1. Zakładając, że jest Pani/Pan kobietą w wieku 23 lat, jak można wykorzystując własne komórki, pomóc swemu ojcu, który przeszedł zawał serca i w efekcie w mięśniu posiada bliznę pozawałową, wiedząc jednocześnie, iż można ojca uleczyć przy pomocy terapii komórkami macierzystymi otrzymanymi techniką klonowania terapeutycznego?

Odpowiedź: ?????

Klonowanie „terapeutyczne” dotyczy procedury, która umożliwiłaby uzyskanie komórek macierzystych (miałyby one służyć „wyhodowaniu” tkanek lub narządów potrzebnych do przeszczepów) pochodzących z ludzkich embrionów, powodując ich śmierć; w tym wypadku jednak terapia nie dotyczyłaby embrionu, ale osób trzecich; ten semantyczny zabieg pozwolił na ominięcie w prawodawstwie zakazu dotyczącego klonowania reprodukcyjnego.

Jak wiadomo klonowanie terapeutyczne prowadzi się przez transplantację komórki pęcherzykowej do enukleowanego (pozbawionego jądra) oocytu.

Poraz pierwszy 13 października 2001 roku udało się uzyskać tą technika, żywy dzielący się ludzki zarodek. Uzyskując zezwolenia komisji etycznych, pobrano od kilkunastu kobiet oocyty, które zostały skłonione do dojrzewania w warunkach laboratoryjnych. Następnie pobrano od kilku anonimowych dawców komórki skóry (fibroblasty). Do części oocytów pozbawionych jąder wstrzyknięto jądra fibroblastów, zaś do pozostałych wstrzyknięto komórki pęcherzykowe (kom. Wzgórka jajonośnego). Są to komórki, które odzywiają rozwijające sie w jajniku komórki jajowe I po owulacji nadal są do nich przyklejone. W ten sposób uzyskano jeden dzielący się ludzki wczesny zarodek, który doprowadzono do fazy blastocysty (wczesne stadium rozwojowe embrionu powstałe w wyniku bruzdkowania (podziału komórkowego) zygoty). W klonowaniu terapeutycznym wykorzystuje się materiał genetyczny z własnych komórek macierzystych pacjenta. Komórki macierzyste, niezróżnicowane można skłonić by w ustroju, z którego pochodzą przekształciły się w dowolną tkankę, która w danym momencie wymaga leczenia lub odmłodzenia. Komórki te są liczne, łatwo dostępne, posiadają cechę toti- lub pluripotencjalności, [czyli: rozwoju możliwego do dowolnego (toti-) bądź wielorakiego (pluri-) a w przypadku klonowania są immunologicznie zgodne z dawcą jądra, dzięki czemu można je u dawcy jądra zastosować w celach terapeutycznych. Owa immunologiczna zgodność oznacza praktyczny brak niebezpieczeństwa odrzucenia takiej tkanki przez ciało dawcy.

Tak wiec, jeżeli chcemy pomóc naszemu ojcu potrzebna jest nasza komórka jajowa, do której zostanie wprowadzone jądro np. z fibroblastu naszego ojca. Następnie pobudza się oocyt do podziałów działając różnymi związkami chemicznymi m.in. czynnikami wzrostowymi, które pobudzają jądro do podziałów. Komórki potomne zawierają materiał genetyczny, pochodzący wyłącznie od uprzednio wstrzykniętego jądra fibroblastu. Po 4-5 dniach zarodek uzyskuje stadium blastocysty. Komórki zewnętrzne blastocysty utworzą łożysko, a komórki wewnętrzne (20-100 komórek), które dadzą początek wszystkim narządom, to właśnie totipotencjalne komórki macierzyste, zdolne do utworzenia wszystkich tkanek i narządów ustroju. Komórki macierzyste można z kolei skłonić do różnicowania w rozmaite komórki, w tym przypadku komórki mięśnia sercowego. I takie komórki wszczepić naszemu ojcu. Czyli reasumując można wykorzystać nasze komórki jajowe żeby pomoc naszemu choremu ojcu.

2. Proszę porównać genom ludzki z największym roślinnym (szachownicy) oraz najmniejszym prokariotycznym (Mycoplasma genitalium). W którym genomie znajduje się stosunkowo najwięcej genów i dlaczego?

Odpowiedź:

Genom ludzki zbudowany jest z 3000 Mb. Zawiera 30 do 40 tysięcy genów. Genom szachownicy Fritillaria assyrica to największy dotychczas poznany genom. Zbudowany jest z 120 000 Mb, liczy???genów. Natomiast najmniejszy jaki znamy to genom Mycoplasma genitaliom. Liczy on zaledwie 0,58 Mb. Zawiera zaledwie 470 genów. Ogólnie można zauważyć, że im mniejszy genom, tym mniej genów potrzeba żeby zdefiniować wolnożyjącą komórkę. U człowieka strasznie dużo jest sekwencji intronowych czyli nie kodujących, które przedzielają krótkie fragmenty egzonowe czyli kodujące. W przypadku człowieka jego genom jest strasznie „nieoszczędny”.

Wg Agi Rybickiej:

Genom ludzki-3000Mb

Najmniejszy- to genom prokariotyczny- Mycoplasma genitalium- 0,58Mb

Największy- Fritillaria assyriaca( szachownica)- 120000Mb

Genom człowieka:

Genom jądrowy złożony jest z ok. 3mld bp DNA(3 mln kb, 3tys.Mb). Genom jądrowy dzieli się na 24 różne liniowe cząsteczki DNA, z których najkrótszy ma 55Mb a najdłuższy 250Mb i każdy zawiera się w osobnym chromosomie. Te 24 chromosomy to 22 autosomy i 2 chromosomy płci:X i Y

Genom mitochondrialny-kolista cząst. DNA dł.16569bp, które w wielu kopiach znajdują się w organellach wytwarzającyh energie-mitochondrium.

W kom. somatycznych 46 chromosomów, gamety 23chromosomy

Genom ludzki w liczbach:

• DNA kodujący-90 Mb (3% genomu)

• DNA niekodujący ale związany z genami-810 Mb

• DNA pozagenowy-2100 Mb:

• DNA zawierający sekwencje pojedyncze i o małej liczbie kopii- 1680 Mb

• DNA złożony z sekwencji powtórzonych-420 Mb:

• Tandemowo:satelity, mikrosatelity...

• Rozproszone w genomie:elementy LTR, retropozony(sekwencje LINE i SINE,transpozonyDNA

Wszystkie eukariotyczne genomy jądrowe są podzielone na 2 lub więcej liniowych cząst. DNA, z których każda zawiera się w innym chromosomie. Wszystkie Eucaryota maja również mniejszy zazwyczaj kolisty genom mitochondrialny. Jedyną ogólną eukariotyczną cechą nie występującą u ludzi jest obecność trzeciego genomu znajdującego się w chloroplastach u roślin i innych organizmów fotosyntetyzujących. Podstawowa struktura fizyczna wszystkich genomów eukariotycznych jest bardzo podobna, ale różnią się one jedną ważną cechą- wielkością. Najmniejsze są krótsze niż 10Mb a największe maja ponad 1000Mb. Wielkość jest do pewnego stopnia związana ze złożonością organizmu( najprostsze Eucaryota takie jak grzyby maja mniejsze genomy, a wyższe E. Większe). Jednak liczba chromosomów nie ma związku z właściwościami biologicznymi organizmu i z wielkością genomu.

Genomy prokariotyczne bardzo różnią się od eukariotycznych. Największy prokariotyczny i najmniejszy eukariotyczny mają tę sama wielkość, ale ogólnie genomy prokariotyczne są o wiele mniejsze. Również organizacja fizyczna jest odmienna. U prokariotów większość zawiera się w pojedynczej cząst. DNA- kolistej a nie liniowej. Mogą występować także mniejsze i niezależne, koliste lub liniowe cząst. DNA- plazmidy( geny przez nie przenoszone kodują takie właściwości jak oporność na antybiotyki lub zdolność do wykorzystywania jako źródła węgla złożonych związków np. toluenu)- lecz równie dobrze mogą funkcjonować pozbawione plazmidów.

Prokarioty mają zasadniczo mniej genów niż Ecaryoty:

Prokarionty w chromosomie na odc. o podobnej dł. zawierają więcej genów

Tylko nieliczne geny Procaryota są nieciągłe- większość ma strukturę ciągłą( brak intronów), np. drożdże w całym genomie zawierają 239 intronów, podczas gdy wyższe eucaryota zawierają tylko w jednym genie ponad 100 intronów.

Procaryoty prawie w ogóle nie posiadają sekwencji powtarzających się rozproszonych w genomie, np. u drożdży stanowią one tylko ok. 3,4% genomu, a u wyższych eucariotów ponad 80% i więcej.

Podsumowanie: genomy Procaryota są bardzo oszczędne- mało krótkich intronów oraz odcinków niekodujących. Mniej genów niż u Eucaryota. Ale bywa, że na odcinku o tej samej długości u procaryota jest więcej genów niż u Eucaryota. U Eucaryota jest bardzo dużo sekwencji niekodujących i powtarzających się np. u Homo sapiens koduje tylko 90Mb, reszta to DNA niekodujący, ale związany z genami (819MB) oraz pozagenomowy 2100Mb(sekwencje o małej liczbie kopii i powtarzające się).

3. Jak sklonować: 1) siebie, 2) swoją matkę (w wieku 65 lat) oraz 3) swego sąsiada? Proszę opisać procedurę klonowania reprodukcyjnego, która chociaż zakazana w odniesieniu do człowieka, została przeprowadzona przy udziale wolontariuszy do fazy ludzkiej blastocysty.

Odpowiedź:

Siebie, swoja matkę, oraz sąsiada możemy sklonować wykorzystując procedurę klonowania reprodukcyjnego. Polega to na pobraniu od kobiet oocytów, które zostają pozbawione jąder. Następnie pobiera się także od dawców komórki np. skóry (fibroblasty), by je następnie wykorzystać w procedurze klonowania (a konkretnie jądra pochodzące z tych komórek). W przypadku gdy chcemy sklonować siebie-my jesteśmy dawcami komórek, gdy chcemy klonować mamę- mama. W przypadku sąsiada jest tak samo. Do oocytów pozbawionych jąder (enukleowanych) wstrzykuje się jądra tych pobranych fibroblastów. W wyniku tych procedur uzyskuje się zarodek. Zarodek się dzieli. W stadium blastocysty wszczepia się go do macicy kobiety. W konsekwencji uzyskamy dziecko będące klonem dawcy jądra fibroblastu-czyli albo ja albo mama albo sąsiad. (Wzięcie jądra komórkowego (czyli informacji genetycznej) z jednej komórki dojrzałego organizmu i przeniesienia jej do niezapłodnionej komórki jajowej. Jeśli z tego rozwinie się osobnik, będzie on genetycznie identyczny z osobnikiem, od którego pobrano komórkę. Tak powstała owca Dolly - pierwszy sklonowany ssak).

4. Proszę przeprowadzić procedurę transgenizacji u roślin i zwierząt w wybranym przez siebie celu . Dlaczego zwierzęta transgeniczne często chorują?

Odpowiedź:

Organizmy Transgeniczne - są to organizmy które zawierają w swoim genomie (czyli informacji genetycznej organizmu) obce geny, pochodzące z obcego organizmu.

Osobniki transgeniczne otrzymuje się obecnie trzema metodami:

• Mikroiniekcja - w metodzie tej DNA wprowadza się bezpośrednio do jądra zapłodnionej komórki jajowej, dokonując stosownych operacji pod mikroskopem. Metoda ta jest technicznie trudna, to jednak jest powszechnie stosowana w celu uzyskania zwierząt transgenicznych.

• Infekcja wczesnego zarodka zrekombinowanym wektorem pochodzenia wirusowego.

• Modyfikację genetyczną pierwotnych komórek węzła zarodkowego i wprowadzenie ich do zarodka stadium blastocysty, ponieważ komórki węzła zarodkowego są zdolne do różnicowania się we wszystkie trzy typy komórek.

W celu wytworzenia zwierząt transgenicznych stosuje się następujące techniki:

• Rekombinacje DNA-dotyczy manipulacji na poziomie DNA. Obejmuje:

• izolacje genów, łączenie różnych fragmentów DNA (rekombinacja)

• oraz powielanie tego DNA głównie przez amplifikacje metodą PCR. W wyniku rekombinacji powstają nowe geny nie istniejące w naturze, mające nowa funkcję.

• Transfer genów-polega na mikroiniekcji transgenu do przedjądrza zapłodnionego oocytu (zygoty). Transfer polega na uzyskaniu zapłodnionych oocytów od superewoluowanej dawczyni stymulowanej przez hormony;

• mikroiniekcji DNA do oocytów;

• transferze zarodków do hormonalnie zsynchronizowanych biorczyń (po kilku godzinach dzielące się zarodki wprowadza się przez zabieg chirurgiczny do jajowodu zastępczej matki i oczekuje rozwinięcia ciąży).

Drugi sposób:

Metoda polegająca na modyfikacji genetycznej zarodkowych komórek macierzystych (ES) i wprowadzenie ich do zarodka w stadium blastocysty. Zarodkowe komórki macierzyste są zdolne do różnicowania się we wszystkie typy komórek, wiec osobniki dorosłe pochodzące z tego zabiegu składają się z 2 linii komórkowych. Pierwsza linia pochodzi z zarodkowych komórek macierzystych (niemanipulowanych), a druga z zarodkowych komórek macierzystych (manipulowanych), w których ekspresji ulega gen. Osobniki takie są zatem chimerami. Chimery następnie krzyżuje się między sobą i uzyskuje zwierzęta homozygotyczne pod względem obecności trans genu.

I tutaj własnie pojawia się ryzyko wystąpienia choroby! Bo zeby otrzymac osobniki trnasgeniczne musimy je ze soba krzyzowac az do skutku przez co rosnie inbred i homozygotycznosc, a spada odpornosc, no i w z wiazku z tym polimorfizm MHC i pojawiaja sie zaburzenia genetyczne.

Metody transgenizacji roślin :

Naturalny system wprowadzania DNA - plazmidy Agrobacterium jako wektory DNA dla roślin dwuliściennych. Plazmidy Ti z Agrobacterium tumefaciens. Część tego plazmidu tzw. T-DNA długości około 23 kb po zakażeniu ulega integracji z genomem rośliny i właśnie zamiast tego odcinka możemy wstawić obce DNA. Na obu jego końcach leżą krótkie powtórzenia (24-25 bp) niezbędne do integracji z genomem. W procesie przenoszenia T-DNA do komórki roślinnej uczestniczą także geny plazmidowego regionu vir i pewne geny zlokalizowane na chromosomie bakterii.

Modyfikacje zwierząt mają na celu głównie uzyskanie zwierząt o pożądanych cechach w hodowli - szybszy wzrost, większa wydajność, zastosowaniu ich w produkcji białek, enzymów, innych substancji wykorzystanych w przemyśle farmaceutycznym (jako bioreaktory), uodpornieniu na choroby. Modyfikacje zwierząt nie są tak popularne jak roślin, głównie ze względu na trudności w samym procesie modyfikacji, proces jest bardzo skomplikowany i trwa długo, koszty są bardzo duże. Zwierzęta modyfikowane genetycznie często chorują, czy są bezpłodne. Rośliny transgeniczne dzięki modyfikacjom genetycznym nabierają odporności przede wszystkim na herbicydy (środki ochrony roślin) i szkodniki owadzie (pędów i korzeni), ale także i niekorzystne warunki środowiska (suszę, mróz, zasolenie gleby). Są też wykorzystywane do produkcji farmaceutyków, np. szczepionek, przeciwciał.

