: CD4+ lub CD8+. Te zaś przekształcają się w „naiwne” (nie mające za sobą kontaktu z antygenem) limfocyty dojrzałe CD4CD45RA oraz CD8CD45RA.

Dojrzałe limfocyty T charakteryzują się markerami TCR, CD2 (złożonym z 4 transmembranowych peptydów γ, δ, ε i ζ,), CD3 oraz CD4 lub CD8. Dwa rodzaje TCR: TCR αβ i TCR γδ dzielą tą pulę na limfocyty T αβ i T γδ. Te ostatnie stanową ok. 5% limfocytów krwi obwodowej.

W przeciwieństwie do receptorów komórek B, które mogą wiązać się bezpośrednio z epitopami antygenów, TCR większości limfocytów T może rozpoznawać jedynie epitopy prezentowane przez własne komórki gospodarza za pomocą cząsteczek MHC. Limfocyty CD4 rozpoznają MHCII, natomiast limfocyty CD8 - MHCI.

Limfocyty CD4 pełnią funkcje pomocnicze. Th2 omagają limfocytom B przekształcić się w komórki plazmatyczne oraz w procesie przestrajania klas. Th1 pomagają limfocytom CD8 przekształcić się w aktywowane cytotoksyczne T limfocyty, a także aktywują makrofagi, odpowiedzialne m. in. za likwidację zakażeń prątkami.

Aktywacja limfocyta T4:

Jest to proces wymagający dwóch sygnałów. Pierwszy z nich to połączenie się TCR z epitopem, i CD4 z MHCII komórki APC. Drugi natomiast to połączenie się cząsteczek kostymulujących CD40 i B7 na APC z odpowiadającymi im ligandami CD154 i CD28 na limfocycie T. Cząstki kostymulujące syntetyzowane są jedynie wówczas, gdy receptory typu Toll na APC połączą się z cząstkami strukturalnymi drobnoustrojów (PAMP). Jest to dodatkowy mechanizm zabezpieczający TCR limfocyta T przed rozpoznawaniem peptydu „swojego” zamiast „obcego” na MHC II komórki APC. Bez interakcji cząsteczek kostymulujących limfocyt T4 nie będzie aktywowany i będzie podlegał apoptozie.

Powierzchniowe molekuły zaangażowane w interakcję komórek CD4 i APC (tzw. synapsa immulonogiczna):

Po aktywacji limfocyty T4 muszą mnożyć się tworząc duże klony identycznych komórek dla dostarczenia wystarczająco dużej ilości limfocytów niezbędnych do skutecznej odpowiedzi odpornościowej przeciw antygenowi. Aktywowane limfocyty pomocnicze T4 (helper) produkują interleukinę IL-2 i odpowiadający jej receptor IL-2R. IL-2 wiąże się z IL-2R na pomocniczym limfocycie T4 umożliwiając mu proliferację i tworzenie dużego klonu pomocniczych limfocytów T4. Aktywne limfocyty T4 podlegają zależnemu od antygenu różnicowaniu do komórek Th1 lub Th2.

Komórki prezentujące antygen APC - zaliczamy do nich:

• Komórki dendrytyczne DC, dzielące się na

• DC1 - mieloidalne - należą do monocytów, prezentują antygeny limfocytom Th1

• DC2 - plasmacytoidalne - prezentują antygen limfocytom Th2

• Komórki Langerhansa skóry (myeloidalne)

• Makrofagi

• Limfocyty B

Jak komórki dendrytyczne DC wpływają na limfocyty T, i jak te ostatnie dogadują się między sobą.

Stymulacja antygenami i/lub cytokinami powoduje, że z komórki DC0 powstają dwie klasy komórek dendrytycznych, DC1 i DC2. Obydwie klasy stymulują limfocyty pre-Th poprzez prezentację im antygenu, powodując powstanie odpowiednio Th-1 i Th-2. Na różnicowanie pre-Th w kierunku Th1 wpływają także IL-12, IFN gamma, IL-18 oraz IFN alfa/beta, natomiast na różnicowanie w kierunku Th2 - IL-4. Obie klasy limfocytów pomocniczych produkują cytokiny; w przypadku Th1są to IL-2, IFN gamma i TNF beta, hamujące różnicowanie się pre-Th w kierunku Th2. Th2 zaś produkują IL-4, IL-5, IL-10 oraz IL-13, z czego IL-4 i IL-10 hamują różnicowanie się pre-Th do Th2.

Podstawą różnicowania Th1 i Th2 jest wzorzec wydzielanych przez nie cytokin, różny dla obu typów limfocytów.

