Wpływ temperatury na utlenianie substratów

NAD i FAD zależnych przez izolowane mitochondria

Effect of temperature on oxidation of NAD and FAD dependent substrates

Paweł Molus, Natalia Bielecka, Marta Wojciechowska

Praca Zakładu Biochemii Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego

Streszczenie:

Doświadczenie polega na zbadaniu wpływu temperatury na proces utleniania substratów NAD i FAD zależnych przez izolowane mitochondria. Wynik doświadczenia uzyskano na podstawie obserwacji zmian zabarwienia otrzymanych roztworów po dodaniu odpowiednich substratów (tabela 1) a także izowlowanych mitochondriów uzyskanych przez homogenizację tkanki w roztworze izotonicznym. Obserwacji zmiany barwy wykonanych prób (dokonane jakościowo wzrokiem ) pozwoliły na stwierdzenie, że temperatura ma wpływa na utlenianie substratów NAD i FAD zależnych przez izolowane mitochondria.

Słowa kluczowe: temperatura, substraty NAD zależne, substraty FAD zależne, izolowane mitochondria, utlenianie.

Abstract:

The experiment consists examination of temperature influance on oxidation of NAD and FAD dependent substrates by isolated mitochondria. The result of the experiment was obtained on the basis of observation of colour changes of received solutions after adding proper substrates (Tab. 1) along with isolated mitochondria gained by homogenization of tissue in isotonic solution. Observation of colour changes of prepared trials (done qualitatively by sight) allowed for an assuption that temperature has an influance on oxidation of NAD and FAD dependent substrates by isolated mitochondia.

Wstęp:

Enzymy są katalizatorami reakcji chemicznych, odgrywającymi podstawową rolę w funkcjonowaniu komórki. Prawie wszystkie są białkami, jednakże znane są także katalitycznie czynne cząsteczki RNA. Ogólna aktywność enzymów zależy w znacznej mierze od warunków fizykochemicznych środowiska: temperatury, pH, stężeń elektrolitów. W zakresie różnych wartości tych parametrów, zmienia się aktywność enzymu, przy czym taką wartość np. pH, przy którym aktywność jest najwyższa nazywamy optimum, które jest inne dla każdego białka. Dla temperatury i pH, czyli czynników wpływających bezpośrednio na drugorzędową i wyższe struktury białka, charakterystyczny jest nagły spadek aktywności po przekroczeniu optimum, co jest związane z denaturacją enzymów. Dla różnych białek proces ich denaturacji cieplnej rozpoczyna się w różnych temperaturach pomiędzy 40°C, a 100 °C, może być odwracalna lub nie. (5,6)

Ryc. 1

W poniższej pracy zbadano i porównano wpływ temperatury na aktywność mitochondrialnych układów enzymatycznych utleniających substraty NADH i FADH2 zależnych.

Według empirycznej reguły van't Hoffa wzrost temperatury o 10 stopni (w skali Celsjusza lub Kelwina) powoduje 2-4 krotny wzrost szybkości reakcji chemicznej. Jednakże wzrost temperatury w przypadku reakcji katalizowanych przez enzymy, nie zawsze spowoduje przyspieszenie reakcji.(6) Należy przyjrzeć się wypadkowej dwóch procesów: wzrostu energii kinetycznej układu przy wzroście szybkości denaturacji termicznej. Ponadto wpływ na temperaturę optymalną enzymu ma jeszcze stopień jego oczyszczenia, pH, obecność soli, aktywatorów, inhibitorów, a także od tego czy jest on związany z błoną czy też nie.

Uzyskiwanie energii w mitochondriach zależy głównie od współpracy dwóch układów: rolą pierwszego jest produkcja z określonych substratów zredukowanych nukleotydów, to znaczy NADH i FADH2, które dalej są utleniane w drugim układzie czyli łańcuchu oddechowym.