5. Na czym polega prawdziwa terapia genowa (germinalna) w leczeniu chorób dziedzicznych? Czy terapia ta możliwa jest do zastosowania w chorobach nowotworowych i wirusowych (np. AIDS)?

Odpowiedź:

Znana od lat 80 XX wieku terapia genowa jest metodą umożliwiającą leczenie wielu schorzeń na poziomie molekularnym. Aby uzyskać efekt terapeutyczny, do komórek docelowych pacjenta wprowadzany jest preparat genowy zawierający prawidłową kopię genu (najczęściej w postaci cDNA - bezintronowej sekwencji kodującej aminokwasy) lub oligonukleotydy (krótkie fragmenty kwasów nukleinowych - DNA lub RNA).

Genoterapia polega na próbie naprawy uszkodzonego genu czy też zablokowaniu ekspresji uszkodzonego genu. Stosuje się ją w schorzeniach takich jak choroby genetycznie uwarunkowane, nowotworach oraz schorzeniach wirusowych (głównie AIDS).

Wyróżnia się dwa rodzaje terapii genowej: germinalną i somatyczną. Terapia germinalna dotyczy komórek rozrodczych (gamet), z których powstanie nowy organizm lub komórek we wczesnym stadium zarodkowym. Tak wprowadzona zmiana jest dziedziczna tzn. przekazywana komórkom potomnym przy podziałach komórkowych. Natomiast terapia somatyczna polega na wprowadzeniu preparatu genowego do komórek ciała (są nimi wszystkie typy komórek poza gametami). W tym przypadku wprowadzona zmiana nie jest dziedziczna, a leczenie ma charakter zachowawczy tzn. że wprowadzony gen powoduje złagodzenie lub usunięcie objawów choroby, natomiast pierwotny defekt nie jest usuwany i mutacja odpowiedzialna za powstanie choroby pozostaje obecna w DNA wszystkich komórek chorego i może być zgodnie z prawami dziedziczenia przekazywana następnym pokoleniom. Obecnie u ludzi stosowana jest wyłącznie terapia somatyczna. Terapia germinalna jest prawnie zakazana ze względu na aspekty dotyczące bezpieczeństwa oraz aspekty etyczne.

Całkowita eliminacja defektu genetycznego może nastąpić jedynie w wynik naprawy błędu (mutacji) w DNA komórki rozrodczej, luba na bardzo wczesnym etapie rozwoju zarodka. Taki rodzaj leczenia gdyby istniał, były terapią określaną jako germinalna.

Terapie genową można wykorzystac jak najbardziej w leczenie AIDS i nowotworach. Wykorzystuje się w tym celu leki genetyczne oparte na strategi „antysensu”. Te leki oparte są na antysensownych oligonukeotydach AON. Te oligonukleotydy (czyli krótkie fragmenty DNA i RNA) są komplementarne do strategicznych rejonów wirusowego mRNA, hamują specyficznie jego replikacje, a zatem rozwój.

Zastosowanie AON jest niezwykle obiecujące. Metoda ta jest niezwykle specyficzna. AOn eliminują szkodliwe geny i ich transkrypty. Wystarczy znac krótką sekwencje oligonukleotydową na podstawie której konstruuje się jednoniciowy RNA komplementarny do mRNA wirusa. On będzie się wiązał z tym mRNA i spowoduje zablokowanie jego translacji na rybosomy.

Wg kogos z 3 grupy:

TG może być stosowane w leczeniu AIDS. Stosowane są aktualnie dwie strategie leczenia. Pierwsza z nich polega na wewnątrzkomórkowej immunizacji zmierzającej do wytworzenia „odporności” komórek na zakażenie wirusem HIV, w sensie zmiany tropizmu komórkowego, zahamowania replikacji wirusa i ograniczenia infekcji HIV w zakażonym organizmie. Druga metoda wzmacnia odporność przeciw wirusową poprzez użycie genetycznie modyfikowanych komórek wykazujących ekspresję produktów wirusów HIV w celu indukcji specyficznej odporności. Wytwarza się szczepionki genetyczne, w których są zmodyfikowane limfocyty CD4.

W przypadku nowotworów znane są trzy metody leczenia.

• Kompensacyjna mutacja onkogenów i genów supresorowych, czyli inhibicja funkcji onkogenu i przywrócenie funkcji genu supresorowego poprzez:

1. zatrzymanie procesu transkrypcji określonego onkogenu

2. zatrzymanie procesu translacji na matrycy m RNA określonego onkogenu- zastosowanie antysensownego oligonukleotydu, który hybrydyzuje z kodującymi sekwencjami mRNA onkogenu.

3. zablokowanie funkcji onkoprotein w komórkach docelowych- wykorzystanie wewnątrzkomórkowych przeciwciał, które blokują działanie onkoprotein

4. d)zastąpienie form zmutowanych genów supresorowych formą niezmutowaną (dziką) tych genów.

• Molekularna chemioterapia

1. a)wprowadzanie „genów samobójców”- do komórek nowotworowych wprowadza się geny kodujące toksyny powodujące uwrażliwienie komórek na niszczące działanie lub toksyny niszczące działanie toksycznych metabolitów obejmujących komórki prawidłowe i nowotworowe.

2. podawanie genów odporności na leki

- ochrona komórek prawidłowych- głownie macierzystych szpiku przed działaniem dużych dawek leku stosowanego w chemioterapii,

- podawanie genów usprawniających wpływ konwencjalnego leczenia- np. uwrażliwienie komórek nowotworowych na chemio- i radioterapie.

• Genetyczne „wzmocnienie” odpowiedzi immunologicznej poprzez modyfikację komórek efektorowych i nowotworowych.

6. Dlaczego samice ssaków nie chorują na schorzenia sprzężone z płcią, mimo iż we wszystkich komórkach samic (analogicznie jak w komórkach samców) czynny jest tylko jeden z chromosomów X?

Odpowiedź:

Chromosom X - u człowieka i innych ssaków chromosom płciowy, którego obecność w dwóch kopiach w komórkach organizmu determinuje płeć żeńską. Faktyczną obecność "Chromosomu X" określa informacja zawarta w iRNA.

W początkowych etapach rozwoju embrionalnego kobiety jeden z dwóch chromosomów X w niemal wszystkich komórkach somatycznych ulega losowej inaktywacji. Proces ten nazywa się lionizacją, a w jego wyniku powstaje tzw. ciałko Barra. Celem tej inaktywacji jest zmniejszenie różnic w aktywności genów położonych na chromosomie X między osobnikami żeńskimi a męskimi.

Chromosom X zawiera wiele genów, które są ważne dla wzrostu rozwoju. Chromosom Y jest dużo mniejszy i zawiera mniej genów.

A dlaczego jest tak, że kobiety chorują znacznie rzadziej od mężczyzn, mimo iż we wszystkich komórkach samic (analogicznie jak w komórkach samców) czynny jest tylko jeden z chromosomów X?

Kobiety mają dwa chromosomy X (XX). Mimo iż jeden ulega inaktywacji (a dokładnie wyciszeniu), nadal aktywna jest mniej więcej jedna czwarta genów na nim. Dlatego jeśli jeden z genów znajdujących się na chromosomie X posiada zmianę, prawidłowy gen na drugim chromosomie X może równoważyć obecność zmienionej kopii. W tym przypadku kobieta jest zdrową nosicielką choroby sprzężonej z chromosomem X. Bycie nosicielką oznacza, że nie jesteś chora, ale niesiesz zmienioną kopię genu. W niektórych przypadkach, u kobiet występują łagodne objawy choroby.

Mężczyźni mają chromosom X oraz Y (XY) i dlatego, jeśli jeden z genów na chromosomie X mężczyzny ma zmianę, nie ma on drugiej kopii tego genu, która mogłaby równoważyć obecność zmienionej kopii. To oznacza, że będzie on dotknięty chorobą. Choroby, które są dziedziczone w taki sposób są nazywane chorobami recesywnymi sprzężonymi z chromosomem X. Niektóre z przykładowych chorób sprzężonych z chromosomem X to hemofilia A oraz dystrofia mięśniowa Duchenne'a.

7. Dlaczego zwierzęta zinbredowane obarczone są większym ryzykiem upośledzenia procesów odpornościowych w porównaniu do zwierząt pochodzących z kojarzeń wolnych? Zjawisko to proszę zilustrować na przykładzie opracowanego przez siebie rodowodu tabelarycznego oraz haplotypu MHC.

Odpowiedź:

Geny układu zgodności tkankowej to kompleks genów, które posiada każdy ssak zarówno łożyskowy jak i niełożyskowy, nie występuje natomiast u ptaków.

Skupienie genowe- w jego skład wchodzi ponad 150 genów, które działaja jak jeden gen, ponieważ nie zachodzi tutaj crossing-over. Tylko 1% populacji wymienia te geny, w ten sposów powstają kombinacje genów rodziców. Skupień genowych w genotypie jest wiele, u człowieka skupienie genowe wystepuje w 6 chromosomie.

Zmienność w tych genach jest bardzo duża, wyznaczają ja klasyczne mutacje, re aranżacje, chociaż nie zachodzi tutaj Crossing-overto powstają nowe kombinacje genów w procesie segregacji w czasie mejozy. Wobec tego geny te są polimorficzne, oznacza to że ten sam gen występuje w wielu formach. MHC-Główny kompleks zgodności tkankowej, u ludzi zwany HLA(Human Leukocyte Antigens). Haplotypy MHC ulegają skupieniu we wszystkich komórkach ssaków prócz dojrzałych erytrocytów i plemników. Produktami genowymi są histoglobuliny (super rodzina immunoglobulin). Stanowią one pierwszą część obrony immunologicznej organizmu. Atak drogą humoralną jest to atak przez płyny ustrojowe.

Jeśli jakiś antygen wejdzie do ustroju, względnie komórki nowotworowe zostają one rozpoznane przez mechanizmy obronne, ponieważ obcy antygen ma obce histoglobuliny. W ten sposób jest rozpoznawany i niwelowany, w czym niewątpliwy udział maja limfocyty B oraz limfocyty T. Odpowiedź immunologiczna odbywa się przez produkty genowe. Rozpoznawanie antygenu jest powolne, ale bardzo dokładne. Część komórek limfocytów przechodzi potem w tzw. Kom pamięci pozwalające następnie szybko reagować podczas kolejnej infekcji.

Geny układu MHC kodują produkty będące histoglobulinami zwane antygenami klasy I i II lub antygenami transplantacyjnymi. Układ zgodności tkankowej, zwany głównym, odgrywa główną rolę w reakcji immunologicznej ustroju. Histoglobuliny prezentują obce lub własne zmienione antygeny-własnym, immunologicznie kompetentnym limfocytom T, w celu neutralizacji prezentowanych antygenów. Główny układ zgodności tkankowej u ssaków zawiera geny histoglobulin zwane antygenami zgodności tkankowej.

Polimorfizm MHC- oznacza, że w większości loci tego kompleksu występują długie szeregi alleli. Konsekwencja tego jest duża różnorodność fenotypów (histoglobulin-antygenów MHC)oraz haplotypów, których kombinacja daje aktualny genotyp. Prawie każdy osobnik ma niepowtarzalny genotyp MHC. Niespokrewnieni partnerzy płciowi zazwyczaj różnią się między sobą i są heterozygotami w większości loci.

Zróżnicowanie histoglobulin MHC powoduje to, iż mogą one prezentowac różne grupy antygenowe. Im większy polimorfizm MHC tym większa możliwość zwalczania infekcji. Np., gdy dana choroba występuje endemicznie, te osobniki, które przetrwają dają odporne potomsto, a frekwencja określonych haplotypów w populacji wzrośnie. Infekcja stanowi w tym przypadku element selekcji naturalnej.

Dlatego ma to ogromne odczucie podczas kojarzenia w pokrewieństwach, kiedy to dochodzi do powstania zinbredowanych potomków. Polimorfizm MHC jest mniejszy tym samym układ odpornościowy jest bardziej narazony na infekcje.

Układ MHC dziedziczy się w całości i zachowuje jako jeden gen.

Haplotypy:

Rodzeństwo jest podobne w 25%, rodzice maja z dzieckiem tylko jeden wspólny haplotyp

8. Czy rodzeństwo pełne, wskutek działania pewnego zjawiska zachodzącego zawsze podczas mejozy, może nie posiadać w ogóle wspólnych genów przez pochodzenie, czyli być sobie całkowicie obce?

Odpowiedź:

W mejozie zachodzą pewne zjawiska dzięki którym istnieje możliwość aby rodzeństwo nie posiadało wspólnych genów. Podczas mejozy powstaje komórka o zredukowanej liczbie chromosomów, dzięki czemu w procesie zapłodnienia zostaje odtworzona diploidalna komórka. Komórki haploidalne powstające po podziale posiadają nowe kombinacje genów. Wynika to z faktu, że do jąder potomnych wędrują przypadkowe chromosomy spośród chromosomów homologicznych (anafaza I), a poza tym w trakcie mejozy następuje również losowa wymiana części chromatyd chromosomów homologicznych pochodzących od obojga rodziców (crossing-over) świadcząca o zmienności genetycznej. Zjawisko polegające na wzajemnej wymianie odpowiadających sobie położeniem odcinków chromatyd chromosomów homologicznych. Prowadzi do powstania nowych układów genowych, czyli do rekombinacji genetycznej. Zachodzi w czasie profazy I podziału mejotycznego, w pachytenie.

Podczas crossing-over następuje wymiana odcinków między chromosami homologicznymi. W wyniku rekombinacji podwójna nić DNA zostaje przerwana, a następnie ponownie połączona zarówno w chromatydzie matczynej, jak i w homologicznej chromatydzie ojcowskiej. Fragmenty dwóch niesiostrzanych chromatyd ulegają wzajemnej wymianie. Rekombinacja zachodząca podczas mejozy jest głównym źródłem zmienności genetycznej. W wyniku wymiany informacji genetycznej, która zachodzi w każdym z chromosomów w gametach, crossing-over ułatwia tworzenie osobników mających nowy zestaw genów.

Bliźnięta jednojajowe, które rozwijają się z pojedynczej zygoty, są genetycznie identyczne. W innych sytuacjach rodzeństwo nie jest genetycznie takie samo. Dzieje się to, ponieważ nawet przed zapłodnieniem, podczas mejozy zachodzą dwa rodzaje losowych zmian genetycznych. Po pierwsze chromosomy ojcowskie i matczyne są podczas mejozy tasowane i rozdzielane do gamet. Podczas mejozy w każdej parze ludzkich chromosomów może występować od dwóch do trzech crossing-over. Segregacja chromosomów podczas mejozy, łącznie z rekombinacją genów, która występuje podczas crossing-over, stanowi prawie nieograniczone źródło zmienności genetycznej w gametach wytwarzanych przez pojedynczego osobnika. Zjawisko losowej segregacji chromosomów podczas tworzenia gamet daje liczbę możliwych kombinacji chromosomów w gametach wynosi 223 . Powoduje to wystąpienia u człowieka ponad 83mln. Różnych możliwych kombinacji chromosomów w gametach każdego z rodziców. W zygocie możliwość kombinacji wzrasta do 246. Dalszego wzrostu zmienności dostarcza właśnie crossing-over:

Crossing - over przez wymianę fragmentów chromatyd niesiostrzanych w obrębie homologów zwiększa zmienność i niepowtarzalność gamet, a w konsekwencji zygot.