Limfocyty Th1

Rozpoznają antygeny prezentowane przez makrofagi. Rozpoczynają i nasilają odporność komórkową poprzez wydzielanie w/w cytokin (IL-2, IFN gamma, TNF alfa). Wydzielana przez nie IL-2 łączy się także ze swoistym receptorem na aktywowanych limfocytach T8, co umożliwia im proliferację i utworzenie dużego klonu identycznych limfocytów T8.

Limfocyty Th2

Rozpoznają antygeny prezentowane przez limfocyty B. Produkują takie cytokiny jak IL-4, 5, 9, 10 i 13, które promują produkcję przeciwciał, jak również umożliwiają aktywowanym limfocytom B mnożenie się, różnicowanie do komórek plazmatycznych, wydzielanie i przełączanie klas przeciwciał. Produkowana przez komórki Th2 IL-4 hamuje również wydzielanie IL-2 i INF gamma przez komórki Th1, natomiast IL-10 blokuje produkcję chemokin przez limfocyty T8.

Różnicowanie się limfocytów T

Po stymulacji antygenem i/lub chemokinami limfocyty T proliferują, a powstałe komórki potomne opuszczają obwodowe narządy limfatyczne i migrują do tkanek, gdzie kontynuują odpowiedź przeciw antygenowi tak długo, jak długo jest on obecny w zaatakowanym organizmie.

Niektóre limfocyty różnicują się do krążących komórek pamięci T4 i T8, a także do supresorowych komórek T8. Krążące komórki pamięci T4 i T8 pozwalają na znacznie szybszą i silniejszą produkcję limfocytów T cytotoksycznych i cytokin podczas zetknięcia się z tym samym antygenem. Supresorowe komórki T8 mogą pomagać w wyłączeniu zarówno komórkowej jak i humoralnej odporności, prawdopodobnie niszcząc aktywowane komórki T i B poprzez zaprogramowaną śmierć - apoptozę. Proces ten może być indukowany tak przez interakcję FasL/Fas (opis w dalszej części), jak i przez pozbawienie limfocytów T koniecznej cytokiny - interleukiny 2 (IL-2).

Limfocyty T8

Posiadają na swojej powierzchni cząsteczkę CD8 oraz receptory TCR o unikalnej swoistości. Receptory te we współpracy z cząsteczkami CD8 rozpoznają epitopy peptydów, zwykle 8-9 aminokwasowych, pochodzące z antygenów endogennych. Przyłączone są one do cząsteczek MHC I wytwarzanych przez wszystkie komórki jądrzaste. Antygeny endogenne utworzone w obrębie ludzkich komórek to:

• Białka wirusowe wyprodukowane podczas replikacji

• Białka bakterii namnażających się wewnątrzkomórkowo, takich jak Rickettsia i Chlamydia

• Antygeny komórek nowotworowych

W uaktywnianiu limfocytów CD8 szczególnie skuteczne są komórki dendrytyczne. Aktywacja limfocytów CD8 prowadzi do wytworzenia na nich receptora dla IL-2. Jest ona produkowana przez limfocyty pomocnicze T4 (Th1) i jest konieczna do namnażania i różnicowania się limfocytów T8.

CD8 biorą udział w zabijaniu komórek zakażonych wirusami i nowotworowych, a także alloprzeszczepów komórek. Mogą one także hamować produkcję Ig przez limfocyty B, opóźnioną nadwrażliwość (DTH, typ IV) oraz odpowiedź komórkową CMI.

Limfocyty CD8 posiadają także na swojej powierzchni receptor CTLA4, który może wiązać się z cząsteczką CD80/86 na powierzchni komórki APC, wyzwalając mechanizm aktywacji negatywnej, czyli apoptozy klonu komórek CD8.

Superantygeny

Enterotoksyny gronkowca złocistego oraz toksyny paciorkowcowe łączą się z częścią zmienną łańcucha beta receptora TCR oraz zewnętrzną częścią cząsteczki MHC-II, przez co powodują niekontrolowaną produkcję cytokin, przede wszystkim IL-1, IL-2 oraz IL-6, co prowadzi do wstrząsu septycznego.

Zwykle aktywacja obejmuje 0,0001 - 0,1% całej populacji limfocytów T, podczas gdy przy aktywacji superantygenem wartość ta może sięgać nawet 20%.

Efektorowe T limfocyty

Efektorowe CD4 Th1 wpływając na makrofagi biorą udział w DTH i stymulują fagocytozę endogennych antygenów, podczas gdy Th2 wpływając na limfocyty B stymulują produkcję przeciwciał. Efektorowe CD8 zabijają zakażone lub zmienione nowotworowo komórki, po czym oddysocjowują i atakują kolejną komórkę.

Mechanizmy działania odporności komórkowej - zalicza się do nich:

1. Aktywacja swoistych antygenowo cytotoksycznych komórek T (CTL) zdolnych do niszczenia komórek organizmu posiadających na swojej powierzchni epitopy obcych antygenów bądź nieprawidłowe. Proces ten może zachodzić dzięki degranulacji ziarnistości wewnątrzkomórkowych zawierajacych perforyny, granzymy i chemokiny, jak również przez mechanizm FasL/Fas.

