PRELEKCJE- BK D, Biologia, Biologia komórki


1. MIKROSKOPIA ŚWIETLNA I POMIARY KOMÓREK.

Zasady prawidłowego oświetlenia wg. Kohlera:

Granice rozdzielczości:

Oko - 0,2 mm (200nm)

Świetlny- 200 nm

Elektronowy- 0,2 nm

Zdolność rozdzielcza: wzór:.....

>> określana w jednostkach dł. Jako najmniejsza odległość dwóch struktur dających się odróżnić w obrazie mikroskopu jako 2 oddzielne struktury (punkty)

>> zdolność ta jest zależna od apertury numerycznej obiektywu>> im jest wyższa tym większa jest zdolność rozdzielcza i siła światła

>> graniczna wartość zdolności rozdzielczej zależna jest od długości używanej do badania fali świetlnej i wynosi 0,2 nm

>> dla światła niebieskiego (dł. Fali 0,5 nm) granica zdolności rozdzielczej wynosi 0,17 nm, a dla ultrafioletu (dł. Fali 0,275 nm) około 0,08 nm.

Zdolność rozpoznawcza

>> graniczna szerokość przedmiotu dostrzeganego jeszcze w mikroskopie

Budowa mikroskopu świetlnego

Części optyczne: okulary, kondensor, obiektywy, urządzenie oświetlające

Części mechaniczne: tubus, rewolwer, stolik, makro i mikro śruby, statyw

OKULARY:

OBIEKTYWY:

Obiektywy suche>> między dolną soczewką a preparatem znajduje się powietrze

Obiektywy imersyjne>> między dolną soczewką a preparatem znajduje się płyn

HJ - czarny pierścień - olejek imersyjny

Glyc - czerwony pierścień - imersja glicerynowa

WJ - biały pierścień - imersja wodna

Rodzaje korekcji aberracji:

KONDENSOR:

URZĄDZENIE OŚWIETLAJĄCE:

Typy oświetlenia:

Jasne pole przy świetle przechodzącym:

Ciemne pole:

Mikroskop fluorescencyjny:

Mikroskop konfokalny:

POMIARY

Mikrometr okularowy - okular z podziałką, w którym wyznaczono absolutną wartość (tzw. Wartość mikrometryczną) w jednostkach długości odstępu dwóch kolejnych kresek w podziałce dla danego obiektywu w mikroskopie. >>>odległości między kreskami nie są wykalibrowane /wyskalowane

Mikrometr przedmiotowy - szkiełko przedmiotowe, na którym wyryta jest podziałka. Odległość między dwiema kolejnymi kreskami (najmniejszymi) podziałki wynosi 10 nm.

Wyznaczanie wartości mikrometrycznej = kalibracja

WM = 10 nm. X liczba podziałek (kresek) mikrometru przedmiotowego

Liczba podziałek (kresek) mikrometru okularowego

[nm]

Rzeczywista wielkość struktury

W. rzeczyw. = ilość podziałek x wartość mikrometryczna [nm]

2. TECHNIKI I METODY STOSOWANE W BK

Mikroskop świetlny (pow. X 400) - barwienie hematoksyliną i eozyną

HEMATOKSYLINA - niebieski barwnik o charakterze zasadowym służący do wybarwiania kwasowych (bazowfilnych) struktur komórek np. jądra komórkowe >>> produkt bezbarwny pod wpływem utleniania zamienia się w barwną hemateinę

EOZYNA - różowy barwnik o charakterze kwasowym służący do wybarwiania zasadowych (acidofilnych ) struktur np. cytoplazmy >>> słaby kwas z 4 cząsteczkami bromu reaguje na aniony

Barwniki fluorescencyjne>> w mikroskopie fluorescencyjnym

TEM - mikroskop transmisyjny elektronowy >>> wiązka elektronowa>> ogniskowane przez cewki magnetyczne >> zatopić w żywicy>> pociąć na skrawki