Gamety zawierają tylko po jednym (losowo wysegregowanym) chromosomie z każdej pary.

Łączenie gamety w zygotę jest procesem losowym. Oznacza to, że dobór w parę homologu matczynego i ojcowskiego podczas powstawania zygoty jest przypadkowy.

9. Jakie zjawiska muszą zajść w komórkach linii płciowej, by zygota została obciążona disomią uniparentalną? Dlaczego disomia jednorodzicielska prowadzi do patologii w organizmie? Czy disomia uniparentalna w skrajnym przypadku może przyjąć formę partenogenezy?

Odpowiedź:

Termin uniparentalna disomia (UPD) - disomia jednorodzicielska- określa taki układ somatycznych chromosomów organizmu, w którym oba autosomy danej pary pochodzą od tego samego rodzica. Pozostałe pary chromosomów są prawidłowe, co oznacza, że w każdej pozostałej parze jeden chromosom pochodzi od matki, drugi zaś od ojca. Istnieją dwie formu UPD:

• Uniparentalna heterodisomia (UPHD), gdy dwa różne homologi pochodzą od jednego rodzica;

• Uniparentalna izodisomia (UPID), gdy ten sam homolog występuje dwukrotnie.

Obie te anomalie chromosomowe są konsekwencją zaburzeń mejozy. Jeżeli nondysjunkcja (chromosomy homologiczne nie rozdzielają się prawidłowo i do jednej z gamet wędruje cała tetrada (ta gameta będzie mieć o jeden chromosom za dużo, czyli n + 1), zaś do drugiej nie wędruje żaden chromosom z tej pary (n - 1). Przyczynia się do powstawania mutacji chromosomowych - liczbowych.) miała miejsce w I podziale mejotycznym, to występuje UPHD, jeżeli w drugim, to mówimy o UPID.

Dlaczego disomia prowadzi do patologii w organizmie?

Eksperymenty wykazały, że zarodki z pełnym zestawem chromosomów pochodzących tylko od jednego rodzica nie mogą się rozwijać prawidłowo. Doświadczenie przeprowadzone na myszach polegające na mikrochirugicznej wymianie przedjądrzy w zapłodnionym jaju. Przedjądrze męskie powstaje z jądra plemnika, który wniknął do komórki jajowej, natomiast przedjądrze żeńskie powstaje z chromosomów komórki jajowej. Początkowo oba przedjądrza można od siebie odróżnić. W omawianym doświadczeniu usuwano jedno z przedjądrzy i wprowadzano drugie, tak, aby uzyskana zygota zawierała dwa przedjądrza męskie albo dwa przedjądrza żeńskie. Porównywano rozwój normalnego zarodka zawierającego po jednym przedjądrzu męskim i żeńskim z rozwojem zmodyfikowanych zarodków zawierających przedjądrza tego samego rodzaju. Okazało się, że tylko normalne zarodki były zdolne do pełnego rozwoju. Zarodki gynogenetyczne (z oboma przedjądrzami żeńskimi) zamierały z powodu niedorozwoju struktur pozazarodkowych (trofoblastu). Zarodki androgenetyczne (z oboma przedjądrzami męskimi) zamierały z powodu niedorozwoju właściwego zarodka. Całe to zjawisko nazwane jest impritingiem genomowym (Pietno jednorodzicielskie).

Imprinting genomowy (rodzicielskie piętno genomowe) - polega na różnym stopniu metylacji genów w komórkach jajowych i komórkach plemnikowych. Gen jest metylowany na allelu pochodzącym od jednego z rodziców. Nakładanie imprintingu zachodzi w czasie gametogenezy. Wtedy jest znoszony wzór metylacji odziedziczony po rodzicach i nakładany nowy, zależny od płci. Do zmetylowango nukleotydu nie mogą się przyczepić czynniki transkrypcyjne, co powoduje wyciszenie genu.
Zjawisko to pozwala zapobiegać partenogenezie, która jest możliwa u niewielkiej liczby gatunków (np. u pszczół) i powoduje zmniejszenie zmienności organizmów. Imprinting jest wynikiem konkurencji materiału genetycznego żeńskiego (przekazywanie genów, wychowanie potomstwa) i męskiego (odżywianie i rozwój zarodka).

Partenogeneza - dzieworództwo, odmiana rozmnażania bezpłciowego polegająca na rozwoju osobników potomnych jedynie z niezapłodnionej komórki jajowej, bez udziału plemnika.

Wg kingi :

Gdy do UDP dołączy się zrównoważona translokacja robertsonowska (łącza się całe lub prawie całe ramiona długie chromosomów), występują wady rozwojowe. Miejscem połączenia jest rejon centromeru. Dochodzi do utraty ramion krótkich. W kariotypie stwierdza się brak chromosomu. W badaniach wykazano, że dzieci z zespołem Prasera- Willego, dziedziczyły po matce obie kopie odcinka chromosomu 15. Natomiast dzieci, które ten sam fragment chromosomu 15 otrzymują w podwójnej licznie od ojca , chorują na zespół Angelmana polegający na niedorozwoju umysłowym i gwałtownych, krótkich ruchach. Zjawiska te tłumaczy się tzw. genomowym piętnem jednorodzicielskim. U chorych stwierdza się upośledzenie umysłowe, niski wzrost, otyłość, obniżenie napięcia mięśni oraz hipogonadyzm; mają oni również małe dłonie i stopy.

Dla zespołu Prader-Willi (PWS): objawy : obniżone napięcie mięśniowe (hipotonia mięśni), upośledzone uczucie sytości, zaburzenia oddychania, częste oddawanie moczu w nocy, zaburzenia termoregulacji, obniżony próg odczuwania bólu, upośledzony odruch wymiotny, zaburzenia wydzielnicze neurohormonów powodujące upośledzenie przebiegu procesu wzrastania” (obniżona synteza i/lub wydzielanie hormonu wzrostu i/lub insulino-podobnego czynnika wzrostu - I) i zaburzenia wydzielnicze neurohormonów powodujące m.in. hipogonadyzm. Za uszkodzeniem rejonu podwzgórzowo- przysadkowego przemawiają również badania obrazowe - rezonansem magnetycznym, uwidaczniające częste występowanie ektopii lub hipoplazji tylnego płata przysadki. W badaniach autopsyjnych stwierdza się ponadto zmniejszenie pól jąder przykomorowych, zmniejszenie liczby neuronów oksytocynowych, jak i rejonów wydzielających neurohormon uwalniający hormon wzrostu (GH-RH), co powoduje niedobór hormonu wzrostu (GH) i w konsekwencji niedobór insulino-podobnego czynnika wzrostu - I (IGF-I). U chorych z zespołem Prader-Willi stwierdzono także podwyższone stężenie ghreliny, co może tłumaczyć brak uczucia sytości, a powodowane może być to defektem „genu piętnowanego” (pochodzącego od ojca) o nazwie SNRPN, zlokalizowanego w odcinku podcentromerowym (11-13) długiego ramienia chromosomu 15. Defekt w obrębie sekwencji, zwana IC - imprinting centrum genu SNRPN, powoduje brak prawidłowego piętnowania chromosomu ojcowskiego i jego funkcjonalne podobieństwo do chromosomu matczynego. Tak więc choroba ujawnia się w następujących defektach:

delecja 15q 11-13 chromosomu ojcowskiego (ponad połowa przypadków PWS),

disomia uniparentalna matczyna odcinka 11-13 długiego ramienia chromosomu 15, tzn. obecny jest materiał genetyczny pochodzący wyłącznie od matki (25-30% chorych z PWS).

Gdy komórki z podwójnym materiałem matczynym z brakiem chromosomów ojcowskich (tj. partenogeneza) są całkowicie niezdolne do namnażania

10. Z ilu chromatyd składa się chromosom eukariotyczny w fazie G1 oraz w fazie G2 komórki? Do jakich konsekwencji prowadzi crossing over w komórce somatycznej, a do jakich w komórkach linii płciowej?

Odpowiedź:

Chromosom eukariotyczny w fazie G1 składa się z 1chromatydy. A w fazie G2 z dwóch. Faza G1 to faza, którą poprzedza zakończony podział mitotyczny i jest fazą wzrostową komórki. Następuje synteza różnych rodzajów białek, m.in. strukturalnych czy enzymatycznych i zwiększenie organelli takich jak mitochondria, czy lizosomy. Komórka w tej fazie zwiększa swoją masę i objętość, osiągając stadium komórki macierzystej. Pod koniec fazy G₁ dochodzi do syntezy specjalistycznych białek regulatorowych, odpowiedzialnych za przejście komórki w fazę S. A więc tu chromosom składa się z 2 chromotydy. Z kolei faza G2 to faza gdzie następuje synteza białek wrzeciona podziałowego, głównie tubuliny jak również składników błony komórkowej potrzebnych do jej wytworzenia po zakończonym podziale. Pod koniec fazy G₂ dochodzi do syntezy specjalistycznych białek regulatorowych, odpowiedzialnych za przejście komórki w mitozę. Skoro faza G2 jest po fazie S ( czyli fazie replikacji DNA ) to tu chromosom składa się z 2 chromatyd.

Crossing-over - to proces wymiany materiału genetycznego między chromosomami homologicznymi (chromatydami siostrzanymi), w wyniku którego zwiększa się zmienność genetyczna. Odkrywcą procesu crossing-over był Thomas Morgan.

W przypadku jeżeli proces zachodzi w komórce somatycznej, zjawisko to nazywamy rekombinacja somatyczną lub mitotycznym crossing over. Skutki tej wymiany w komórce somatycznej mogą prowadzić do nowotworzenia.

Ten sam proces jeżeli zachodzi w komórce linii płciowej podczas mejozy (co jest typowe) prowadzi przez wymianę fragmentów chromatyd nie siostrzanych w obrębie pary chromosomów homologicznych, do zwiększenia zmienności i niepowtarzalności gamet, a w konsekwencji zygot. W wyniku tego procesu powstają rekombinanty (osobniki o innej kombinacji układu genów). Czyli po prostu zwiększa się zmienność genetyczna.

11. Znaczenie antygenów głównego układu zgodności tkankowej w odporności zwierząt.

Odpowiedź:

Główny układ zgodności tkankowej (MHC) - zespół białek (glikoproteiny), odpowiedzialnych za prezentację antygenów limfocytom T. Swoją nazwę zawdzięczają temu, że zostały odkryte jako pierwsze i najważniejsze białka decydujące o utrzymaniu się lub odrzuceniu przeszczepu, a zatem odpowiadające za zgodność tkanek dawcy i biorcy. MHC obejmuje wiele genów odznaczających się największym polimorfizmem z dotychczas poznanych. Mają one podstawowe znaczenie zarówno w inicjacji, jak i w fazie efektorowej odpowiedzi immunologicznej. Wyróżniamy trzy klasy MHC, które różnią się pełnionymi funkcjami:

• MHC klasy I znajdują się na wszystkich jądrzastych komórkach organizmu i uczestniczą w obronie przed patogenami wewnątrzkomórkowymi;

• MHC klasy II występują na specjalnej klasie komórek - komórkach prezentujących antygen(komórki dendrytyczne, limfocyty B, makrofagi).

• MHC klasy III stanowią różne cząsteczki, niezwiązane z procesem prezentacji antygenu.

Ludzkie MHC określane są mianem HLA (ang. human leukocyte antigens - ludzkie antygeny leukocytarne).

MHC jest głównym czynnikiem warunkującym odrzucenie obcych tkanek. Białka te są niezwykle silnymi, immunogennymi antygenami, w związku z tym komórki, na których występują, są natychmiast rozpoznawane jako obce. Stąd też dopasowanie białek MHC ma kluczowe znaczenie w doborze dawcy i biorcy przeszczepu. Im większa niezgodność pomiędzy allelami u dawcy i biorcy, tym większe prawdopodobieństwo odrzucenia przeszczepu i tym szybciej proces ten następuje.

Początkowo zainteresowanie MHC wynikało z jego roli w odrzucaniu obcych tkanek. Następnie stało się jasne, że MHC odgrywa główną rolę w reakcji immunologicznej na obce antygeny. Rola MHC polega na takim uczuleniu limfocytów T, aby za pomocą kompleksów TCR ( receptory komórek T, obecne na powierzchni tych limfocytów - one rozpoznają antygeny przetworzone, występujące na powierzchni komórki w połączeniu z MHC. W limf. Pomocniczych receptorom TCR towarzyszą koreceptory CD4 rozpoznające MHC kl. II, a limf. Cytotoksycznym koreceptory CD8, które rozpoznają MHC kl. I) w połączeniu z tymi koreceptorami CD4 i CD8 rozpoznawały i wiązały wszystkie nieswoiste antygeny.

Antygeny kl. I i II prezentują na powierzchni własnych komórek małe fragmenty obcego antygenu wirusa, bakterii, pasożyta. Tak prezentowany antygen jest rozpoznawany przez limfocyty T. Jeżeli komórki T rozpoznały antygen jako białko obce, które pojawiło się z wnętrza komórki (białko wirusowe w komórkach zakażonych, białka własne powstające w komórkach nowotworowych) to limfocyty T uruchamiają odpowiedź komórkową. Natomiast jeżeli antygen przybył z innego miejsca (z zewnątrz) uruchamiana jest reakcja zarówno komórkowa i humoralna. - w skrócie, najważniejszą funkcją MHC jest wiązanie i prezentacja antygenów limfocytom T.

12. Jak limfocyty uczą się odróżniać antygeny własne od obcych.

Odpowiedź:

Rozpoznawanie „obcości” przez limfocyty poprzedza swoistą odpowiedź immunologiczną. W istocie proces ten polega na rozpoznawaniu obcych antygenów przy braku możliwości identyfikowania autoantygenów. Do pełnienia takiej roli limfocyty są selekcjonowane podczas dojrzewania w centralnych narządach limfatycznych.

Wyróżniamy dwa rodzaje selekcji:

Pozytywna- tu akceptowane są komórki prawidłowo rozpoznające białka MHC gospodarza, giną zaś te, które w ogóle na rozpoznają białek MHC lub wykazują do nich zbyt duże powinowactwo.

Negatywna- dochodzi do kontaktu receptorów TCR występujących na powierzchni niedojrzałych jeszcze limfocytów ( tymocyty) z autoantygenami (własne antygeny) prezentowanymi na powierzchni splatających się komórek dendrytycznych oraz makrofagów. W wyniku tej selekcji eliminowane są limfocyty rozpoznające własne antygeny. Więc te które przezywają to te, które wykazują zdolność do rozpoznawania obcych antygenów.

