Ćwiczenie II

1. Amplifikacja DNA in vitro metodą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR).

2. Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi.

3. Elektroforeza agarozowa DNA.

1. Reakcja PCR

Łańcuchowa reakcja polimerazy (ang.: polymerase chain reaction, w skrócie PCR) jest metodą służącą do amplifikacji segmentu DNA położonego pomiędzy regionami o znanej sekwencji. W reakcji tej używane jako primery są dwa oligonukleotydy, komplementarne do sekwencji położonych na przeciwległych niciach matrycowego DNA, flankujące rejon DNA, który ma podlegać amplifikacji. DNA jest syntetyzowane w serii reakcji katalizowanych przez polimerazę DNA.

Każdy cykl składa się z następujących etapów:

1. denaturacji matrycowego DNA w temperaturze 94-95^oC, w obecności czterech dNTP oraz dużego nadmiaru oligonukleotydów (primerów)

2. przyłączania primerów do sekwencji homologicznych w matrycowym DNA, co następuje po ochłodzeniu mieszaniny do temperatury 45-65^oC

3. wydłużania primerów przez polimerazę DNA w temperaturze 72^oC, co w rezultacie pozwala na syntezę fragmentu DNA.

Temperatura przyłączania primerów zależy od długości oligonukleotydów (długość ich nie powinna być mniejsza niż 16 nukleotydów, optymalna - 22-28 nukleotydów), ich temperatury topnienia i specyficzności łączenia się z matrycowym DNA.

Każdy cykl, składający się z denaturacji, przyłączania i syntezy, powtarzany jest wielokrotnie (od 25 do 40 razy). DNA będący produktem każdego cyklu, służy jako matryca w następnych cyklach, czego skutkiem jest szybkie powiększenie puli syntetyzowanego DNA.

Produktem reakcji PCR jest dwuniciowy fragment DNA, którego końcami są końce 5`primerów, a długość określona jest przez odległość pomiędzy primerami. W reakcji PCR stosuje się termostabilną polimerazę DNA wyizolowaną z termofilnej bakterii Thermus aquaticus (Taq polimeraza). Enzym ten nie traci aktywności w temperaturze wymaganej dla denaturacji DNA, a poza tym wykazuje dobrą wydajność syntezy DNA: możliwe jest uzyskanie do 1 μg DNA długości 2000 par zasad po 30 cyklach amplifikacji, stosując jako matrycę tylko 10^-6 μg DNA. Matrycą do syntezy DNA może być DNA liniowy, plazmidowy (ccc), całego genomu np. bakterii; nie musi być on oczyszczany - wystarcza dodanie do mieszaniny reakcyjnej niewielkiej ilości zlizowanych przez zagotowanie komórek bakteryjnych.

Reakcja amplifikacji DNA metodą PCR odbywa się w specjalnym urządzeniu, termocyklerze, umożliwiającym szybkie zmiany temperatur.

Zastosowanie PCR:

• amplifikacja fragmentu DNA,

• diagnostyka molekularna:

• wykrywanie DNA patogenów w próbkach klinicznych, identyfikacja próbek w medycynie sądowej (możliwa z bardzo niewielkiej próbki, np. pojedynczego włosa), analiza mutacji w chorobach nowotworowych,

• synteza specyficznych sond,

• tworzenie bibliotek genomów.

UWAGA!

Jako że w reakcji PCR mogą być amplifikowane tak małe ilości DNA, jak nawet pojedyncza cząsteczka, zlecane są następujące środki ostrożności, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbki:

• wszystkie czynności wykonywać w rękawiczkach

• używać buforów przeznaczonych wyłącznie do reakcji PCR

• używać wyłącznie jałowych odczynników, tipsów i probówek eppendorfa, pakowanych do jałowienia w rękawiczkach

• nie chlapać roztworami DNA !!!

Protokół przygotowania reakcji PCR:

1. Przygotowanie matrycowego DNA:

matrycą do reakcji PCR jest DNA plazmidowe wyizolowane na poprzednich ćwiczeniach - pBAD33YefMYoeB, zawierające geny antytoksyny:toksyny yefM:yoeB pod kontrolą promotora arabinozowego (p_ara).

2. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej:

Reakcja odbywa się w całkowitej objętości 20 μl. W mieszaninie znajduje się: 10 pmoli każdego primera, 2 μl DNA matrycowego, 200 μM dNTP, 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, Taq polimeraza

3. Primery użyte do reakcji PCR flankujące geny yefM i yoeB:

- primer 1: 5'-CCTCGAGCTCATCATTGTACAATGAACTG-3' - na końcu 5` jest miejsce cięcia dla enzymu SacI (podkreślone)

- primer 2: 5`- TCCCAAGCTTAGATCTATAAGGCTACGCTAGC -3` - na końcu 5` jest miejsce cięcia dla enzymu HindIII (podkreślone)

UWAGA! Kolejność dodawania poszczególnych składników jest istotna!

4. Przepis praktyczny na 1 reakcję (1 probówkę) - 20 μl:

woda destylowana 9 μl

bufor 10 x stężony 2 μl

mieszanina dNTP 2 mM 2 μl

primer 1 (10 μM) 2 μl

primer 2 (10 μM) 2 μl

matrycowe DNA 2 μl (DNA po izolacji rozcieńczone 1:20)

Walk polimeraza 1 μl

5. Reakcja amplifikacji DNA

Program reakcji PCR:

• denaturacja wstępna - 95^oC, 5 minut

• 
  denaturacja - 95^oC, 30s

• przyłączanie primera - 52^oC, 30s 10 cykli

• wydłużanie - 72^oC, 1 min

• 
  denaturacja - 95^oC, 30s

• przyłączanie primera - 58^oC, 30s 20 cykli

• wydłużanie - 72^oC, 1 min

• końcowe wydłużanie: 72^oC, 5 minut

2. Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi

Enzymy restrykcyjne, inaczej restryktazy, to enzymy z grupy endonukleaz przecinające nić DNA w miejscu wyznaczanym przez specyficzną sekwencję DNA. Rozpoznawana sekwencja z reguły ma charakter symetryczny o długości od 4 do 8 par zasad. Nazwy enzymów są tworzone od pierwszej litery nazwy rodzajowej i dwóch pierwszych liter nazwy gatunkowej bakterii, z której enzym został wyizolowany. Po nich może wystąpić kilka liter lub cyfr arabskich oznaczających szczep bakterii. Nazwa zakończona jest rzymską cyfrą oznaczającą, jako który kolejny enzym został on wyizolowany z danego szczepu. DNA plazmidowe otrzymane na ćwiczeniu I zostanie potrawione enzymami restrykcyjnymi BamHI i HindIII, aby wyciąć wstawkę zawierającą geny antytoksyny i toksyny - YefM i YoeB wraz z promotorem arabinozowym.

Protokół przygotowania reakcji trawienia DNA na 20 ul objętości końcowej:

1. 16 ul DNA otrzymanego na poprzednich ćwiczeniach przenieść do nowej probówki eppendorfa.

2. dodać 2 ul buforu 10xFastDigest

3. dodać po 1 ul enzymów BamHI i HindIII - delikatnie wymieszać składniki reakcji

4. probówki wstawić do termobloku o temperaturze 37^oC na 20 minut

5. następnie temperaturę w termobloku zmienić na 65^oC i inkubować próbki przez kolejne 10-15 minut w celu inaktywacji enzymów restrykcyjnych.

Sekwencja plazmidu pBAD33YefMYoeB z podkreślonymi sekwencjami primerów 1 i 2 oraz zaznaczonymi miejscami restrykcyjnymi BamHI, SacI i HindIII