SEM - mikroskop skaningowy elektronowy>>> materiał pokrywamy cienką warstwą metalu ciężkiego>> skanowanie >cewki elektromagnetyczne

AUTORADIOGRAFIA - metoda pozwalająca wykryć w komórce lub tkance związek radioaktywny przy użyciu emulsji światłoczułej

Służy do:

  1. wprowadzenie prekursora

  2. preparat na szkiełko

  3. zanurzenie w roztworze emulsji światłoczułej >wytworzy się cienka błona światłoczuła reagująca na promieniowanie izotopu jak klisza fotograficzna

  4. znakowanie nad preparatem >> można zabarwić inne elementy innym barwnikiem

>> synteza DNA - o tym świadczą kropki nad preparatem na błonie światłoczułaj

poziom szkiełka>> preparat z prekursorem>> emulsja światłoczuła>> ziarna srebra (czarne)

* jeśli seria preparatów z tymidyną - to znakowanie nad jądrem... jeśli użyty prekursor aminokwasów - to lokalizacja w cytoplazmie i droga ścieżką wydzielniczą

RNA - 3H - urydyna

DNA- 3H - tymidyna

DNA i RNA - 3H - cytydyna

Preparatyka:

Metody immunocytochemiczne = immunodetekcja

Odp. POLIKLONALNA - 1 antygen - kilka klonów limfocytów B

Odp. MONOKLONALNA - 1 antygen - klon limfocytów B

* przeciwciało > 1 antygen 1antygen>wiele przeciwciał

Klasy przeciwciał : IgA, IgD, IgE, IgG, (<<najczęściej stosowany) IgM (podział na podstawie różnicy budowie łańcuchów ciężkich)

PRZYGOTOWANIE PREPARATU:

  1. Utrwalanie - zachować strukturę komórki; utrwalenie antygenu w niezmienionym miejscu i stanie pozwala na rozpoznanie go przez przeciwciało>> utrwalacze: aldehydy, alkohole, aceton, kwasy, zw. Metali ciężkich > dostosowane do trwałości badanych struktur

  2. Zatapianie - przesycanie substancją utwardzającą; pozwala na krojenie materiału

Parafina>> m. Świetlny >> oziębiamy

Żywica>> m. Elektronowy>> podgrzewamy > by utwardzić

  1. Krojenie- za pomocą mikrotomu, ultramikrotomu, kriostatu

  2. Nakładanie na szkiełko >> podstawowe (MŚ) lub siatkę (ME)

  3. Barwienie i kontrastowanie

Metody wykrywania antygenu:

Markery:

Fluorochromy - substancje wykazujące zdolność emitowania światła po pobudzeniu ich źródłem promieniotwórczym >> immunofluorescencja

Metale ciężkie- (złoto, kolorowe) - widoczne w mikroskopie elektronowym w postaci wyraźnych czarnych ziarenek

Enzymy - (peroksydaza, alkaliczna fosfataza) - ich lokalizacja uwidacznia się prowadząc dodatkową reakcję enzymatyczną

Znakowanie pośrednie: biotyna, awidyna, streptawidyna

Kompleks ABC - Avidin Biotynylated peroxidase Complex

HYBRYDYZACJA IN SITU

Sondy molekularne >> jednoniciowe odcinki kwasów nukleinowych o znanej sekwencji komplementarnej; pozwalające zlokalizować sekwencje zajmujące położenie w komórce lun w części chromosomu

Etapy:

  1. denaturacja DNA - musi być w formie jednoniciowej by przyłączyć sondę

  2. roztwór z sondą + marker

  3. hybrydyzacja - sekwencje łączą się komplementarnie

  4. obmycie nadmiaru reagentów

  5. detekcja sondy - świecenie sekwencji np. w obrębie chromosomu

FISH - (fluorescent in situ hybrytysation) >> polega na zastosowaniu znakowanych fluorescencyjnie sond molekularnych komplementarnych do określonych genów lub specyficznych la określonych regionów chromosomów (centromery, telomery)