13. Proszę wyjaśnić dlaczego system odporności błon śluzowych stanowi pierwszą linię obrony organizmu?

Odpowiedź:

Pierwszą linię obrony przed szkodliwymi czynnikami zewnętrznymi (zakażeniami, toksynami itd.) zapewniają bariery fizyczne, do których należą skóra i jej wytwory, śluz oraz błony śluzowe, znajdujące się w miejscach kontaktu organizmu ze środowiskiem zewnętrznym. Są nimi śluzówki, wyściełające przewód pokarmowy, powierzchnię układu oddechowego, drogi rodne i moczowe. W porównaniu ze skóra, błony śluzowe są delikatniejsze i bardziej podatne na uszkodzenia, ale w ich obrębie znajduje się tzw. Tkanka limfoidalna związana z błonami śluzowymi (MALT). Jej obecność w znacznym stopniu chroni organizm przed inwazją patogenów, pochodzących ze środowiska zewnętrznego. Jest to możliwe, ponieważ tu następuje skupianie antygenów i ich prezentacja komórkom odpornościowym oraz wydzielanie przeciwciał, głównie sIgA, co utrudnia antygenom penetracje do środowiska wewnętrznego organizmu przez błony śluzowe. Jeżeli jedna ta bariera zostanie sforsowana i organizm musi rozpocząć walkę z czynnikiem szkodliwym, wówczas rozwija się reakcja zapalna.

14. Obwodowe narządy limfatyczne jako miejsce przebiegu swoistej odpowiedzi immunologicznej.

Odpowiedź:

Obwodowe narządy limfoidalne:

• Węzły chłonne

• Śledziona

• Migdałki

• Grudki chłonne pojedyncze i skupione

• Naczynia chłonne

Są to narządy, które zapewniają warunki umożliwiające indukcję odpowiedzi immunologicznej. Stanowią miejsce rozpoznawania antygenu, współdziałania limfocytów T i B między sobą i komórkami pomocniczymi, proliferacji i różnicowania limfocytów, wytwarzania mediatorów procesów odpornościowych, wytwarzanie przeciwciał przez komórki plazmatyczne.

Śledziona jest narządem zbudowanym z miazgi białej i czerwonej. Zarówno w węzłach chłonnych jak i w miazdze białej śledziony występują obszary T i B zależne. W węzłach chłonnych obszar T zależny (czyli, że zawiera limfocyty T) znajduje się w strefie przykorowej, w śledzionie zaś- przylega do tętniczki środkowej. W obszarze tym oprócz limfocytów występują też splatające się komórki dendrytyczne prezentujące antygeny połączone z białkami MHC kl. II. W obu narządach obszar B zależny Staniowią pierwotne i wtórne grudki chłonne. W pierwotnych występują tylko spoczynkowe limf. B, a we wtórnych- także po aktywacji przez antygen, tworzące tzw. Ośrodki rozmnażania. W grudkach chłonnych znajdują się także komórki dendrytyczne, które ułatwiają limfocytom B rozpoznanie antygenu, bez udziału MHC.

15. Znaczenie cytokin w modulacji odpowiedzi immunologicznej.

Odpowiedź:

Funkcjonowanie układu odpornościowego polega na angażowaniu jego struktur (krążących komórek) do akcji skierowanych przeciwko rozpoznawanym antygenom. Reakcja immunologiczna powinna spełniać dwa podstawowe warunki: 1) skutecznie przeciwdziałać zagrożeniu wywołanemu przez antygen i 2) być bezpieczna dla organizmu. Spełnienie tych warunków wymaga jakościowej i ilościowej kontroli odpowiedzi immunologicznej w ścisłym powiązaniu z funkcjonowaniem innych systemów w organizmie. Niezbędna jest zatem sprawna komunikacja wewnątrz układu odpornościowego oraz pomiędzy tym układem a pozostałymi, a w szczególności z układem nerwowym i wewnątrzwydzielniczym. I właśnie komórki układu odpornościowego są zdolne do wytwarzania i wydzielania substancji, a także dzięki posiadanym receptorom- do reagowania na wiele sygnałów. Tymi wydzielanym substancjami są cytokiny!!! Cytokiny wywierają wpływ regulacyjny i modulujący na wiele procesów w organizmie :

• Wytwarzanie leukocytów

• Proliferacja i różnicowanie limfocytów T i B

• Stymulacja komórek efektorowych (np. NK, K, makrofagów)

• Selekcja klas wytwarzania przeciwciał

• Reakcja zapalna

• Gorączka

• Uwalnianie białek ostrej fazy

• W regulacji odpowiedzi immunologicznej kluczową role pełnią limf. T pomocnicze, które wytwarzają wiele cytokin.

16. Różnice w przebiegu odpowiedzi immunologicznej w trakcie infekcji wirusowej i bakteryjnej.

Odpowiedź:

Najważniejszą funkcją układu odpornościowego jest obrona przed mikroorganizmami. Jest on znakomicie przygotowany do tego zadania. Kiedy układ odpornościowy rozpoznaje zagrożenie obcym patogenem odpowiada z właściwą sobie precyzja i siłą.

W odporności przeciwwirusowej, podobnie jak w odpowiedzi przeciwbakteryjnej, pierwsza linię obrony stanowią mechanizmy nieswoiste. Jeśli jednak jest to powtórne zakażenie, istotna role będzie miała odpowiedź humoralna w postaci przeciwciał neutralizujących.

Oczywiście mechanizmy nieswoiste to bariery mechaniczne (skóra, błona śluzowa), komórki NK.

Spośród wewnątrzkomórkowych mechanizmów nieswoistych podstawowe znaczenie ma wytwarzanie interferonów typu I (alfa i beta) . Nie ma ich w infekcji bakteryjnej. Interferony działają nie tylko w zakażonych komórkach, ale również mogą chronić sąsiednie nie zakażone komórki, indukując w nich stan podwyższonej odporności przeciwwirusowej.

Dalej działają mechanizmy swoiste. Wytwarzane są przeciwciała. Aktywowane są limfocyty cytotoksyczne, limfocyty pomocnicze, które wspomagają odpowiedź humoralną i wydzielają wiele cytokin.

W odpowiedzi przeciwbakteryjnej również wyróżniamy mechanizmy nieswoiste i swoiste. Nieswoiste to tak samo jak w przypadku infekcji wirusowej bariery mechaniczne (skóra, błony śluzowe, perystaltykę, ruch rzęsek, zmienne pH, czy obecnośc wydzieliny śluzowo-surowiczej gdzie znajdują się lizozym, laktoferyna). Przedostanie się bakterii do wnętrza organizmu niemal natychmiast indukuje ostrą reakcję zapalną poprzez aktywację receptorów PRR, receptorów zmiataczy, receptorów dla składników dopełniacza. Aktywowany zostaje drogą klasyczną układ dopełniacza. Dochodzi wówczas do bezpośredniego niszczenia drobnoustrojów, jak i przyciągania granulocytów, makrofagów i komórek dendrytycznych do miejsca objętego procesem zapalnym. Fragmenty dopełniacza opłaszczają drobnoustroje ułatwiając fagocytozę. Celem ostrej reakcji zapalnej jest nie tylko próba powstrzymania infekcji ale także aktywacja swoistej odpowiedzi immunologicznej. ALE CZY TO WSZYSTKO???? I CZY OK.???

Wg natali z innej grupy:

Cechy infekcji wirusowej:

• Wirusy są obligatoryjnymi pasożytami wewnątrzkomórkowymi, więc nie mogą się namnażać poza komórkami żywiciela.

• Wiążą się z komórkami żywiciela za pośrednictwem swoistych receptorów.

• Po wejściu do komórki wirus ulega odpłaszczeniu i uwalnia kwas nukleinowy (DNA lub RNA).

• Wirusowy kwas nukleinowy może wiązać się z genomem komórki lub pozostać w cytoplazmie.

• W obu przypadkach dochodzi do transkrypcji i replikacji wirusa.

Nieswoiste mechanizmy obronne:

• Blokujące infekcję przeciwciała naturalne, składowe dopełniacza, niektóre chemokiny

• chroniące komórki przed zakażeniem interferony alfa, beta, omega, interferon-gamma

• niszczące lub hamujące komórki zakaźne-komórki NK, makrofagi, neutrofile, limfocyty T gamma delta

• regulujące antywirusową odpowiedź zapalną- interleukiny 1, 6, 10, 12, 18, TGF-beta, chemokiny

Mechanizmy odporności nieswoistej mogą działać praktycznie natychmiast po kontakcie z antygenem i często wystarczają do eliminacji patogenu. Niemniej jednak ich działanie nie jest tak precyzyjne jak w przypadku mechanizmów swoistych i nie zawsze daje możliwość usunięcia obcych antygenów. Ponadto odporność nieswoista nie może wytworzyć pamięci immunologicznej.

Wrodzone mechanizmy obronne;:

• Interferony: substancja pochodzenia białkowego (dokładniej glikoproteid), która wpływa hamująco na proces produkcji większości białek)

• komórki Nk: naturalne komórki cytotoksyczne- natura killer. Komórki Nk powstają w szpiku kostnym, występują w różnych tkankach organizmu, jednak najwięcej jest ich w krwioobiegu, gdzie stanowią 5-15% ogólnej liczby limfocytów. Mają receptory powierzchniowe dla fragmentu Fc IgG, a także receptory dla pewnych powierzchniowych cząsteczek nazwanych receptorami aktywującymi cytotoksyczność- KAR oraz hamującymi- KIR. Zasadniczą funkcją komórek Nk jest zabijanie własnych komórek zakażonych wirusami i niektórych komórek nowotworowych. Kiedy komórka Nk połączy się z własną komórką nie zakażoną, wówczas receptory KIR wysyłaja jej sygnał negatywny, zapobiegający zabiciu komórki własnego organizmu. Do cząsteczek regulujących zabijanie należa m.in. cząsteczki MHC klasy I kodowane przez geny regionów A, B, C , HLA. Jednakże infekcja komórek pewnymi wirusami zmniejsza na nich ekspresję czast. MHC, umożliwiając aktywację komórek Nk przez receptory KAR i pobudzenie ich do zabijania zakażonych komórek własnych. Jest to bardzo ważny mechanizm umożliwiający komórce Nk rozpoznawanie komórki własnej i zignorowaniejej, gdy jest zdrowa, bądź zabicie, gdy jest zakażona drobnoustrojami. Konsekwencja jest wysłanie sygnału o śmierci, wywołującego apoptozę zakażonej komórki. Komórki Nk po rozpoznaniu komórki własnej zainfekowanej wirusami ulegają aktywacji i wydzielają IFN-y, cytokina ta chroni sąsiadujące komórki przed infekcją wirusami. Podkreśla się jednak, iż w tej ochronie prawdopodobnie ważniejszą rolę odgrywa IFN-a i IFN-B. dodatkowo IFN-y wzmaga rozwój odpowiedzi specyficznych limfocytów T przeciwko komórkom zakażonym wirusami.

Nabyte mechanizmy obrony (swoiste):

• Przeciwciała - neutralizują wirus, ale działają wyłącznie zewnątrzkomórkowo (prodromalna faza infekcji)

• Cytotoksyczne limf. T - rozpoznają i niszczą komórki zainfekowane wirusem (apoptoza) zanim pojawią się nowe winiony

Odpowiedź przeciwbakteryjna zależy od:

• Typu bakterii- zewnątrz- lub wewnątrzkomórkowa

• Składu ściany bakteryjnej (Gram+, Gram-, Mykobakterie, Spirochaetae)

• Toksyczności i inwazyjności bakterii,

• Drogi rozpoznawania bakterii

• Wrót zakażenia

• Lokalizacji zakażenia (tkanki, narządu)

• Szybkości rozmnażania bakterii

• Fazy zmienności antygenowej

• Ligandów adhezji

• Komórki żerne, głównie granulocyty

• Układ dopełniacza i inne nieswoiste czynniki humoralne

• Przeciwciała, początkowo klasy IgM, następnie innych klas (IgG, IgA, IgE)

• Miejscowa lub układowa kaskada mechanizmów przeciwzapalnych takich jak przeciwdziałanie kolonizacji na błonach śluzowych i nabłonkach, opsonizacja, fagocytoza, neutralizacja toksyn bakteryjnych, inaktywacja i zabijanie bakterii

Odpowiedź immunologiczna na bakterie zewnątrzkomórkowe (odporność wrodzona)

• Komórki żerne- fagocyty, do których należą dwa główne typy- neutrofile i makrofagi. Charakteryzują się bardzo krótkim okresem półtrwania i giną w układzie krwionośnym w drodze apoptozy

• Układ dopełniacza i inne nieswoiste czynniki humoralne

• Przeciwciała, początkowo klasy IgM, następnie innych klas (IgG, IgA, IgE)

• Miejscowa lub układowa kaskada mechanizmów przeciwzapalnych takich jak przeciwdziałanie kolonizacji na błonach śluzowych i nabłonkach,

• opsonizacja- jest to proces, który powoduje, że bakteria staje się bardziej przystępna dla komórki żernej. Cząsteczki zdolne do spłaszczania bakterii, takie jak dopełniacz lub przeciwciała, ułatwiają kontakt i pochłonięcie drobnoustroju przez komórkę żerną

• Fagocytoza- proces wchłaniania bakterii składa się z kilku stadiów, przyciągania bakterii do miejsca infekcji, wytworzenia bezpośredniego kontaktu z drobnoustrojem, endocytozy i zabicia w drodze mechanizmów zależnych i niezależnych od tlenu, (neutralizacja toksyn bakteryjnych, inaktywacja i zabijanie bakterii)

Bakterie wewnątrzkomórkowe, znamienne cechy infekcji:

Patogen: przeżywalność wewnatrzkomórkowa, niska toksyczność dla żywiciela

Odpowiedź immunologiczna:

• zbyt słaba by wyeliminować patogen

• przewlekła i zależna od limfocytów T

• nadwrażliwość typu późnego- IV reakcje na antygen wynikają z pierwotnego zaangażowania limfocytów T. DTH występuje w kilkanaście godzin od narażenia na antygen, osiągając max w 24-48h. zmiany zapalne wynikają z działania cytokin wydzielanych przez limfocyty T, głównie pomocnicze, które miejscowo aktywują inne komórki, takie jka makrofagi, limfocyty T cytotoksyczne, czasem bazofile. Formy nadwrażliwości typu późnego: nadwrażliwość kontaktowa (wyprysk kontaktowy alergiczny, wyprysk kontaktowy niealergiczny), nadwrażliwość ziarniniakowa (trąd, gruźlica, sakroidoza, choroba Leśniowskiego-Crohna), odczyn tuberkulinowy

tworzenie ziarniniaków (niemożność zabicia wszystkich prątków w makrofagach często powoduje przewlekłą stymulację limfocytów T swoistych dla prątków. Limfocyty TCD4+ kontrolują rozwój infekcji wywoływanych prez mikroorganizmy wewnątrzkomórkowe, takie jak prątki. Problem ten polega na tym, że prątki, w porównaniu z innymi organizmami wewnątrz. Wywołującymi infekcje unikają mechanizmów prowadzących do ich eliminacji. Tak więc czynniki aktywujące makrofagi wytwarzane przez limfocyty T CD4+ nie zawsze są skuteczne. Antygen pozostaje nadal i powoduje przewlekłą stymulację limfocytów T CD4+ oraz ciągłe wytwarzanie cytokin. Stan ten powoduje łączenie się makrofagów, zawierających mikroorganizmy i proliferencję fibroblastów, co w rezultacie prowadzi do otoczenia mikroorganizmów ścianą i utworzenie ziarniaków.