Do substratów NAD zależnych, które redukują pulę mitochondrialnego NAD zaliczamy np.: izocytrynina, jabłczan, glutaminian, beta-hydroksyacylo-CoA, beta-hydroksymaślan, alfa-ketoglutaran i pirogronian. Natomiast do substratów FAD zależnych zaliczamy bursztynian, acylo-CoA i 3-fosfoglicerol. Każdy z wyżej wymienionych substratów utleniany jest przez konkretny enzym, np. bursztynian przez dehydrogenazę bursztynianową, która jest związanym z błoną enzymem cyklu Krebsa. (1)

Materiały i metody:

Przygotowano odpowiedni sprzęt :

1. Probówki szklane 11 szt.

2. Statyw metalowy do probówek 4 szt.

3. Pipety automatyczne poj. 0,2 -1 ml 1 szt.

0,1 ml 1 szt. 0,05 ml 1 szt.

4. Łaźnia wodna termostatowana (37°C, 60°C)

5. Lodówka (ok. 4°C )

6. Wirówka laboratoryjna WE-6.

7. Probówki typu Eppendorf 11 szt.

Przygotowano odpowiednie odczynniki:

1. Buforowany roztwór sacharozy + 2 mM bufor fosforanowy (pH 7,4)

2. Roztwór substratu FAD-zależnego (bursztynian sodu, roztwór 0,1 M) (pH 7,4)

3. Roztwór substratów NAD-zależnych (glutaminian 0,1 M + jabłczan 0,1 M) (pH 7,4)

4. Żelazicyjanek potasu (K3Fe(CN)6), roztwór 0,5% (pH 7,4)

5. Kwas trichlorooctowy (TCA), roztwór 0,6 M

6. Woda redestylowana

W jedenastu probówkach sporządzono płyny inkubacyjne (Tab. 1). Probówka 3 była próbą ślepą bez substratu. Do probówek 4, 11 dodano 1 ml 0,6 M roztworu kwasu trichlorooctowego (TCA) celem wytrącenia białka, były to próby ślepe nie zawierające czynnego enzymu. Następnie wszystkie probówki wstawiono do łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Po 5 min preinkubacji do probówek od 1 do 11 dodano po 0,1 ml zawiesiny mitochondriów, dokładnie wymieszano a następnie probówki 1, 7 schłodzono w lodówce w temperaturze ok. 4°C przez 20 minut. Probówki 2, 8 zostawiono w temperaturze pokojowej ok. 24°C przez 20 minut.

Probówki 5, 9 inkubowano w temperaturze 37°C przez 20 minut. Probówki inkubowano w temperaturze 60°C przez 20 minut. Po upływie 20 minut przerwano reakcję przez dodanie do każdej probówki (za wyjątkiem probówki 4,11) po 1 ml 0,6 M roztworu kwasu trichlorooctowego (TCA). Potem odstawiono na kilka minut. Probówki wirowano przez 10 minut przy 2000 obr./min na wirówce WE-6. Po skończeniu inkubacji i odbiałczeniu prób stwierdzono w jakich probówkach nastąpiła redukcja żelazicyjanku do żelazocyjanku (odbarwienie). Obserwacje zanotowano.

Wyniki:

Probówki nr 3, 4, 11- barwa jednakowa, żółta

Probówka nr 7 - odbarwienie

Probówka nr 1 - barwa jednakowa, żółta

Probówka nr 8 - odbawienie

Probówka nr 2- barwa jednakowa, żółta

Probówka nr 9 - odbarwienie

Probówka nr 5 - barwa jednakowa, żółta

Probówki nr 6, 10 - brawa jednakowa, żółta

Ryc. 2

Ryc. 3

Dyskusja:

Przy wykonywaniu większośći doświadczeń, sporządza się tzw. próby ślepe, które to wykazują zachowanie się danych odczynników w warunkach panujących w laboratorium (dostęp tlenu i temperatura otoczenia). Również i w tym doświadczeniu wykorzystano takie próby, które odpowiadają probówkom nr 3, 4, 11. Probówka nr 3 nie zawierała żadnego z substatów NAD i FAD zależnych. Do probówek 4, 11 dodano 1ml 0,6 M roztworu kwasu trichlorooctowego (TCA), w celu wytrącenia białka, były to próby ślepe niezawierające czynnego enzymu. Roztwór nie zmienił zabarwienia w tych probówkach , co oznacza, iż żelazicyjanek jest odporny na czynniki zewnętrzne wykorzystywane w przebiegu ćwiczenia. Wynika z tego, że żelazicyjanek nie zmienia swojej barwy, gdy procesy oksydo-redukcyjne nie zachodzą (Ryc. 2).