BARWIENIE CYTOCHEMICZNE

METACHROMAZJA - polega na selektywnym barwieniu struktur tkankowy na kolor inny niż kolor samego barwnika >>> barwa zależy od stopnia polimeryzacji cząsteczek barwnika (dimery łączą się chętniej z RNA - kolor fioletowy)

Barwniki metachromatyczne: błękit toluidynowy , azur B, tionina, toluidyna

REAKCJA FLEUGENA- jest to swoista reakcja dla kwasu DNA i polega na poddaniu tkanek łagodnej kwaśnej hydrolizie za pomocą kwasu solnego (HCL)>> hydroliza ta uwalnia grupy aldehydowe deoksyrybozy> po przeprowadzeniu hydrolizy preparat umieszcza się w odczynniku Schiffa (leukofuksyna) który reaguje z uwolnionymi grupami aldehydowymi> tworzy purpurowy barwnik wyłącznie w chromatynie jądrowej

REAKCJA PAS - reakcja wykrywająca w preparatach histochemicznych: monosacharydy, polisacharydy, mukopolisacharydy >>> dzięki zastosowaniu kwasu nadjodowego i odczynnika Schiffa

(mieszanina barwników)

METODA UNNY:

Terminy:

Barwienie progresywne - proces trwa aż do wysycenia barwnika w tkance

Barwienie regresywne- przebarwiamy preparat a później pozbywamy się części barwnika

Barwienie w punkcie wyjściowym- barwienie tylko pewnych struktur np. przy odpowienim ph

Impregnacja - impregnujemy np. solami metali

Barwienie bezpośrednie- barwimy prostym barwnikiem

Barwienie pośrednie- wstępna procedura przed barwieniem która uwalnia pewne grupy chemiczne, które będą reagowały z barwnikiem

Bejcowanie > kwasy , zaprawianie>ałuny

* barwienie proste - 1 barwnik złożone - kilka barwników

SAFRANINA I ZIELEŃ TRWAŁA (najczęstsze barwienie złożone)

FLUOROCHROMY- naświetlane promieniami emitują światło o określonej długości - np. DAPI łączy się specyficznie z DNA - świecąc na kolor niebieski wyznacza DNA

FALLOIDYNA - z muchomora ; łączy się z cytoszkieletem >> z mikrofilamentami aktynowymi - łączy się do włókien aktyny >> sama falloidyna nie jest fluorochromem ale w połączeniu z fluorochromem daje fluorescencję

3. REAKCJA FEULGENA I CYKL KOMÓRKOWY

2 etapy:

1 - hydroliza - w zależności od temp. Odpowiednia molalność kwasu > temp. Pokojowa 5m. Kwas solny > powoduje odszczepienie zasad purynowych i pirymidynowych przy węglu C1 >> hydroliza Feulgenowska - hydroliza wiązania n-glikozydowego przy węglu C1 deoksyrybozy w DNA

>> hydroliza nie może zajść za daleko>> stop zanim zaczną być usuwane histony

>powstaje apurynowe DNA a później odczepiają się zasady pirymidynowe

2 - reakcja grup aldehydowych z odczynnikiem Schiffa

Fuksyna>> roztwór wodny, przy dostępie tlenu barwna>> po zredukowaniu jest bezbarwna (leukofuksyna = odczynnik Schiffa) Barwna dzięki pierścieniowi chinonowemu

Leukofuksyna>> przechowujemy w ciemności bez dostępu tlenu

Preparat z korzenia cebuli.

  1. spłukać korzenie HCl

  2. przeprowadzić hydrolizę w 5 M HCl -25 min

  3. kondycjonowanie- oswoić materiał

  4. odpłukać wodą destylowaną

  5. przenieść do leukofuksyny - 45 min. W ciemności

  6. przenieść korzenie na szkiełka podstawowe z wodą - preparat gnieciony- rozmazowy

Ważne !!!