17. Znaczenie przeciwciał monoklonalnych w diagnostyce i terapii.

Odpowiedź:

Przeciwciała monoklonalne czyli takie, które wykazują jednakową swoistość względem danego antygenu i ewentualnie takie samo lub podobno powinowactwo. Wszystkie takie przeciwciała otrzymuje się z jednego klonu limfocytów B.

Produkcja PM sprowadza się w skrócie do fuzji limfocytów B wytwarzających swoiste przeciwciała i komórek szpiczaka (nowotworu wychodzącego z szeregu rozwojowego limfocytów B). Swoistość przeciwciał wytwarzanych przez tak otrzymaną hybrydę określał limfocyt B, z którego ona powstała. Komórka szpiczaka natomiast, jako komórka nowotworowa, nadaje hybrydzie „nieśmiertelność”.

Przeciwciała monoklonalne są już używane jako leki, prowadzonych jest też coraz więcej badań nad ich potencjalnymi, przyszłymi zastosowaniami. Główne ich zastosowania to:

• Terapia nowotworów. Przykładem może by Mylotrag, który jest używany w leczeniu ostrej białaczki szpikowej;

• Immunosupresja w transplantologii, dająca możliwość wybiórczego hamowania odpowiednich subpopulacji limfocytów;

• Immunosupresja w chorobach o podłożu zapalnym, w których można użyć przeciwciał skierowanych przeciwko cytokinom wywołującym patologie;

• Blokowanie krzepnięcia krwi przez blokowanie receptorów płytek wiążących się w fibrynogenem;

• Neutralizacja toksyn z użyciem przeciwciał monoklonalnych jest lepsza od stosowania surowic (np. w leczeniu tężca), gdyż pacjentowi nie dostarcza się dodatkowego balastu białkowego w postaci białek surowicy obcego gatunku;

• Badania diagnostyczne w laboratorium analitycznym (testy elisa).

• Są używane do wykrywania i określenia stężeń leków, enzymów, nawet jeżeli występują w bardzo małych ilościach w płynach tkankowych.

• Większość PM to przeciwciała monoklonalne mysie.

18. Wielopoziomowa struktura białek.

Odpowiedź:

Białka, podobnie jak DNA, są liniowymi, nierozgałęzionymi polimerami. Monomeryczna podjednostka w białkach nazywana jest aminokwasem, a polimer - polipeptydem. Jego długość rzadko przekracza 2000 jednostek. Podobnie jak w przypadku DNA, podstawowe cechy struktury białka zostały poznane w pierwszej połowie dwudziestego wieku. Tradycyjnie uważa się że białka mają cztery różne poziomy struktury. Poziomy te są hierarchiczne. Białko budowane jest stopniowo i każdy jego poziom struktury zależy od poziomu go poprzedzającego.

• STRUKTURA PIERSZORZĘDOWA białka powstaje przez połączenie aminokwasów w polipeptyd za pomocą wiązań peptydowych. Polipeptydy są syntetyzowane w wyniku reakcji kondensacji między grupą karboksylową jednego aminokwasu i grupą aminową drugiego aminokwasu. Struktura pierwszorzędowa czyli kolejność ułożenia aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym.

• STRUKTURA DRUGORZĘDOWA określa różne konformacje, jakie może przybierać polipeptyd. Dwa zasadnicze typy to helisa alfa i harmonijka beta. Obie struktury są stabilizowane przez wiązania wodorowe, które powstają miedzy różnymi aminokwasami w polipeptydzie. Struktura drugorzędowa to lokalne struktury powstające w wyniku tworzenia się wiązań wodorowych pomiędzy tlenem grupy >C=O, a wodorem grupy -NH, dwóch niezbyt odległych od siebie w łańcuchu wiązań peptydowych.

• STRUKTURA TRZECIORZĘDOWA jest wynikiem fałdowania poszczególnych struktur drugorzędowych polipeptydu, które prowadzi do powstania trójwymiarowej konfiguracji. Struktura trzeciorzędowa jest stabilizowana przez różne rodzaje oddziaływań. Są to głównie wiązania wodorowe między poszczególnymi aminokwasami, oddziaływania elektrostatyczne między naładowanymi grupami R aminokwasów oraz oddziaływania hydrofobowe. Możliwe jest również powstawanie kowalencyjnych wiązań disulfidowych zwanych też mostkami dwusiarczkowymi, które tworzą się między cysternami znajdującymi się w różnych miejscach polipeptydu. Struktura trzeciorzędowa białka - Wzajemne położenie elementów struktury drugorzędowej stabilizowane przez oddziaływania reszt aminokwasowych oraz tworzenie mostków dwusiarczkowych -S-S-, powstających pomiędzy dwiema resztami cysteiny, dwiema resztami metioniny lub też jeden metioniny drugi zaś cysteiny w łańcuchu.

• STRUKTURA CZWARTORZEDOWA powstaje przez połączenie dwóch lub więcej polipeptydów w białko składające się z kilku podjednostek, z których każda sfałdowana jest w strukturę trzeciorzędową. Nie wszystkie białka tworzą strukturę czwartorzędową. Jest to cecha wielu białek pełniących skomplikowane funkcje, w tym białek biorących udział w ekspresji genomu. Struktura czwartorzędowa białka - przestrzenna budowa białka zbudowanego z kilku łańcuchów polipeptydowych oraz zawierająca struktury niebiałkowe:

1. glikoproteidy - zawierają cukier

2. lipoproteidy - zawierają lipidy

3. nukleoproteidy - zawierają kwas nukleinowy

4. chromoproteidy - zawierają barwnik; np. hemoglobina może przybierać czwartorzędową budowę białka, gdyż poza kilkoma łańcuchami polipeptydowymi posiada jeszcze barwnik - hem.

5. fosfoproteidy - zawierają resztę kwasu fosforowego.

19. Związki wysokoenergetyczne. Proszę wyjaśnić pojęcie fosforylacji substratowej i oksydacyjnej.

Odpowiedź:

Związki wysokoenergetyczne, czyli bogate w energię związki pośrednie, przenośniki energii odwracalnie wiążące określone dawki energii swobodnej w postaci fosforanowych wiązań wysokoenergetycznych; energia ta gromadzona jest w całej cząsteczce, a uwalnia ją rozerwanie (hydroliza) tego wiązania; do z. w. należą m.in. ATP, NADP i inne trinukleotydy, kwas fosfoenolopirogronowy, fosfokreatyna, fosfoarginina.

Procesy metaboliczne komórek i organizmów są ściśle uzależnione od pobierania i przekształcania energii, w związku z tym w komórkach istnieją specjalne „akumulatory” i przenośniki energii, zawierające wiązania wysokoenergetyczne (makroergiczne). Energia zmagazynowana w tych związkach nazywana jest energią użyteczną biologicznie. Należą do nich trójfosforany rybonukleozydów: ATP - adenozynotrójfosforan, GTP - guanozynotrójfosforan, UTP - urydynotrójfosforan, CTP - cytydynotrójfosforan. Nazywane są wspólnymi metabolitami. Są to związki wysokoenergetyczne.
Wymienione wysokoenergetyczne związki (głów nie ATP) są uniwersalne, ponieważ występują powszechnie u wszystkich organizmów żyjących na Ziemi, od najprostszych do najbardziej złożonych, a energia ich wiązań chemicznych może być wykorzystana przez komórkę do różnorodnych procesów życiowych, takich jak: skurcz mięśni, transport przez błony komórkowe, przewodzenie impulsów nerwowych, ruch wici i rzęsek czy wszelkiego rodzaju biosyntezy.
Oprócz energii magazynowanej w ATP istnieją w komórkach związki mogące łatwo przyłączać i oddawać atomy wodoru, a zatem biorące udział w reakcjach syntezy, są to: NAD - dwunukleotyd nikotynamidoadeninowy, NADP - fosforan dwunukleotydu nikotynamidoadeninowego oraz FAD - dwunukleotyd flawinoadeninowy. Zredukowany NADPH + H⁺ bierze udział w procesach biosyntezy, natomiast NADH+ H⁺ i FADH₂ służą do wytwarzania ATP.

Fosforylacja jest podstawowym mechanizmem gromadzenia i przechowywania energii chemicznej. Można wyróżnić następujące typy fosforylacji: fosforylacja oksydacyjna - polegająca na syntezie ATP zachodzącej kosztem energii powstałej podczas transportu protonów wodoru i elektronów na tlen (łańcuch oddechowy), fosforylacja fotosyntetyczna (cykliczna lub niecykliczna) - polegająca na syntezie ATP kosztem energii dostarczanej przez kwanty światła, fosforylacja substratowa - polegająca na syntezie ATP na skutek bezpośredniego utleniania wysokoenergetycznego substratu.

Fosforylacja substratowa - reakcja chemiczna, która ma miejsce, gdy reszta fosforanowa zostanie przeniesiona ze związku ufosforylowanego - substratu - bezpośrednio na ADP przez enzymy, najczęściej z grupy kinaz. Ten sposób wytwarzania ATP nie wymaga udziału tlenu i zachodzi np. w glikolizie oraz cyklu Krebsa. Ten sposób wytwarzania ATP jest ewolucyjnie najstarszy, jednak ilość związków, które mogą wejść w reakcję fosforylacji substratowej jest ograniczona.

Substrat wysokoenergetyczny(ufosforylowany) + ADP → produkt niskoenergetyczny + ATP

Fosforylacja oksydacyjna - jest szlakiem metabolicznym, w którego wyniku energia uwalniana podczas utleniania zredukowanychnukleotydów przekształcana jest w energię ATP. Organizmy żywe wykorzystują wiele różnych związków organicznych, jednak aby wytworzyć z nich energią przydatną metabolicznie, cząsteczki ATP, w większości przeprowadzają fosforylację oksydacyjną. Szlak ten jest dominujący ze względu na wysoką efektywność w porównaniu do alternatywnych sposobów syntezy ATP, czyli fermentacji

Podczas fosforylacji oksydacyjnej, w wyniku szeregu reakcji redoks,elektrony przenoszone są ze zredukowanych nukleotydów, NADH⁺ iFADH₂, na pełniący funkcję akceptora elektronów tlen. Zachodzące reakcje prowadzą do zmagazynowania energii, służącej następnie do syntezy ATP. W komórkach eukariotycznych, szereg reakcji redoks zachodzi na kompleksach białkowych znajdujących się wmitochondriach. W komórkach prokariotycznych kompleksy białkowe zlokalizowane są w błonach komórkowych. Zestaw enzymówbiorących udział w przenoszeniu elektronów określa się jako łańcuch oddechowy. U eukariotów składa się on z pięciu głównych enzymów, u prokariotów odnaleziono wiele różnych enzymów pełniących funkcję donorów i akceptorów elektronów.

Energia uwalniana podczas transportu elektronów w łańcuchu oddechowym zużywana jest do przenoszenia protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną, proces ten przez jego odkrywcę został nazwany chemiosmozą. Energia potencjalna gromadzona jest w postaci gradientu pH i potencjału elektrycznego w poprzek błony. Zgromadzona w tej formie energia wykorzystywana jest przez kompleks enzymatyczny syntazy ATP, który pozwala protonom przejść przez błonę zgodnie z gradientem stężeń. Enzym ten zamienia jednocześnie energię gradientu pH i elektrycznego na energię wiązań chemicznych ATP, wytwarzanego przez przyłączenie do ADP reszty kwasu ortofosforowego, czyli reakcji fosforylacji. Niezwykłość reakcji syntezy ATP związana jest z obracaniem się części enzymu napędzanej przepływającymi protonami, przypominając działanie silnika elektrycznego. Obrót części enzymu odłącza wytworzoną cząsteczkę ATP.

Fosforylacja oksydacyjna jest ważnym procesem metabolicznym, jednak jej zachodzenie prowadzi do powstawania reaktywnych form tlenu, takich jak nadtlenek wodoru oraz wolnych rodników, niszczących komórki, a w efekcie powodujących choroby i prawdopodobnie przyspieszających starzenie się. Enzymy przeprowadzające ten szlak metaboliczny są wrażliwe na wiele leków i trucizn, takich jak cyjanek.

20. Znaczenie cyklu Krebsa w metabolizmie. Proszę na przykładach uzasadnić jego amfiboliczny charakter.

Odpowiedź:

Główną funkcją cyklu kwasu cytrynowego jest utlenianie pirogronianu do CO2 i H2O z jednoczesnym uzyskiwaniem energii.

Cykl ten jest miejscem krzyżowanie się wielu szlaków metaboliczne, niektóre z nich kończą się w pewnych jego etapach a inne rozpoczynają się od tego cyklu. Szlaki metaboliczne związane z cyklem Krebsa to m.in. deaminacja, transaminacja, glukoneogeneza.

Cykl Krebsa jest szlakiem amfibolicznym dostarczającym wielu substratów wykorzystywanych w procesach biosyntez w komórce np. syntezie aminokwasów.

Prawie wszystkie metabolity cyklu Krebsa mogą być wykorzystane w procesach glukoneogenezy ( enzymatyczny proces przekształcania niecukrowcowych prekursorów, np. aminokwasów, glicerolu czy mleczanu w glukozę) w nerkach i wątrobie.

Reakcją, która zapewnia przejście produktów cyklu Krebsa do szlaku glukoneogenezy katalizowana jest przez karboksykinazę fosfoenolopirogronianową. Rekcją tą jest przekształcenie szczawiooctanu w fosfoenolopirogronian z przekształceniem DTP do GDP.

szczawiooctan + GTP → fosfoenolopirogronian + CO2 + GDP

Odzyskiwanie szczawiooctanu uzyskuje się poprzez poddanie karboksylacji pirogronianu. Enzymem odpowiedzialnym za przebieg tej reakcji jest karboksylaza pirogronianowa.

ATP + CO2 + H2O + pirogronian → szczawiooctan + ADP + Pi

Inne metabolity cyklu Krebsa uzyskiwane są na drodze transaminacji ( reakcja chemiczna przeniesienia grupy aminowej z aminokwasu na jeden z 3 ketokwasów, w wyniku czego powstaje nowy aminokwas i nowy ketokwas. Proces ten katalizowany jest przez transaminazy(aminotransferazy). Ketokwasy te, to:pirogronian, szczawiooctan, α-ketoglutaran)

niektórych aminokwasów. Reakcje te katalizowane są przez aminotransferazy. Z alaniny uzyskiwany jest pirogronian, z asparaginianu - szczawiooctan, z glutaminianu a-ketoglutaran.

asparaginian + pirogronian → szczawiooctan + alanina

glutaminian + pirogronian → a-ketoglutaran + alanina

Większość aminokwasów zasilają cykl Krebsa oraz glukoneogenezę , ponieważ ulegają przekształceniu w taki produkty jak : pirogronian, sukcynylo-CoA, a-ketoglutaran, fumaran. Niektóre z nich ulegają utlenieniu do dwutlenku węgla lub po przekształceniu w szczawiooctan wchodzą w cykl glukoneogenezy.