CATCATTGTACAATGAACTGTACAAAAGAGGAGATTGACATGCGTACAATTAGCTACAGC

GAAGCGCGTCAGAATTTGTCGGCAACAATGATGAAAGCCGTTGAAGATCATGCCCCGATC

CTTATTACTCGTCAGAATGGAGAGGCTTGTGTTCTGATGTCACTCGAAGAATACAACTCG

CTGGAAGAGACGGCTTATCTACTGCGCTCCCCCGCTAACGCCCGGAGATTGATGGACTCA

ATCGATAGCCTGAAATCAGGCAAAGGAACGGAAAAGGACATCATTGAGTGAAACTAATCT

GGTCTGAGGAATCATGGGACGATTATCTGTACTGGCAGGAAACAGATAAGCGAATTGTTA

AAAAGATCAATGAACTTATCAAAGATACCCGCAGAACGCCATTTGAAGGTAAGGGGAAGC

CAGAACCCCTGAAACATAATTTGTCAGGTTTCTGGTCCCGACGCATTACAGAGGAGCACC

GTCTGGTATACGCGGTTACCGACGATTCACTGCTCATTGCAGCATGTCGTTATCATTATT

GAACAGATTCATTCATAGAATGAATTGTCAGTTTTGATACGCTAGCGTAGCCTTATAGAT

CTAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAG

AACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCAC

CTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTC

CCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGAC

TGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCG

CCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCG

CCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCG

TTTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAG

ACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACA

TTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCC

AGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGGCAAACTATTAACTGGCG

AACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTG

CAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAG

CCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCC

GTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGA

TCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCAT

ATATACTTTAGATTGATTTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTG

GTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTC

TTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTC

CCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGT

GATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAG

TCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTTGAACAACACTCAACCCTATCTCG

GGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAG

CTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTAAAAG

GATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTC

GTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTT

TCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTT

GCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGAT

ACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGC

ACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTCAGGCATTTGAGAAGCACACG

GTCACACTGCTTCCGGTAGTCAATAAACCGGTAAACCAGCAATAGACATAAGCGGCTATT

TAACGACCCTGCCCTGAACCGACGACCGGGTCGAATTTGCTTTCGAATTTCTGCCATTCA

TCCGCTTATTATCACTTATTCAGGCGTAGCACCAGGCGTTTAAGGGCACCAATAACTGCC

TTAAAAAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCAT

TCTGCCGACATGGAAGCCATCACAGACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAG

CACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTC

CATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAA

AAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCAC

ATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGA

TGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATAT

CACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGGAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGC

AAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAA

GGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGC

CTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTT

TTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGG

TAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCAACGTCTCA

TTTTCGCCAAAAGTTGGCCCAGGGCTTCCCGGTATCAACAGGGACACCAGGATTTATTTA

TTCTGCGAAGTGATCTTCCGTCACAGGTATTTATTCGGCGCAAAGTGCGTCGGGTGATGC

TGCCAACTTACTGATTTAGTGTATGATGGTGTTTTTGAGGTGCTCCAGTGGCTTCTGTTT

CTATCAGCTGTCCCTCCTGTTCAGCTACTGACGGGGTGGTGCGTAACGGCAAAAGCACCG

CCGGACATCAGCGCTAGCGGAGTGTATACTGGCTTACTATGTTGGCACTGATGAGGGTGT

CAGTGAAGTGCTTCATGTGGCAGGAGAAAAAAGGCTGCACCGGTGCGTCAGCAGAATATG

TGATACAGGATATATTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTACGCTCGGTCGTTCGACTG

CGGCGAGCGGAAATGGCTTACGAACGGGGCGGAGATTTCCTGGAAGATGCCAGGAAGATA

CTTAACAGGGAAGTGAGAGGGCCGCGGCAAAGCCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTG

ACAAGCATCACGAAATCTGACGCTCAAATCAGTGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAA

GATACCAGGCGTTTCCCCCTGGCGGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCTGCCTTTCGGT

TTACCGGTGTCATTCCGCTGTTATGGCCGCGTTTGTCTCATTCCACGCCTGACACTCAGT

TCCGGGTAGGCAGTTCGCTCCAAGCTGGACTGTATGCACGAACCCCCCGTTCAGTCCGAC

CGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGAAAGACATGCAAAAGCA

CCACTGGCAGCAGCCACTGGTAATTGATTTAGAGGAGTTAGTCTTGAAGTCATGCGCCGG

TTAAGGCTAAACTGAAAGGACAAGTTTTGGTGACTGCGCTCCTCCAAGCCAGTTACCTCG

GTTCAAAGAGTTGGTAGCTCAGAGAACCTTCGAAAAACCGCCCTGCAAGGCGGTTTTTTC

GTTTTCAGAGCAAGAGATTACGCGCAGACCAAAACGATCTCAAGAAGATCATCTTATTAA

TCAGATAAAATATTTGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGAT

GTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCG

TCCGGCGTAGAGGATCTGCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATGCATAATGTGCCTGTC

AAATGGACGAAGCAGGGATTCTGCAAACCCTATGCTACTCCGTCAAGCCGTCAATTGTCT

GATTCGTTACCAATTATGACAACTTGACGGCTACATCATTCACTTTTTCTTCACAACCGG

CACGGAACTCGCTCGGGCTGGCCCCGGTGCATTTTTTAAATACCCGCGAGAAATAGAGTT

GATCGTCAAAACCAACATTGCGACCGACGGTGGCGATAGGCATCCGGGTGGTGCTCAAAA

GCAGCTTCGCCTGGCTGATACGTTGGTCCTCGCGCCAGCTTAAGACGCTAATCCCTAACT

GCTGGCGGAAAAGATGTGACAGACGCGACGGCGACAAGCAAACATGCTGTGCGACGCTGG

CGATATCAAAATTGCTGTCTGCCAGGTGATCGCTGATGTACTGACAAGCCTCGCGTACCC

GATTATCCATCGGTGGATGGAGCGACTCGTTAATCGCTTCCATGCGCCGCAGTAACAATT

GCTCAAGCAGATTTATCGCCAGCAGCTCCGAATAGCGCCCTTCCCCTTGCCCGGCGTTAA

TGATTTGCCCAAACAGGTCGCTGAAATGCGGCTGGTGCGCTTCATCCGGGCGAAAGAACC

CCGTATTGGCAAATATTGACGGCCAGTTAAGCCATTCATGCCAGTAGGCGCGCGGACGAA

AGTAAACCCACTGGTGATACCATTCGCGAGCCTCCGGATGACGACCGTAGTGATGAATCT

CTCCTGGCGGGAACAGCAAAATATCACCCGGTCGGCAAACAAATTCTCGTCCCTGATTTT

TCACCACCCCCTGACCGCGAATGGTGAGATTGAGAATATAACCTTTCATTCCCAGCGGTC

GGTCGATAAAAAAATCGAGATAACCGTTGGCCTCAATCGGCGTTAAACCCGCCACCAGAT

GGGCATTAAACGAGTATCCCGGCAGCAGGGGATCATTTTGCGCTTCAGCCATACTTTTCA

TACTCCCGCCATTCAGAGAAGAAACCAATTGTCCATATTGCATCAGACATTGCCGTCACT

GCGTCTTTTACTGGCTCTTCTCGCTAACCAAACCGGTAACCCCGCTTATTAAAAGCATTC

TGTAACAAAGCGGGACCAAAGCCATGACAAAAACGCGTAACAAAAGTGTCTATAATCACG

GCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCCATAGCATTTT

TATCCATAAGATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTC

CATACCCGTTTTTTTGGGCTAGCGAATTCGAGCT

3. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym

Elektroforeza jest metodą rozdzielania w polu elektrycznym cząsteczek różniących się wielkością i ładunkiem elektrycznym. DNA jako kwas obdarzony jest ładunkiem ujemnym (nadawanym przez ujemnie naładowane grupy fosforanowe), toteż w polu elektrycznym migruje w kierunku bieguna dodatniego. Ponieważ stosunek ładunku elektrycznego do masy cząsteczki jest w DNA stały, cząsteczki będą rozdzielały się pod względem masy. DNA rozdziela się w żelu o określonym usieciowaniu. Gęstość tego usieciowania, czyli wielkość porów w żelu, określa zdolność rozdzielczą żelu i zależy od jego stężenia (im wyższe stężenie tym gęstsze usieciowanie - dzięki temu możliwe jest dokładniejsze rozdzielanie cząsteczek niewiele różniących się długością). Do analizy cząsteczek DNA o wielkości od kilkuset do kilku tysięcy par zasad stosuje się na ogół żele agarozowe o stężeniu od 0,7 do 1,2 %. Taki żel umożliwia rozdzielenie cząsteczek różniących się długością kilkunastu - kilkudziesięciu par zasad. Z kolei cząsteczki różniące się tylko jedną parą zasad można skutecznie rozdzielić w żelach poliakrylamidowych