CYKL KOMÓRKOWY

Cykl mitotyczny - zespół procesów molekularnych i zmian strukturalnych w komórce rodzicielskiej, zachodzących w ściśle określonej kolejności i kierunku, których skutkiem jest precyzyjne podwojenie i rozdział materiału genetycznego między 2 komórki potomne >>Składa się z faz : G1, G2, M , S (typowe dla wyższych eukariotów ) u niższych może brakować G1 lub G2 ale nigdy obu na raz

Kategorie losów komórek w organizmach roślin i zwierząt

  1. komórki rozmnażają się ; o charakterze embrionalnym, merystematycznym, macierzyste

  2. komórki przejściowo spoczynkowe, zdolne do ponownych podziałów (G0/G1) np. zarodki w spoczynkowych nasionach

  3. komórki róznicowane, ale zdolne do odóżnicowania i ponownych podziałów (większość typów komórek roślinnych)

  4. komórki zróżnicowane ostatecznie, niezdolne do ponownych podziałów (nerwowe, mięśniowe)

  5. komórki eliminowane na drodze genetycznie zaprogramowanej śmierci= apoptozy

Cykl mitotyczny:

G1 - faza wzrostu>> intensywny metabolizm komórkowy>> przygotowanie chromatyny do replikacji (ORC, RLF) >> przedreplikacyjna naprawa DNA

S - faza syntezy DNA >> jednorazowa replikacja DNA >> synteza histonów

G2 - faza wzrostu >> intensywny metabolizm>> synteza białek wrzeciona mitotycznego >> naprawa zreplikowanego DNA

M - mitoza

PUNKTY KONTROLNE CYKLU MITOTYCZNEGO (CHECK POINTS)

>> przejście przez punkty kontrolne jest aktywowane dzięki aktywacji przełączników molekularnych >>przełącznik molekularny to kompleks złożony z dwóch komponentów białkowych którymi są :

KINAZA ZALEŻNA OD CYKLIN (CDK= CYCLIN DEPENDENT KINASE) I CYKLINA !!!!

KINAZY - są enzymami fosforylującymi inne białka >> kinazy cyklinozależne bez połączenia z cyklinami nie działają

CYKLINY- regulują aktywność enzymatyczną kinaz

!!! przełączniki molekularne w poszczególnych fazach cyklu są kompleksami różnych CDK i różnych cyklin.

FAZA G1

FAZA S

* Blokada inicjacji fazy S przez p 53 >> połączenie białka inhibitorowego p21 z kompleksem cyklina D/CDK4, CDK6 blokuje aktywację tego kompleksu a więc blokuję fosforylację białka Rba w konsekwencji rozpoczęcie replikacji DNA

FAZA G2

ORC - wyznaczają początek replikonu>> są ładowane podczas G1>> zostaje połączone z DNA do końca cyklu mitotycznego

RLF - umożliwiają rozpoczęcie i trwanie replikacji> są ładowane podczas G1 a usuwane z DNA podczas fazy S po jednorazowej replikacji DNA.

FAZA M

!!!! rośliny nie mają cykliny E

MPF = MITOSIS PROMOTING FACTOR = CDK1 + CYKLINA B

Synonimy CDK1

CHARAKTERYSTYKA MPF

>> histony (H3) - skutkiem jest kondensacja chromosomów od profazy do metafazy

>> laminy blaszki jądrowej - skutkiem jest fragmentacja otoczki jądrowej w profazie

>> białka MAP - skutkiem wzrostu dynamiki MT i powstania dwubiegunowego wrzeciona mit.