21. Charakterystyka prionów jako przykład białka amyloidogennego.

Odpowiedź:

Priony są to infekcyjne białka wielkości 27-30 kDa. Białko prionowe, (PrP) występuje powszechnie w każdym organizmie i jest całkowicie niegroźne. Jest składnikiem otoczek komórek nerwowych oraz białych ciałek krwi - limfocytów. Dopiero w sytuacji, gdy zmienia ono swoją naturalną konformację, staje się białkiem prionowym infekcyjnym. Priony, infekcyjne cząsteczki białka, powodują choroby układu nerwowego zwierząt (m.in. scrapie u owiec i bydła) oraz człowieka (m.in. chorobę Creutzfelda-Jacoba i kuru). Zarówno białko prionowe jak i białko prionowe infekcyjne mają identyczną strukturę pierwszorzędową (czyli sekwencję aminokwasów), ale różnią się strukturą drugorzędową (konformacją przestrzenną), co wiąże sie z odmiennymi właściwościami fizykochemicznymi. Białko PrP nie wywołujące choroby (oznaczane PrP^C) posiada trzy α-helisy i dwie tzw. β-nici, natomiast białko PrP o domniemanym patogennym charakterze (oznaczane PrP^Sc, od scrapie) zawiera przewagę struktury tzw. harmonijki β. Białko PrP^C jest całkowicie rozpuszczalne w wodzie i denaturujących detergentach, natomiast PrP^Sc jest nierozpuszczalne w wodzie.

Tego typu białka nazywane są również białkami nieaktywnymi biologicznie. Wywołują choroby zwane amyloid ozami, czyli choroby polegające na odkładaniu się tego białka o budowie nierozgałęzionej i konfiguracji β pozakomórkowo, dające charakterystyczny obraz rentgenowski.

22. Rodzaje wektorów plazmidowych? Proszę podać główne etapy klonowania docelowego DNA w taki wektor.

Odpowiedź:

WEKTOR - cząsteczka DNA mogąca być nośnikiem interesującego nas kawałka DNA , która posiada zdolność do autonomicznej replikacji w danym typie komórek. Zapewnia powielanie wprowadzonego fragmentu DNA czyli klonowanie a czasami także wydajną syntezę kodowanego przez gen białka (transkrypcję i translację oraz jego stabilność) jak to ma miejsce w tzw. wektorach ekspresyjnych. Są różne typy wektorów a dobranie odpowiedniego zależy m.in. od tego w jakich komórkach zamierzamy klonować gen. Najważniejszym elementem warunkującym specyficzność wektora są sekwencje odpowiedzialne za inicjację replikacji tzw. sekwencje ori. Najprostsze wektory posiadały wyłącznie jedno , unikalne miejsce restrykcyjne , w które można było wprowadzić obcy DNA. Obecnie najczęściej jest to tzw. polilinker - syntetyczny odcinek DNA , w którym znajduje się zwykle kilkanaście miejsc rozpoznawanych przez różne restryktazy. Pozwala to na swobodniejszy dobór odpowiedniego do klonowania enzymu. Wektory zazwyczaj posiadają również geny markerowe czyli geny kodujące białka odpowiedzialne za łatwo wyróżnialne cechy fenotypowe. Wektor musi być tak skonstruowany aby istniała możliwość selekcji tych komórek , do których wniknął. Jego budowa powinna pozwalać także na odróżnienie wektora zrekombinowanego od takiego , który zamknął się bez ligacji z fragmentem DNA.

1. Wektory plazmidowe powstały na bazie naturalnych plazmidów, które są małymi, pozachromosomowymi kolistymi cząsteczkami DNA o wielkości od 2 do 200 kpz. Występują u wielu gatunków bakterii, a także drożdży. Naturalne plazmidy występują w różnej liczbie kopii, bardzo często zawierają geny oporności na antybiotyki. Replikują się niezależnie od genomu bakteryjnego. Służą do klonowania bardzo krótkich fragmentów.

W skład tekiego wektora wchodzą:

• Miejsce inicjacji replikacji (miejsce ori)

• Markery selekcyjne (geny oporności na antybiotyki)

• Miejsce wielokrotnego klonowania

Zawiera także szereg miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne.

Główne etapy klonowania docelowego DNA w taki wektor:

• izolacja plazmidowego DNA (mechaniczna, fenol, chloroform, propionian)

• trawienie izolowanego fragmentu izolowanego DNA i wektora enzymami restrykcyjnymi

• elektroforeza w żelu agarozowym i oczyszczanie produktów trawienia

• ligacja fragmentu DNA z wektorem plazmidowym przy pomocy ligazy DNA

• transformacja bakterii kompetentnych (czyli przeniesienie rekombinowanego wektora na pożywkę z bakteriami)

• selekcja transformowanych komórek

2. Wektor kosmidowy to wektor, który nie występuje w naturze. Powstał w laboratorium. Stanowi połączenie wektora plazmidowego i sekwencji cos z bakteriofaga lambda. Sekwencje plazmidowe są reprezentowane przez miejsce ori i gen oporności na antybiotyk a sekwencje bakteriofaga przez sekwencje cos. Kosmidy so wykorzystywane do klonowania bardzo dużych fragmentów DNA- ok. 40 kpz.

3. Wektor ekspresyjny Posiadają one odpowiednio umiejscowiony silny promotor, który umożliwia im ekspresję białka, gen którego na wektorze tym znajduje się.

• Wektory plazmidowe ekspresyjne - zawierają one regulowane, silne promotory. Taki promotor sprawia, że w odpowiednich warunkach transkrypcja inicjowana jest wiele razy w ciągu minuty. Np.: promotor laktozowy. Wzmaganie transkrypcji osiąga się przez dodanie analogu laktozy (IPTG) do pożywki.

• Wektory plazmidowe ekspresyjne, które zawierają sekwencję promotorową późnych protein faga T7. Promotor genupolimerazy RNA faga T7 jest specyficzną sekwencją złożoną z 23 bp. Ten system jest skomplikowany i składają się na niego 2 elementy. W zrekombinowanych kom. E. coli, które zawierają gen kodujący polimerazę RNA wstawiony po promotorze laktozowym dochodzi do syntezy dużych ilości polimerazy RNA, kiedy doda się do pożywki IPTG. Dochodzi do transformowania tych komórek wektorem plazmidowym, niosącym powielony promotor T7 oraz cDNA genu, który koduje wybrane białko. Polimeraza RNA ulega przyłączeniu do promotora T7 na plazmidowym wektorze. Reakcja ta katalizuje transkrypcję włączonego cDNA.

23. Proszę podać i omówić podstawowe techniki stosowane w diagnostyce molekularnej.

Odpowiedź:

• Izolacja i oczyszczanie DNA. Jest to kluczowy etap większości procedur stosowanych w biologii molekularnej, diagnostyce i innych badaniach. Głównym celem tego etapu jest uzyskanie wysokiej jakości i czystości materiału biologicznego. Wybór odpowiedniej metody izolacji zależy od rodzaju badanego kwasu nukleinowego jaki chcemy uzyskać, pochodzenia, rodzaju materiału z jakiego przeprowadzimy izolację i przeznaczenia (PCR, klonowanie, blotting, synteza cDNA). Izolacja DNA obejmuje zazwyczaj następujące etapy:

• Fizyczne zniszczenie struktury tkankowej i komórkowej materiału biologicznego,

• Uwolnienie DNA. Dna chroniony jest w komórce w różnych obłonionych strukturach subkomórkowych: jądro, mitochondria, chloroplasty a ponadto występuje w kompleksach z różnymi białkami, np. z histonami. W celu degradacji błon komórkowych i białek, do buforów ekstrakcyjnych dodawane są różne detergenty, np. SDS, CTAB. Detergenty te umożliwiają też eliminację enzymów nukleolitycznych, które po uwolnieniu ze struktur komórkowych mogły by zniszczyć DNA,

• Usunięcie zdegradowanych elementów komórkowych. Do usuwania białek stosuje się trawienie proteinazą K oraz ekstrakcję fenolem i później chloroformem. Lipidy usuwany dzięki ekstrakcji chloroformem, a polisacharydy wytrącając DNA CTAB-em,

• Oddzielenie DNA od związków użytych na wcześniejszych etapach izolacji, czyli detergentów, soli, inhibitorów. W tym celu wytrącamy DNA w etanolu lub izopropanolu,

• Przygotowanie do przechowania DNA. Dna jest przechowywany w postaci wodnego r-ru lub buforach typu TE. Bufory te zawierają Tris, odpowiedzialny za utrzymanie stałego pH roztworu, a także EDTA, który wiąże jony dwuwartościowe.

• PCR czyli łańcuchowa reakcja polimerazy. Jest to metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Do reakcji wprowadza się: matrycowy DNA, trifosforany deoksyrybonukleozydów, startery (primery), czyli krótkie (najczęściej ok. 20 nukleotydów) fragmenty DNA komplementarne do fragmentów matrycy, znajdujących się na obu końcach interesującego na genu, oraz termostabilną polimerazę DNA. Używanym do reakcji enzymem może być na przykład polimeraza Taq wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus. Reakcja PCR składa się z wielokrotnie powtarzanego cyklu trzech etapów, które zachodzą w rożnych temperaturach. Można zatem wymuszać je bez ingerencji w skład mieszaniny, a jedynie przez zmianę temperatury mieszaniny reakcyjnej.

1. Denaturacja. Pierwszym etapem jest rozplecenie podwójnej helisy matrycowego DNA (lub mRNA, jeśli stanowi matrycę). W wysokiej temperaturze (zwykle około 95°C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. W celu uzyskania tego efektu podnosi się temperaturę mieszaniny reakcyjnej do wymaganych 95° na 15 sekund.

2. Annealing - hybrydyzacja odcinków starterowych. Polega na tworzeniu odcinków dwuniciowych, składających się z przygotowanych starterów - cząsteczek DNA komplementarnych do sekwencji DNA oskrzydlających gen mający ulec namnożeniu - z matrycową cząsteczką DNA. Etap ten zachodzi w temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (pomiędzy 45-60°C), przyłączają się one do matrycy. Ponieważ roztwory primerów są dodawane w dużym nadmiarze w stosunku do matrycy, jest bardzo mało prawdopodobne, żeby na tym etapie, zamiast hybryd starter-matryca utworzyły się hybrydy połączonych się ze sobą dwóch nici matrycy.

3. Elongacja - Na tym etapie zachodzi właściwa synteza DNA i tym samym aplifikacja pożądanego genu. Podwyższenie temperatury do około 72°C powoduje utworzenie się na matrycy, z przyłączonymi do niej starterami, kompleksu z polimerazą DNA, wskutek czego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy. Reakcja ta trwa zwykle 30 sekund.

Następnie cykl powtarza się i w kolejnym etapie annealingu i elongacji jako matryca mogą służyć wszystkie zsyntetyzowane dotychczas cząsteczki genu. W ten sposób reakcja, dopóki substraty i enzym są w wystarczającej ilości, zachodzi coraz szybciej, powodując coraz większy przyrost kopii genu na etapie elongacji.

Gdyby wydajność metody była stuprocentowa, po n cyklach reakcji z jednej cząsteczki można by uzyskać 2ⁿ cząsteczek. W praktyce wydajność procesu jest mniejsza, co nie zmienia faktu, że metoda PCR pozwala na geometryczne zwielokrotnienie pożądanego łańcucha DNA.

PCR może być używany do amplifikacji specyficznych sekwencji na DNA izolowanym nawet z pojedynczej komórki. Ma to ogromne znaczenie przy :

- analizowaniu mutacji związanych z szeregiem chorób genetycznych

- diagnostyce chorób dziedzicznych

- ustalaniu ojcostwa w sądownictwie

- ustalaniu pochodzenia śladów krwi , włosów itp. w kryminalistyce

- namnażaniu DNA z mumii egipskich czy szczątków wymarłych organizmów

- wykrywania we krwi obecności wirusów takich jak np. HIV.

• Trawienie enzymami restrykcyjnymi. Restryktazy (inaczej enzymy restrykcyjne , endonukleazy restrykcyjne) - to enzymy izolowane z bakterii , zdolne do rozpoznawania specyficznych sekwencji w DNA (z reguły są to sekwencje palindromowe) i do przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA w ściśle określonym miejscu , w obrębie lub okolicy sekwencji rozpoznawanej. Otrzymywane fragmenty DNA nie są losowe a w każdym prążku na żelu znajdują się cząsteczki DNA o identycznej sekwencji nukleotydowej. Z reguły różne enzymy rozpoznają odmienne sekwencje DNA. Istnieją jednak wyjątki - tzw. izoschizomery - enzymy izolowane z różnych organizmów ale rozpoznające te same sekwencje. Zdarza się także , że dwa enzymy wytwarzają takie same lepkie końce , mimo rozpoznawania różnych sekwencji DNA. Umożliwia to klonowanie DNA strawionego jednym enzymem w wektorze strawionym innym , dającym takie same lepkie końce. Nazewnictwo opiera się na literowych skrótach , w których pierwsza litera pochodzi od rodzaju bakterii , a druga i trzecia od gatunku. Następna litera oznacza szczep lub lub typ a kolejne enzymy z danego szczepu lub typu otrzymują litery rzymskie. Jednostka enzymu restrykcyjnego to taka jego ilość , która trawi kompletnie 1mg DNA faga l (około 50 kb) w czasie 1 godz. w temperaturze 37°C.

Podział restryktaz według rodzaju wytwarzanych końców :

• tępe końce - nici rozcięte naprzeciwko siebie - wszystkie nukleotydy są sparowane z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnym łańcuchu

• lepkie końce - 3` lub 5` ssDNA (jednoniciowe) ogony na obu końcach utworzone przez niesymetryczne cięcie , komplementarne do podobnych tworzonych w innych cząsteczkach DNA przez te same enzymy restrykcyjne niezależnie od źródła DNA , co pozwala na ligowanie DNA nawet bardzo różniących się gatunków czyli formowanie chimerycznych molekuł.

Podział restryktaz według sekwencji rozpoznawanej :

• czwórkowe , rozpoznają sekwencję DNA złożoną z czterech nukleotydów. Statystycznie w dowolnym DNA takich miejsc jest dużo - co 256 bp. Restryktazy takie mogą strawić DNA na bardzo małe kawałki.

• szóstkowe , rozpoznają sekwencję DNA złożoną z sześciu nukleotydów. Dowolne miejsce restrykcyjne złożone z sześciu nukleotydów występuje statystycznie co około 4096 bp w DNA , w którym ilości poszczególnych nukleotydów są równe. Proporcje te zmieniają się w zależności od organizmu , dlatego dobór enzymu szóstkowego i warunki należy ustalić eksperymentalnie.

• ósemkowe , stosowane niezbyt często. Tną DNA bardzo rzadko.

Zastosowania :

• Konstrukcja map restrykcyjnych. Analizując na żelach produkty trawienia danego DNA różnymi enzymami restrykcyjnymi , stosowanymi pojedynczo , w kombinacjach oraz w ilościach wystarczających lub niewystarczających do pełnego strawienia preparatu , można ustalić wzajemne położenie i odległości pomiędzy sekwencjami rozpoznawanymi przez te enzymy. Mapa restrykcyjna to obraz cząsteczki DNA , na którym zaznaczone są miejsca rozpoznawane przez różne enzymy restrykcyjne z uwzględnieniem odległości między nimi wyrażonej w nukleotydach.

• Klonowanie i obróbka DNA. DNA pocięty enzymami restrykcyjnymi można poddawać ligacji z wektorem. W ten sposób tworzone są zrekombinowane plazmidy czyli plazmidy zawierające sklonowany DNA , który można później poddawać różnym manipulacjom przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych.