Agaroza jest cukrem złożonym. Otrzymuje się ją z oczyszczonej frakcji wyciągu z kras­norostów - agaru (wykorzystywanego na przykład w przemyśle spożywczym do robienia galaretek, oraz w laboratoriach do zestalania podłóż do hodowli mikroorganizmów). Agaroza znakomicie rozpuszcza się w gorącej wodzie, a stygnąc tworzy żel o regularnym usieciowaniu. Do elektroforezy agarozę rozpuszcza się w buforze do elektroforezy, pełnią­cym funkcję elektrolitu.

Rozdział cząsteczek DNA odbywa się dzięki właściwościom żelu. DNA migruje w żelu pod wpływem prądu. Dłuższe fragmenty o większej masie, przeciskając się przez siatecz­kę żelu napotykają na większy opór, toteż ich przemieszczanie zachodzi wolniej. Frakcje cząsteczek o tej samej wielkości, obdarzonych identycznym ładunkiem, migrują w tym samym tempie - jeżeli po pewnym czasie od rozpoczęcia elektroforezy wybarwimy DNA w żelu, zobaczymy prążki odpowiadające poszczególnym frakcjom cząsteczek DNA na tej samej wysokości. Aby zidentyfikować wielkość cząsteczek DNA w prążkach, na żel nakłada się standardy wielkości - mieszaninę cząsteczek DNA o znanej wielkości. Porównując prążki z badanej próbki z prążkami standardu, jesteśmy w stanie określić wielkość badanych cząsteczek DNA.

Aby zobaczyć DNA w żelu, musimy je wybarwić. W laboratoriach do tego celu na ogół stosuje się bromek etydyny - substancję wiążącą się z DNA, która po wzbudzeniu światłem UV świeci na pomarańczowo. Bromek etydyny wnika w głąb struktury DNA, powodując jej uszkodzenia.

UWAGA!!! Bromek etydyny jest silnym mutagenem - podczas pracy z tym związkiem należy zachować szczególną ostrożność unikając kontaktu bromku ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Wszelkie czynności wymagające kontaktu z żelem po dodaniu go do bromku etydyny powinny być wykonywane w rękawiczkach. gumowych!

Podczas ćwiczeń elektroforezie poddamy:

1). DNA plazmidowe wyizolowane dwiema metodami na ćwiczeniu I (10 ul)

2). DNA po reakcji PCR (10 ul)

3). DNA po trawieniu enzymami restrykcyjnymi (całość)

3). DNA wzorcowe - drabinkę DNA (3 ul)

Elektroforeza DNA w żelu agarozowym:

1. Przygotować agarozę 1% w buforze 0.5 x TAE (40 mM Tris-kwas octowy, 1 mM EDTA, pH 8.0) - zagotować w mikrofalówce aż do całkowitego rozpuszczenia - pozostawić do wystygnięcia (około 50⁰C)

2. Wylać żel w odpowiednim aparacie, poczekać do zastygnięcia agarozy

3. Do komór aparatu nalać bufor 0,5 x TAE tak, aby pokrywał on powierzchnię żelu

4. Do studzienek żelu nanieść próbki DNA zmieszane z buforem obciążającym w proporcji 5:1 (bufor stężony 6x:
   0.25%błekit bromofenolowy, 0.25% xylene cyanol,
   40% (w/v) sacharoza w wodzie)

5. Rozdział prowadzić przy stałym napięciu 100V przez około 25 min.

6. Żel barwić w roztworze bromku etydyny przez 15 min. i oglądać w świetle ultrafioletowym na transiluminatorze.

Zagadnienia do samodzielnego opracowania:

1. Polimerazy DNA, w tym te wykorzystywane w reakcjach PCR.

2. Metoda PCR - etapy, składniki reakcji.

3. Zastosowanie technik PCR w biologii i medycynie.

4. Enzymy restrykcyjne - właściwości, zastosowanie, nomenklatura.

5. Budowa kwasów nukleinowych.

6. Metody analizy elektroforetycznej kwasów nukleinowych.

---