>> nukleoliny - skutkiem jest rozproszenie jąderka w profazie

4. STRUKTURA JĄDRA INTERFAZOWEGO

elementy jądra : otoczka jądrowa, blaszka jądrowa z jądrowymi kompleksami porowymi (JKP), matrix jądrowa, chromatyna, jąderko

euchromatyna (słabo upakowana) heterochromatyna (bardzo upakowana)

jąderko - tu znajduje się DNA z którego ma powstać RNA

OTOCZKA JĄDROWA:

JKP= NPC - nuclear pore complex

* transport do jądra: histony, b. Rybosomowe, czynniki transkrypcyjne, czynniki uczestniczące w dojrzewaniu RNA >>>>>>>> transport z jądra do cytoplazmy: podjednostki rybosomowe, mRNA, tRNA, czynniki transkrypcyjne

NLS i NES - sekwencje sygnałowe nieodcinane przez proteazy, co pozwala na wielokrotny transport

MATRIX JĄDROWA:

CHROMATYNA

Modyfikacje posttranslacyjne histonów:

  1. acetylacja- Lys, odwracalna, następuje podczas replikacji i transkrypcji, ułatwia związanie polimeraz>> aktywność transkrypcyjna

  2. fosforylacja - Ser, Thre, odwracalna, zmiany w ufosforylowaniu histonów towarzyszą zjawiskom fazy M

  3. metylacja- Lys, Arg- nieodwracalna, neutralizują dodatnie odcinki aminokwasów

stopnie upakowania chromatyny : helisa DNA> nukleosom> włókno nukleosomowe> solenoid> chromatyda> chromosom

Euchromatyna:

Heterochromatyna

JĄDERKO

Białka jąderkowe:

Typy morfologiczne jąder:

Retikularny- dużo DNA; chromatyna w postaci siateczki

Okapowy - typ retikularnego; telomery i centromery na przeciwległych biegunach jądra ; rejon centromerowy zawiera więcej DNA

Retikularny z chromocentrami- heterochromatyna w postaci chromocentrów (słabo wybarwiona); średnia zawartość DNA

Chromocentryczny- najmniej DNA; widoczne tylko chromocentry

5. CYTOSZKIELET I JEGO FUNKCJE W KOMÓRCE

Funkcje:

Skład:

MIKROTUBULE

Polimeryzacja mikrotubul związana jest z GTP !!!

Mikrotubula ma:

>> na końcu „+” szybciej zachodzi polimeryzacja niż depolimeryzacja, a na końcu „- „ na odwrót

>> mikrotubule zakotwiczone są w MTOC- centrach organizacji mikrotubul ( u zwierząt centrosomy) > gamma tubulina buduje centrosomy

W kom. roślinnych mikrotubule tworzą:

!!!! z mikrotubulami związane są białka MAP >> białka te mogą wiązać się z końcem „+” mikrotubul uniemożliwiając depolimeryzację>> mogą wiązać się z wolnumi dimerami alfa i beta tubuliny>>mogą wiązać się wzdłuż mikrotubul; tworzyć połączenia z mikrotublami;odcinać fragmenty mikrotubul

Białka motoryczne- związane z transportem wzdłuż mikrotubul

Dyneina >> ruch przebiega w kierunku „-„

Kinezyna >> ruch przebiega w kierunku „+”

ZWIĄZKI ZABURZAJĄCE ORGANIZACJĘ MIKROTUBUL.

KOLCHICYNA - wiążą się z wolnymi heterodimerami tubuliny uniemożliwiając polimeryzację MT>>trwająca depolimeryzacja mikrotubul prowadzi do ich znaiku>> blokuje mitozę

WINKRYSTYNA I WINBLASTYNA - hamują polimeryzację MT>> strącają MT jako bezwładny agregat>> stosowane jako cytostatyki w leczeniu nowotworów

TAKSOL- stabilizuje MT, wiąże MT uniemożliwiając ich rozpad, ale nie przeszkadza dalszej polimeryzacji; hamuje mitozę

D2O - stabilisuje MT

MIKROFILAMENTY - FILAMENTY AKTYNOWE

Filamenty aktynowe tworzą:

Białka związane z aktyną: > białka ABP np. filamina

Białka motoryczne związane z aktyną:

Miozyna I - transport pęcherzyków wzdłuż filamentów aktynowych; możę przesuwać filamenty aktynowe względem siebie

Miozyna II - przesuwanie filamentów w mięśniach, skurcz mięśnia, polarność, cytokineza