• Badanie polimorfizmu miejsc restrykcyjnych (RFLP).

• Sekwencjonowanie. Sekwencjonowanie - metoda , dzięki której możliwe jest ustalenie sekwencji czyli określenie kolejności nukleotydów. Jeden z etapów analizy genu. Na podstawie sekwencji istnieje możliwość przewidzenia kolejności aminokwasów w białku , które jest kodowane przez dany gen. Są dwie metody sekwencjonowania :

• Enzymatyczna - metoda Sangera

Na jednoniciowej matrycy syntetyzuje się in vitro DNA. Syteza przebiega od radioaktywnego , oligonukleotydowego startera komplementarnego do 3` końca matrycy. Reakcję wykonuje się równolegle w czterech probówkach , w których oprócz kompletu deoksytrifosforanów nukleotydów (dATP , dCTP , dTTP , dGTP) dodana jest niewielka ilość jednego z nich w postaci dideoksytrifosforanu nukleotydu , co uniemożliwia kontynuowanie reakcji w momencie włączenia takiego nukleotydu w syntetyzowany łańcuch , ponieważ brakuje wtedy grupy hydroksylowej na 3` końcu. Produkty reakcji poddawane są elektroforezie w czterech równoległych ścieżkach na żelu poliakrylamidowym. Pozwala to na ustalenie sekwencji nici komplementarnej do badanej.

• Chemiczna - metoda Maxama-Gilberta

Jest to metoda praktycznie już nie stosowana.

Polega na degradacji wyznakowanych na 5` końcu cząsteczek DNA związkami chemicznymi przecinającymi specyficznie wiązania fosfodiestrowe za nukleotydem odpowiadającym określonej zasadzie azotowej. Wynikiem reakcji jest zbiór fragmentów DNA o różnej długości co spowodowane jest takim doborem warunków , że w poszczególnych cząsteczkach przecinane jest tylko jedno lub dwa wiązania. Fragmenty z czterech niezależnych reakcji (dGTP , dGTP i dATP , dCTP , dCTP i dTTP) rozdziela się elektroforetycznie po czym poddaje autoradiografii. Prążki na autoradiogramie odpowiadają fragmentom DNA posiadającym na końcu 5` znakowany fosfor a na końcu 3` określoną zasadę.

Obydwie metody pozwalają na odczytanie sekwencji około 400 do 700 nukleotydów w jednym doświadczeniu. Jeśli sekwencjonujemy dłuższy odcinek należy go pociąć enzymem restrykcyjnym i ustalać sekwencję każdego fragmentu osobno.

• Elektroforeza DNA w żelu agarozowym. Agaroza jest polisacharydem otrzymywanym z glonów morskich, która po rozpuszczeniu w roztworze wodnym tworzy stały żel. Agaroza stosowana do przygotowywania żeli elektroforetycznych jest oczyszczona postacią agaru. Rozdział w żelu polega na migracji fragmentów DNA w kierunku elektrody dodatniej (DNA ma silny ładunek ujemny). Oprócz żeli agarozowych stosje się także żele poliakrylamidowe, które służą do rozdziału bardzo małych fragmentów DNA (5-400 bp) i pozwalają na identyfikację fragmentów różniących się nawet jednym nukleotydem.

• Ligacja DNA. Ligazy DNA katalizują formowanie wiązań fosfodiestrowych pomiędzy końcem hydroksylowym 3` a końcem fosforowym 5` DNA. Pozwala to na reperowanie jednoniciowych przerw w dupleksie DNA , łączenie fragmentów restrykcyjnych posiadających homologiczne lepkie czy też nawet tępe końce.

Dwa najczęściej stosowane enzymy to ligaza DNA E.coli i ligaza DNA z faga T4. Tylko ta ostatnia jest w stanie wydajnie łączyć tępe końce , nawet w normalnych warunkach reakcji. Wadą jest jej mniejsza specyficzność rozpoznawania struktury końców , co daje większe tło w doświadczeniach spowodowane nieprawidłowymi ligacjami.

24. Mikrobiologiczne aspekty produkcji fermentowanej żywności.

Odpowiedź:

Fermentowana żywność czyli grupa produktów spożywczych otrzymywanych ze świeżych lub pasteryzowanych surowców roślinnych i zwierzęcych, która uzyskuje swoje charakterystyczne cechy sensoryczne w wyniku procesów fermentacyjnych prowadzonych z udziałem mikroorganizmów. Przykładowo żywność wytwarzana przy udziale bakterii kwasu mlekowego LAB:

• LABjogurt, kwaśne mleko, maślanka, śmietana, sery, kiszonki, fermentowane wędliny.

• LAB+Propionobacteriumsery typu szwajcarskiego

• Lab+Bifidobacteriumbiojogurty

• LAB+Micrococcus, Staphylococcusfermentowane produkty mięsne

• LAB+Acetobacterkawa, kakao

• LAB+drożdżekefir, kumys, pieczywo żytnie, pszennożytnie, niektóre piwa

• LAB+pleśniesery z porostem i przerostem pleśni

• LAB+pleśnie+drożdżesosy sojowe, fermentowana żywność orientalana

Jakie funkcje pełnią te mikroorganizmy? Otóż poprawiają trwałość i mikrobiologiczne bezpieczeństwo; kształtują cechy sensoryczne; poprawiają wartości odżywcze i dietetyczne żywności (np. w produktach mlecznych poprzez obniżenie zawartości laktozy, wzrost wolnych aminokwasów, zwiększenie przyswajalności białek, Ca, Zn, Fe, zwiększenie przyswajalności białek; w produktach warzywnych- eliminowanie związków toksycznych, poprawa cech organoleptycznych, zwiększenie przyswajalności Fe, Zn, Ca w zbożu, roślinach strączkowych zawierających kwas fitynowy itd.). Mikroorganizmy te dają potencjalne korzyści dla zdrowia konsumenta (efekty probiotyczne).

25. Wykorzystanie drobnoustrojów w przemyśle (produkcja dodatków do żywności, farmaceutyków, itp.).

Odpiowiedź:

Bakterie pełnią ważną rolę w przyrodzie i życiu człowieka:

a)Uczestniczą w oczyszczaniu wód i ścieków:

• bioremediacja- proces, w którym używamy organizmów żywych (drobnoustroje, rośliny), które mają doprowadzić środowisko do stanu wyjściowego. Wyleczyć to środowisko.

• Osad czynny- układ, który ustabilizował się w danych warunkach; tu znajdują się mieszane kultury mikroorganizmów i pierwotniaków; jest to sztuczny ekosystem; maja na celu usunąć z wody głównie związki węgla i siarki; biorą udział w oczyszczaniu ścieków w warunkach tlenowych i tworzeniu osadów

• Oczyszczanie na złożach biologicznych- tutaj drobnoustroje są unieruchomione, jest to kolejna metoda biologicznego oczyszczania ścieków. W kolumnie umieszcza sie półki z porowatym wypełnieniem, aby zwiększyć powierzchnie, nad podłożami krąży „ramie” i rozdeszcza ścieki;

• Fermentacja metanowa- oczyszczanie ścieków w warunkach beztlenowych. W wyniku tej fermentacji powstaje biomasa komórkowa i biogaz (CO2 i metan), który jest wykorzystywany w pozyskiwaniu energii i produkcji prądu;

b)Wykorzystywane w przemyśle farmaceutycznym do produkcji antybiotyków;

Antybiotyki to naturalne związki wytwarzane przez drobnoustroje lub ich półsyntetyczne pochodne jako metabolit wtórny, które oddziałując w małym stężeniu wybiórczo na struktury i procesy biologiczne, hamują wzrost lub rozmnażanie

Kierunki zastosowań antybiotyków:

• do celów medycznych (ok. 30tys ton na rok),

• pozamedycznych- w ochronie roślin (ok. 25tys ton na rok),

• dodatki do pasz (5tys ton na rok)

Wyróżniamy też antybiotyki polipeptydowe, które mają zastosowanie w leczeniu zakażeń bakteryjnych, jako leki przeciwnowotworowe, immunosupresyjne stosowane w transplantologii, jako dodatek do pasz, jako konserwant żywności;

c)Wykorzystywane do produkcji enzymów

Z ponad 4000 enzymów sklasyfikowanych tylko 5,5% ma zastosowanie przemysłowe

Są wykorzystywane w przemyśle spożywczym (hydrolazy cukrów 53%, lipazy 4%, okstydoreduktazy1%, proteazy 42%

Szczególnie ważne są amylazy. Są wykorzystywane w przemyśle lekkim (tekstylnym, papierniczym, praliniczym, medycznym)

Przemysł spożywczy (amylazy-wykorzystanie):

1.skrobiowy- wszystkie typy amylaz

2.gorzelniczy- amylazy słodowe, bakteryjne, grzybowe

3.piwowarski- a. słodowe, mikrobiologiczne

4.piekarniczy- jak wyżej

5. produkcja glukozy i syropu wysokofruktozowego- a. bakteryjne, glukoamylazy

6. produkcja odżywek dla dzieci

d)Wykorzystywane są w przemyśle spożywczym do obróbki żywności

W wyniku procesów fermentacyjnych prowadzonych z ich udziałem produkty spożywcze zyskują swoje charakterystyczne cechy sensoryczne.

Mogą być wykorzystane w przemyśle mleczarskim do produkcji jogurtu, maślanki, .śmietany i innych tego typu przetworów, ale także do produkcji kiszonek, serów, fermentowanych produktów mięsnych i rybnych. Tu głównie wykorzystywane są drobnoustroje z rodzaju LACTOBACILLUS. Ich rola polega na poprawie trwałości i mikrobiologicznego bezpieczeństwa; kształtują cechy sensoryczne; poprawiają wartości odżywcze i dietetyczne żywności,

e) Wykorzystywane w przemyśle farmaceutycznym do produkcji probiotyków:

Są to żywe komórki, wyselekcjonowanych szczepów mikroorganizmów (głównie LAB), które w postaci preparatów farmaceutycznych lub dodane do żywności korzystnie wpływają na organizm gospodarza poprzez poprawę jego ekosystemu jelitowego. Przywracają naturalny skład flory przewodu pokarmowego po infekcjach wirusowych, bakteryjnych, kuracjach antybiotykami, radioterapiach.

f) Produkcja białek heterologicznych

26. Wykorzystanie drobnoustrojów w ochronie środowiska.

Odpowiedź:

Bakterie pełnią ważną rolę w przyrodzie i życiu człowieka. Są wykorzystywane w ochronie środowiska. Uczestniczą w oczyszczaniu wód i ścieków:

• bioremediacja- proces, w którym używamy żywych organizmów, które mają doprowadzić środowisko do stanu wyjściowego. Wyleczyć to środowisko Wyróżniamy proces:

• bioremediacji - gdzie wykorzystywane są drobnoustroje. Proces bioremediacji gruntów odbywa się z wykorzystaniem mikroflory bytującej w danym środowisku lub mikroflory wprowadzonej do gleby w postaci biopreparatów. Skażoną glebę można oczyścić „in situ”, czyli prowadzić zabiegi biotechnologiczne na miejscu skażenia lub „ex situ” czyli skażoną glebę przewozić w inne miejsce.

• fitoremediacji - gdzie wykorzystywane są rośliny. Procesy te dzielimy na podterminy:

• fitoekstrakcja(=fito akumulacja) - magazynowanie szkodliwych substancji w korzeniach, liściach

• biostabilizacja - wydzielanie przez roślinę związków, które obniżają toksyczność

• biogradacja ryzo sferyczna - wydzielanie związków w strefie korzeniowej, które stanowią pożywkę dla drobnoustrojów glebowych a te inicjują degradacje toksyn.

• Fitostymulacja - przyspieszenie prędkości przekształceń mikrobiotycznych zanieczyszczeń. Tu dodatek pierwiastków biogennych.

• Osad czynny- układ, który ustabilizował się w danych warunkach; tu znajdują się mieszane kultury mikroorganizmów i pierwotniaków; jest to sztuczny ekosystem; maja na celu usunąć z wody głównie związki węgla i siarki; biorą udział w oczyszczaniu ścieków w warunkach tlenowych i tworzeniu osadów

• Oczyszczanie na złożach biologicznych- tutaj drobnoustroje są unieruchomione, jest to kolejna metoda biologicznego oczyszczania ścieków. W kolumnie umieszcza sie półki z porowatym wypełnieniem, aby zwiększyć powierzchnie, nad podłożami krąży „ramie” i rozdeszcza ścieki;

• Fermentacja metanowa- oczyszczanie ścieków w warunkach beztlenowych. W wyniku tej fermentacji powstaje biomasa komórkowa i biogaz (CO2 i metan), który jest wykorzystywany w pozyskiwaniu energii i produkcji prądu;

27. Produkcja heterologicznych białek.

Odpowiedź:

Poznanie funkcji oraz struktury białka jest ostatecznym celem większości prac prowadzonych metodami genetyki molekularnej. Głównym ograniczeniem tego typu badań jest znikoma ilość białka obecna zazwyczaj w badanym organizmie. Izolacja i dokładne oczyszczenie białka z dużej ilości materiału biologicznego jest w większości przypadków niemożliwe ze względu dostępność materiału, a także zanieczyszczenia innymi białkami.

Ogromnym postępem w dziedzinie biologii molekularnej oraz biotechnologii ostatnich lat, było opracowanie metod pozwalających na otrzymanie dużych ilości białka z organizmów modelowych poprzez zastosowanie systemów heterologicznej ekspresji. W zależności od rodzaju oraz skali produkcji białka, używane są różne systemy ekspresji heterologicznej w oparciu o różne organizmy - gospodarzy. Najwięcej systemów opiera się na bakteriach (Escherichia coli, Bacillus subtilis), drożdżach (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) oraz liniach komórek eukariotycznych (owadzich, ssaczych, roślinnych). Zaletą systemów prokariotycznych jest w łatwość hodowli i manipulacji genetycznych oraz duża ilość powstającego produktu.

Kolejnym istotnym elementem wpływającym na decyzję wyboru odpowiedniego systemu ekspresji heterologicznej jest sposób oczyszczania produktu białkowego. Najbardziej rozpowszechnioną metodą stosowaną do tego celu jest chromatografia powinowactwa- najbardziej specyficzna ze sposobów frakcjonowania białek.

Sklonowanie genu lub cDNA kodującego określone białko jest tylko pierwszym z wielu kroków niezbędnych do wyprodukowania zrekombinowanego białka do użytku medycznego lub przemysłowego. Drugim krokiem jest wprowadzenie genu do komórki gospodarza , która będzie produkowała białko. Wybór zależy od celu projektu i właściwości produkowanego białka.

Zalety używania komórek bakteryjnych to prostota , krótki czas generacji i duża ilość produktu a zarazem małe koszty. Jest jednak parę wad takiego systemu. Niektóre białka eksprymowane na wysokim poziomie (więcej niż 10% masy wszystkich białek bakteryjnych) często ulegają nieprawidłowemu fałdowaniu i odkładane są w formie nierozpuszczalnych ciałek inkluzyjnych. Białka po ekstrakcji z tych struktur często są biologicznie nieaktywne. Innym problemem jest to , że obce białka są czasami toksyczne dla bakterii , tak więc kultury bakteryjne produkujące takie białko nie mogą rosnąć do wysokiej gęstości. Ten problem może być pomijany przy użyciu indukowalnego promotora włączanego w odpowiednim czasie. Trzecią wadą jest fakt niewystępowania w komórkach bakteryjnych enzymów obecnych w komórkach eukariotycznych uczestniczących w postranslacyjnych modyfikacjach , które to modyfikacje często są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania białka. Ten problem jest z kolei omijany dzięki ekstrakcji z komórek eukariotycznych enzymów przeprowadzających takie modyfikacje i używaniu ich przy modyfikacji bakteryjnie eksprymowanych białek.