2. Aktywacja makrofagów i komórek NK, umożliwiająca im niszczenie patogenów wewnątrzkomórkowych.

3. Stymulacja komórek do wydzielania szerokiego wachlarza cytokin, wpływających na funkcjonowanie innych komórek zaangażowanych w procesy wrodzonej i nabytej odpowiedzi odpornościowej

Ad. 1 CTL

Ziarnistości wewnątrzkomórkowe

TCR i CD8 komórek CTL łączy się z kompleksem MHC-I / epitop na powierzchni komórki zakażonej wirusem, następuje przekazanie sygnału przez cząsteczkę CD3, co powoduje uwalnianie mediatorów - perforyn wzmagających przepuszczalność błon zakażonej komórki. Prowadzi to do jej obumarcia. Granzymy zaś aktywują kaspazy - enzymy kierujące apoptozą zakażonej komórki. Kaspazy są proteazami niszczącymi cytoszkielet i rozpuszczającymi komórkowe nukleoproteiny.

FasL/Fas

Komórki CTL posiadają na swej powierzchni cząsteczkę FasL (Fas ligand) która może oddziaływać na receptory Fas znajdujące się na powierzchni wielu rodzajów komórek. Połączenie FasL/Fas wyzwala wewnątrzkomórkową transdukcję, prowadzącą do zniszczenia białek cytoszkieletu zakażonej komórki oraz rozbicia jej chromatyny.

Śmierć poprzez apoptozę nie powoduje uwalniania zawartości zakażonych komórek takich jak mediatory zapalenia lub wirusy, co ma miejsce w przypadku lizy. Zamiast tego komórka rozpada się na fragmenty - ciałka apoptotyczne posiadające ligandy dla receptorów fagocytów - usuwane później w procesie fagocytozy. Redukuje to odpowiedź zapalną i zapobiega uwalnianiu wirusów, które zgromadzone w obrębie zakażonej komórki mogą po uwolnieniu się z niej infekować zdrowe komórki. Ponieważ CTL nie ulegają zniszczeniu w tym procesie, mogą one niszczyć kolejne zakażone komórki.

Ad. 2

Makrofagi

Interleukina IL-2 oraz IFN gamma wytwarzane przez limfocyty Th1 aktywują makrofagi, umożliwiając im niszczenie wewnątrzkomórkowych patogenów. Aktywowane makrofagi wydzielają szereg cytokin, z których najważniejsze to:

• IL-1 - działanie lokalne: aktywuje śródbłonek, aktywuje limfocyty, prowadzi do lokalnego zniszczenia tkanki, zwiększając dostęp komórek efektorowych do niej, działanie ogólne: gorączka, produkcja IL-6

• TNF alfa - działanie lokalne: aktywuje śródbłonek, zwiększa przepuszczalność naczyń co zwiększa przenikanie IgG, dopełniacza oraz komórek efektorowych, a także wzmaga drenaż limfatyczny tkanki, działanie ogólne: gorączka, mobilizacja metabolitów, wstrząs

• IL-6 - działanie lokalne: aktywuje limfocyty do zwiększonej produkcji przeciwciał, działanie ogólne: gorączka, zwiększenie produkcji białek ostrej fazy

• IL-8 - lokalny czynnik chemotaktyczny przyciągający neutrofile, bazofile i komórki T do miejsca infekcji

• IL-12 - aktywuje komórki NK, wzmaga przekształcanie się T limfocytów CD4 do komórek Th1.

Komórki NK

Ich aktywacja zachodzi dzięki IL-2 wytwarzanej przez Th1, IL-12, 15, 18, 21 oraz interferonom alfa i beta. Komórki NK posiadają dwa receptory: receptor aktywujący zabijanie (killer-activating receptor) umożliwiający NK zabicie komórki do której przylega, oraz receptor hamujący zabijanie (killer-inhibitory receptor). Ten ostatni rozpoznaje cząsteczki MHC-I obecne na prawidłowych jądrzastych komórkach ludzkich. Po rozpoznaniu MHC-I przez receptor powstaje ujemny sygnał, silniejszy od sygnału zabijania i zapobiegający zabiciu komórki przez NK.

Komórki NK prowadzą do lizy nieprawidłowych komórek poprzez wbudowanie do ich błony perforyn - cząsteczek tworzących szczeliny w sposób podobny do obserwowanego w przypadku komórek CTL i dopełniacza oraz wstrzyknięcie cytotoksycznych granzymów. Oprócz takiej spontanicznej aktywności komórki NK są również zdolne do uczestniczenia w cytotoksyczności zależnej od przeciwciał ADCC.

---