>filamenty aktynowe są związane z procesami ruchu komórek

Płytka przylegania- miejsce kontaktu komórki z macierzą zewnątrzkomórkową

Ruch komórki przyczepionej do podłożą np. ameba:

Zwiącki zaburzające organizację filamentów aktynowych:

CYTOCHALAZYNY - wydzielana przez śluzowce hamuje polimeryzację aktyny, wiąże się z końcem + co uniemożliwia przyłączenie kolejnych monomerów aktyny i prowadzi do przewagi procesów depolimeryzachi

FALLOIDYNA- silnie trujący alkaloid wytwarzany przez muchomora sromotnikowego; stabilizuje filamenty aktynowe hamując ich depolimeryzację; wiąże się wzdłuż filamentów zaburzając równomierną depolimeryzację

Białka wasp umożliwiają tworzenie fagosomu

FILAMENTY POŚREDNIE

filamenty pośrednie dzielą się na :

6. MITOZA

Przebieg aktywacji MPF

>> skutkiem inaktywacji jest defosforylacja następujących białek strukturalnych

Rozpad kompleksu MPF ma miejsce w późnej anafazie. Jest skutkiem proteolizy cykliny B (ubikwitynacja; ligaza APC/ cdc20 , proteasom)

!!!! Degradacja cykliny B jest koniecznym warunkiem wyjścia komórki z mitozy do fazy G1

Centrum organizacji mikrotubul MTOC w kom. zwierzęcej jest centrosom.

W komórkach roślinnych centrum organizacji MT wrzeciona mitotycznego jest otoczka jądrowa

Kom. zwierzęca- wrzeciono typu astralnego

Kom. roślinna - wrzeciono typu anastralnego

Interstrefa identyczna w kom. zwierzęcej i roślinnnej>> składa się z dwóch połówek> każdy biegun tworzy własny zespół MT

>>> strefa zachodzenia mikrotubul aż do metafazy stabilizują białka sieciowe - kinezyny> aktywowane w przejściu met/ana

3 rodzaje mikrotubul wrzeciona mitotycznego:

FAZY MITOZY I RUCHY MITOTYCZNE ZALEŹNE OD MT:

PROFAZA

PROMETAFAZA

METAFAZA

ANAFAZA A

ANAFAZA B

PRZEBIEG MITOZY W KOMÓRCE ZWIERZĘCEJ

  1. INTERFAZA - (G2) podział centrosomu odbywa się przed mitozą w fazie S/G2

  2. WCZESNA PROFAZA- wzrost mikrotubul wrzeciona - powstanie biegunowości; kondensacja chromosomów

  3. PROFAZA- najdłuższa>> chromatyna przygotowana do podziału> kondensacja>> wyodrębnienie chromosomów>> kinetochory>> wrzeciono>> rozproszenie jąderka >> dezintegracja otoczki jądrowej

  4. PROMETAFAZA - po rozpadzie otoczki jądrowej mikrotubule rosną na terytorium zajmowanym przez chromosomy; ruch chromosomów w kierunku przyszłej płytki metafazalnej = kongresja

  5. METAFAZA - wszystkie chromosomy są ustawione w płytce metafazowej (równikowej); każda z chromatyd tego samego chromosomu jest połączona z przeciwnym biegunem za pośrednictwem mikrotubul kinetochorowych; w strefie płytki mikrotubule zachodzą na siebie.

  6. ANAFAZA - uruchomienie mechanizmu ruchów typu „A” i „B”; precyzyjne i jednoczesne rozdzielenie chromatyd do przeciwległych biegunów wrzeciona

Anafaza A- ruchy generowane przy końcu „+” MT kinetochorowych - skutek -skracanie się MT

Anafaza B- ruch ślizgowy generowany między przeciwległymi MT biegunowymi w stronę zachodzenia; skutek- ślizg wzdłuż MT biegunowych; rozjeżdżanie się biegunów

  1. TELOFAZA - proteoliza cykliny B; rozpad MPF; dekondensacja chromosomów; odtwarzanie otoczki jądrowej ; jąderka, cytokineza

Centromer = przewężenie pierwotne w chromosomie metafazowym; średnica chromatydy w centromerze =250 nm ; średnica w ramionach = 750 nm.