W probówce nr 7, 8, 9 przeprowadzono reakcję z substatem NAD zależnym odpowiednio w temperaturach 4°C, 24°C i 37°C. Zatem nastąpiła redukcja żelazicyjanku do żelazocyjanku, a roztwory w tych probówkach uległy odbarwieniu. W ten sposób wykazano, iż zestaw badawczy został dobrany prawidłowo, w oparciu o teoretyczną wiedzę dotyczącą właściwości żelazicyjanku, a zachodzące reakcje zostały prawidłowo zarejestrowane (Ryc. 3). Natomiast próby z probówek nr 6, 10 przedstawiały reakcje substratów odpowiednio FAD i NAD zależnych w temperaturze 60 °C. Roztwory w tych probówkach nie odbarwiły się, w związku z tym nie nastąpiła redukcja żelazicyjanku do żelazocyjanku. W oparciu o wiedzę teoretyczną stwierdzono, że wynik reakcji zachodzący w tych probówkach jest prawidłowy, ponieważ w praktyczny sposób potwierdza informacje zawarte we wstępie (Ryc. 1). Temperatura w tych próbach była zbyt wysoka, doszło do denaturacji białka enzymatycznego.

W probówkach nr 1, 2, 5 przeprowadzono reakcję z substatem FAD zależnym odpowiednio w temperaturach 4°C, 24°C i 37°C. Roztwory w tych probówkach nie uległy odbarwieniu. Może być to spowodowane ......???????

Podczas trwania ćwiczenia, w laboratorium nie miały miejsca żadne czynniki zewnętrzne, które miałyby jakikolwiek wpływ na końcowe rezultaty badania.

Piśmiennictwo:

1. Materiały do ćwiczeń dostępne na stronie kierunku lekarskiego GUM

2. E. Bańkowski „Biochemia” wyd. Urban&Partner 2009

3. Wykład 5. dostępny na stronie kierunku lekarsko-dentystycznego GUM https://extranet.gumed.edu.pl/page.php/267732/

4. R. K. Murray „Biochemia Harpera” Wydawnictwo Lekarskie PZWL 2006

5. Lubert Stryer „Biochemia” Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa 2003

6. Laboratorium z biochemii (pod red. Antoniego Polanowskiego) wyd. II Wrocław 2005

Tab. 1 Płyny inkubacyjne

Podpisy do rycin:

Ryc. 1 Zależność szybkości reakcji z udziałem białek od temperatury.

Ryc. 2 Próby ślepe doświadczenia.

Ryc. 3 Wynik doświadczenia (probówki typu Eppendorf nr 1-11).

Nr Probówki	Buforowany roztwór sacharozy + 2 mM bufor fosforanowy (pH 7,4)	Bursztynian sodu (0,1M) ml	Glutaminian (0,1M) + Jabłczan (0,1M) ml	Żelazicyjanek Potasu (0,5%) Ml	Woda Ml
1	1	0,1	-	0,5	0,8
2	1	0,1	-	0,5	0,8
3	1	-	-	0,5	0,9
4	1	0,1	-	0,5	0,8
5	1	0.1	-	0,5	0,8
6	1	0,1	-	0,5	0.8
7	1	-	0,1	0,5	0,8
8	1	-	0,1	0,5	0,8
9	1	-	0,1	0,5	0,8
10	1	-	0,1	0,5	0,8
11	1	-	0,1	0,5	0,8

11

---