Najczęściej geny klonowane są w E.coli , Bacillus subtilis.

Drożdże są prostymi komórkami eukariotycznymi , które przypominają komórki ssacze pod wieloma względami a rosną równie szybko i tanio jak komórki bakteryjne. Przeprowadzają również wiele z modyfikacji posttranslacyjnych charakterystycznych dla ludzkich białek a także można je zaindukować do wydzielania białek do medium (pożywki). Wadą jest obecność aktywnych proteaz degradujących obce białka , co redukuje ilość produktu. Z problemem tym poradzono sobie konstruując szczepy drożdżowe , z których geny proteaz zostały usunięte.

Niestety wydajność ekspresji obcych białek jest niska a autonomiczne plazmidy są niestabilne w przypadku braku presji selekcyjnej. Oprócz Saccharomyces cerevisiaewykorzystuje się także inne gatunki.

Ekspresja heterologicznych białek w komórkach owadów za pomocą wektorów bakulowirusowych niesie za sobą przede wszystkim ekspresję na wysokim poziomie , prawidłowy folding i modyfikacje posttranslacyjne jednak koszt hodowli jest często zbyt duży.

Nierzadko najlepszym wyjściem jest produkcja ssaczych białek w ssaczych komórkach. Używa się ich często dla sprawdzenia funkcjonowania świeżo sklonowanych genów , dla zbadania funkcji niektórych białek czy produkcji na dużą skalę białek takich jak np. tkankowy aktywator plazminogenu (tPA).

Należy zmierzać do jak najlepszego dostosowania konstrukcji klonowanych heterologicznych sekwencji DNA do cech genetycznych biorcy. Istnieje jednak wiele problemów , które trudno jest zawczasu przewidzieć m.in. stabilność strukturalna zrekombinowanego DNA , stabilność mRNA , poziom ekspresji klonowanego genu itp.

28. Bioreaktory i techniki hodowlane.

Odpowiedź:

Bioreaktory są to urządzenia, w których prowadzone są procesy biologiczne z użyciem różnego rodzaju bakterii, drożdży, grzybów strzępkowych, tkanek roślinnych i zwierzęcych lub wyizolowanych czystych enzymów. Wielkość tych urządzeń, w zależności od skali, jest w zakresie od 1litra do 1000 m³. W skali laboratoryjnej wykorzystywane są bioreaktory małe o objętości roboczej od 1 do 100 litrów. W skali przemysłowej stosowane są bioreaktory duże o objętości od 10 do 1000 m³. Konstrukcja bioreaktora pozwala na prowadzenie procesów biologicznych w warunkach sterylnych, w ściśle określonych warunkach temperatury, odczynu środowiska hodowlanego i natlenienia. Bioreaktor wyposażony jest w szereg czujników kontrolno- pomiarowych, które mierzą i utrzymują w sposób ciągły takie wielkości jak: pH, pO₂, pCO₂ szybkość mieszania i napowietrzania, poziom rozpuszczonego tlenu, poziom rozpuszczonego dwutlenku węgla, wysokość piany, nadciśnienie w zbiorniku, a w gazach wylotowych stężenia O₂ i CO₂. Nowoczesne rozwiązania konstrukcyjne stwarzają możliwość sterowania procesem przy pomocy komputera i specjalnych programów komputerowych.

W bioreaktorach obok procesów mikrobiologicznych i biochemicznych istotna rolę odgrywają również procesy fizyczne związane z mieszaniem, wymianą masy i ciepła.

Wymagania stawiane bioreaktorom to :

• Wysoka zdolność produkcyjna

• Duże stężenie produktów w mieszaninie poreakcyjnej

• Wysoka selektywność procesu

• Minimalne koszty inwestycyjne i eksploatacyjne

• Łatwość rozdziału produktów

• Minimalne ujemne wpływy na środowisko

Zależnie od przeznaczenia, zasady działania i rozwiązań konstrukcyjnych można wyróżnić różne typy bioreaktorów:
Sposób prowadzenia procesu:
- bioreaktory do procesów okresowych
- bioreaktory do procesów ciągłych
- bioreaktory z zawracaniem lub zatrzymaniem biofazy

Rodzaj biokatalizatora:
- bioreaktory do klasycznych procesów mikrobiologicznych
- bioreaktory do hodowli komórek organizmów wyższych w zawiesinie
- bioreaktory do hodowli komórek organizmów wyższych na nośniku
- bioreaktory do procesów enzymatycznych w roztworze
- bioreaktory do procesów z użyciem biokatalizatorów unieruchomionych

Warunki hodowli drobnoustrojów, komórek:
- bioreaktory do hodowli na powierzchni podłoża
- bioreaktory z nośnikiem stałym
- bioreaktory do hodowli wgłębnej

Warunki tlenowe:
- bioreaktory do warunków tlenowych
- bioreaktory do warunków beztlenowych

Warunki i sposoby mieszania:
- bioreaktory bez wymuszonego mieszania
- bioreaktory z wymuszonym mieszaniem

Sposób doprowadzenia energii na mieszanie:
- mieszadłem mechanicznym przez fazę ciekłą
- pompą przez fazę ciekłą
- poprzez fazę gazową (sprężonym powietrzem)
- sposoby łączone.

Techniki hodowalane:

• Hodowla okresowa

(Najczęściej wykorzystywany rodzaj hodowli laboratoryjnej, ma również zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu (browarnictwo, winiarstwo, mleczarstwo, drożdżownictwo)).

W hodowli okresowej:

• substraty odżywcze dostarczane są jednorazowo w początkowej fazie procesu

• ze środowiska hodowli nie usuwa się biomasy ani metabolitów (wyjątek mogą stanowić produkty gazowe)

6 faz wzrostu hodowli okresowej

1) faza spoczynkowa (lag faza, faza przygotowawcza) - rozpoczyna się w momencie wprowadzenia drobnoustrojów do środowiska, a kończy z pierwszym podziałem lub pączkowaniem komórek. Liczba komórek nie wzrasta. Następuje aktywacja przemiany materii. Czas trwania zależy od wieku komórek i rodzaju podłoża, z jakiego je przeszczepiono,

2) faza przyspieszenia (faza akceleracji) - wzrasta tempo namnażania komórek, komórki są młode, mają intensywny metabolizm, są wrażliwe na działanie czynników zewnętrznych,

3) faza wykładnicza (logarytmiczna) - wzrost populacji ma charakter nieograniczonego wzrostu wykładniczego, czas generacji (podwojenia biomasy) jest minimalny, właściwa szybkość wzrostu jest maksymalna,

4) faza opóźnienia - na skutek spadku stężenia substratów i nagromadzania się szkodliwych metabolitów zwalnia się tempo przyrostu biomasy, liczba komórek w populacji oraz biomasa osiągają pod koniec tej fazy wartość maksymalną,

5) faza stacjonarna (zastoju) - tempo przyrostu komórek jest równoważone szybkością ich zamierania (równowaga dynamiczna), wzrost populacji ulega zahamowaniu, stężenie biomasy zachowuje wartość maksymalną, w czasie tej fazy wyznacza się maksymalny plon biomasy ΔX_max (różnica między maksymalnym stężeniem biomasy X_max oznaczonym w tej fazie, a stężeniem początkowym X₀)

ΔX_max = X_max - X₀

6) faza zamierania (letalna) - więcej komórek zamiera niż powstaje w wyniku podziałów, może zachodzić autoliza komórek

• Hodowla półokresowa

(okresowa ze stałym dostarczaniem substratu, jest dopływ substratu, nie ma odpływu, zmienia sie objętość reaktora, w takiej hodowli możemy zmieniać stężenie substratu i utrzymywać je na stałym poziomie, natężenie dopływu pożywki zwiększa sie, gdyż przyrasta biomasa, dozowanie może być skokowe (częściej) lub ciągłe, może też być okresowy odpływ, kiedy objętość reaktora dojdzie do jakiejś wartości maksymalnej)

• Hodowla ciągła

(Hodowla drobnoustrojów w pożywce płynnej w odpowiednio skonstruowanym aparacie, który wymienia zużyte porcje pożywki zastępując je świeżymi i utrzymuje stałe warunki środowiska (temperatura, skład atmosfery, pH). Umożliwia to hodowanym drobnoustrojom ciągły wzrost bez przechodzenia kolejnych faz, jak to ma miejsce w normalnej hodowli.

W reaktorach przepływowych - jest ciągłe zasilanie i ciągły odpływ, stosowana tam, gdzie potrzebna jest bardzo ścisła kontrola stężenia substratu, zwłaszcza gdy wysoki poziom substratu hamuje produktywność komórek. Hodowle te nadają sie najlepiej do otrzymywania biomasy i metabolitów pierwotnych, gorzej

z produkcja metabolitów wtórnych. Nie nadają sie do niej organizmy o niedużej szybkości wzrostu, sa wypierane przez szybko rosnące komórki, ciągle nam wypływają z reaktora, wiec musza sie szybko mnożyć, aby ich ilość w reaktorze była wystarczająca.)

• Hodowla w podłożu stałym

(Stosowane głównie dla grzybów: strzępkowce, promieniowce. Są to hodowle bardzo proste.

Hodowle takie są bardzo łatwe, otrzymuje sie produkty o wysokim stężeniu, sa duże wydajności, wykorzystuje sie surowce odpadowe (tanie podłoże). Problemem może być nierównomierna temperatura. Mikroorganizmy produkują ciepło, które trzeba jakoś odprowadzić, żeby sie mikroby nie przegrzały, dlatego warstwa podłoża musi być możliwie najcieńsza.)

• Hodowla na podłożach ciekłych

1. hodowla wgłębna - mikroorganizmy rośna w całej objętości podłoża - ten typ przeważa

2. hodowla powierzchniowa - na powierzchni pożywki tworzy sie kożuch z mikroorganizmów

3. hodowla z unieruchomionym materiałem biologicznym

Hodowle wgłębne są teraz najpopularniejsze:

• Są dobre systemy napowietrzania i jest wszędzie dostępny tlen

• Dobre systemy mieszania, np. łagodne mieszanie w przypadku wrażliwych mechanicznie komórek

• Nowe szczepy, które mogą żyć w całej objętości

29. Mechanizmy oddziaływania idiolitów na procesy metaboliczne.

Odpowiedź:

Idiolity czyli metabolity wtórne. Idiolity to zarówno antybiotyki jaki i toksyny.

Antybiotyki są to naturalne produkty metabolizmu, z reguły wtórnego drobnoustrojów, które działają w niskich stężeniach wybiórczo na struktury i procesy metaboliczne hamując wzrost lub podziały komórek. Grupa organizmów produkująca antybiotyki to promieniowce (rodzaj Streptomyces, Micromonospora, Nocordia), bakterie (rodzaj Bacillus, Pseudomonas) oraz grzyby (Penicillum, Aspergillus).

Mechanizmy działania antybiotyków to:

1. Hamowanie syntezy kwasów nukleinowych przez blokowanie matrycy albo polimerazy DNA lub RNA

• Replikacja DNA (mitomycyna - matryca, bleomycyna - polimeraza)

• Replikacja RNA (aktynomycyna - matryca, ryfamycyna - polimeraza)

2. Hamowanie syntezy białek

• Funkcji rybosomów (aminoglikozydy)

• Wiązania tRNA (makrolidy niepolienowe, chloramfenikol, tetraacykliny)

3. Zaburzenia funkcji błon biologicznych

• Zmiany w strukturze błon (polimyksyny, amfoterycyna)

• Transport jonów poza komórkę (jonofory, gramicydyna, nystatyna)

4. Zakłócenia syntezy ścian komórkowych

• Syntezy peptoglikanu (cykloseryna, bacytracyna, wankomycyna)

• Transpeptydacji (antybiotyki β - laktamowe)

5. Zakłócenia procesów energetycznych (antymycyna, oligomycyna)

30. Toksynotwórcze grzyby z rodzaju Fusarium (toksyny, objawy, występowanie).

Odpowiedź:

Grzyby to organizmy eukariotyczne należące do gromady Eumycota. Stanowią one główną część biomasy edafonu gleby. To organizmy bez chlorofilowe, nie przeprowadzają fotosyntezy. Są chemoorganotrafami, energie zdobywają dzięki utlenianiu związków organicznych. Jako źródło węgla najczęściej wykorzystują węglowodany. Zazwyczaj są organizmami wielokomórkowymi, tlenowymi.

Niektóre z grzybów są toksyno twórcze. Występują one powszechnie w środowiskach. Ich toksyny, zwane mykotoksynami wywierają wpływ na rośliny, zwierzęta, ludzi. Są one produktami metabolizmu wtórnego.

Mykotoksyny są głównie wydzielane przez grzyby z rodzaju Fusarium, Penicilium, Aspergillus i Alternaria.

Grzyby z rodzaju Fusarium są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie (zboża, trawy, rośliny motylkowe). W odpowiednich warunkach namnażają się intensywnie i wytwarzają substancje toksyczne wywołujące tzw. fuzariotoksykozy zwierząt domowych i człowieka. Jako głównych producentów wyróżnia się F. culmorum, F. nivale, F. sporotrichoides, F. graminearum, F. moniliforme.

Grzyby te rosną szybko (ok.2, 3 dni) w temperaturze od 25 do 37 stopni C, w postaci dużych, białych, puszystych koloni, zabarwionych od strony spodniej na kolor różowy. Toksyny Fusarium powodują nadmierne wydzielanie hormonów rujo twórczych, ronienia i niepłodność. Działając na ośrodkowy układ nerwowy mogą być przyczyną zahamowania wzrostu zwierząt i spadku nośności ptaków.

Oprócz chorobotwórczego działania grzybów z rodzaju Fusarium, związanego z produkcja toksyn, grzyb ten może namnażając się powodować grzybice.

Nazwa grzyba	Toksyna	Objawy	Występowanie
F. culmorum i F. graminearum	deoxynivalenol, acetylodeoxynivalenol, nivalenol,	Utrata łaknienia, wymioty	Pszenica, pszenżyto, przetwory zbożowe (mąka, pieczywo), ziarno kukurydzy, przetwory
F. culmorum i F. graminearum	zearalenon	Hyperestrogenizm trzody-działanie hormonalne, zaburzenia płodności	Ziarno kukurydzy, kiszonki zawierające całe kolby kukurydzy
F. moniliforme, F. proliferatum	Fumonizyna B1	Obrzęk płuc trzody, hepatotoksycznośc	Ziarno kukurydzy, przetwory z ziarna kukurydzy
F. moniliforme, F. proliferatum	Pochodne fumonizyny: B2 i B3- są mniej toksyczne	Nowotwory wątroby u trzody	Ziarno kukurydzy, przetwory z ziarna kukurydzy

F. moniliforme produkuje fusarynę, moniliforminę i kwas fusariowy.

F. sporotrichoides - toksyne T-2

---