Skład centromeru w chromosomie metasfazowym:

DNA centromerowe

Funkcje białek kinetochorowych

kohezyna mitotyczna- łączy chromatydy- dołączona w fazie S podjednostki SMC i Scc

SMC- białka podtrzymujące strukturę chromosomu

Scc- regulatorowe; kohezja chromatyd >>> podjednostki tworzą dimer; mogą się składać lub rozwierać

2 typy chromosomów

zabezpieczenia między złymi połączeniami

  1. punkt kontrolny wrzeciona

  2. złe połączenia są destabilizowane przez AURORA B >>> fosforyluje kinazę katastroficzną- niszczy złe połączenia

IM= indeks mitotyczny= % komórek dzielących się w populacji wszystkich komórek - minimum 200 kom

IF= indeks fazowy= % udział każdej z faz w populacji komórek dzielących się

7. INHIBITORY MITOZY

TRUCIZNY PREPROFAZOWE ->> efekt mitodeprezyjny lub mitoklastyczny >> inhibicja syntezy DNA, RNA, białek, inhibicja mechanizmu oddechowego>>> zmniejszenie wartości indeksu mitotycznego>> brak widocznych zakłóceń mitozy

ZWIĄZKI MUTAGENNE (GENOTOKSYCZNE) >> efekt chromatoklastyczny- zmiany w strukturze chromosomów i nieprawidłowości w mitozie>> aberracja chromosomowa, zakłócenia w przebiegu mitozy; mitodepresja>>>>> interkalacja- wniknięcie związku mutagennego międzi 2-nici DNA>> zwiększenie odległości między nimi>> despiralizacja

INHIBITORY WRZECIONA>> efekt mitoklastyczny>> depolimeryzacja lub stabilizacja mikrotubul wrzecziona>> C-mitozy, poliploidyzacja komórek

ZWIĄZKI ALKILUJĄCE >> iperyt azotowy>> mogą reagować z resztami fosforanowymi w DNA, alkilują zasady azotowe>> 2 efekty>> reakcja z resztami kwasowymi - wytworzenie wiązań, co osłabia oddziaływanie między zasadami a deoksyrybozą, zerwanie nici >>> reakcja z zasadami - zmetylowanie zasady- źródło błędów w cyklu replikacyjnym>>>>>>>>> czynnikami alkilującymi są związki elektrofilowe, podstawiające grupę etylową lub metylową w różnych pozycjach DNA

ANALOGI ZASAD AZOTOWYCH >>> mutagenne działanie analogów zasad polega na:

  1. hamowaniu aktywności syntaz deoksyrybonukleotydów 2- inkorporacji do DNA i podstawianiu podczas replikacji niekomplementarnych zasad 3- tworzeniu międzyniciowych wiązań w DNA

Czynniki określające podatność DNA na uszkodzenia

  1. związki mutagenne reagują częściej z DNA łącznikowym >>> środkowy odcinek nukleosomowego DNA jest silniej chroniony przed dostępem związków mutagennych (silniejszy skręt spirali i zwiększenie bruzdy mniejszej DNA)

  2. mutageny wiążą się z preferencyjnymi sekwencjami regulatorowymi leżącymi w rejonach promotorów wzmacniaczy i miejsc startu replikacji sekwencjami S/MAR

  3. replikacja jest stanem zwiększającym podatność DNA na działanie mutagenów.spowodowane to jest: >> dekondensacją chromatyny>> brakiem struktury nukleosomowej lub zmienioną formą nukleosomów

Aberracje chromosomowe

Delecja- oderwanie acentrycznego fragmentu chromosomu, który nie zostaje przyłączony (delecja terminalna i interkalarna)

Duplikacja- powtórzenie fragmentu sekwencji

Inwersja - oderwany fragment chromosomu zostaje powtórnie przyłączony ale odwrócony o 180 stopni

Translokacja- przemieszczenie fragmentu chromosomu wewnątrz lub na inny chromosom

Skutki aberracji chromosomowej widocznej w mitozie:

Inhibitory wrzeciona:

TAKSOL

ALKALOIDY VINCA:

KOLCHICYNA

8. KARTOTYP

Włókno nukleosomowe:

Włókno solenoidowe:

CHROMOSOM

Typy chromosomów: metacentryczny, submetacentryczny, akrocentryczny, telocentryczny

Podstawowe cechy chromosomów

Do analizy kariotypu:

Badania kariotypu prowadzi się w celu:

Techniki w kariotypowaniu:

LICZBA CHROMOSOMÓW NIE ZALEŻY OD ZAWARTOŚĆI JĄDROWEGO DNA

Wskazania do postnatalnego badania kariotypu człowieka:

Mutacje chromosomowe:

ANEUPLOIDIA - gdy występuje utrata chromoromu lub jest o jeden za dużo

Monosomia 2n-1 (zespół Turnera X+0)

Nullisomia 2n-2

Trisomia 2n+1 (zespół Klinefeltera XXY) Zespół Downa

Tetrasomia 2n+2

>>> przyczyną takich zaburzeń jest :1- nondysjunkcja - polega ona na tym, że chromosomy, które połączyły się w zygotenie nie rozchodzą się w diplotenie i do jednej z gamet wędruje cała tetrada, zaś do drugiej nie wędruje żaden chromosom

  1. brak rozejścia się chromosomów siostrzanych w drugim podziale mejotycznym

  2. brak rozejścia się chromosomów w mitozie

EUPLOIDIA - pomniejszenie lub zwielokrotnienie całego garnituru chromosomalnego; 1n- monoploidalna kukurydza; 3n triploidalne buraki cukrowe

ALLOPLOIDIA - występuje, gdy garnitur chromosomalny danego osobnika pochodzi od dwóch różnych gatunków np. muł = koń+ osioł żubroń= żubr+bydło domowe

9. CYTOKINEZA

CYTOKINEZA W KOMÓRKACH ZWIERZĘCYCH

Cytokineza- ostatni etap cyklu komórkowego, podczas którego z komórki rodzicielskiej powstają dwie komórki potomne>> proces podziału cytoplazmy towarzyszy rozdziałowi chromosomów podczas mitozy (cytokineza nachodzi czasowo na mitozę)>> cytokineza przebiega odmiennie w kom. roślinnych i zwierzęcych

Przebieg

Etapy:

  1. wyznaczenie płaszczyzny podziału cytoplazmy - anafaza- aktywacja RhoA

  2. powstanie pierścienia kurczliwego i bruzdy podziałowej - telofaza - aktynomiozyna

  3. pogłębianie bruzdy podziałowej i rozdział komórek potomnych- późna telofaza - kurczenie się pierścienia aktynomiozyny

Gdzie i kiedy wyznacza się płąszczyzna podziału? Co determinuje jej lokalizację?

ETAP 1 - wyznaczenie płaszczyzny podziału w kom. zwierzęcej

WNIOSEK1 - położenie wrzeciona mitotycznego determinuje położenie płaszczyzny podziału komórek zwierzęcych>> płaszczyzna podziału zostaje wyznaczona przez mikrotubule wrzeciona mitotycznego>>> w centralnej części wrzeciona podziałowego powstaje struktura zbudowana z równoległych, lecz biegnących w przeciwnych kierunkach mikrotubul ( spindle midzone)>>> białka związane z chromosomami ulegają translokacji i są zlokalizowane w centralnej części wrzeciona- białka kompleksu Aurora (kinaza serynowo treoninowa) INCENP i inne

WNIOSEK2 - przebieg cytokinezy wymaga obecności białek centralnej części wrzeciona podziałowego >> białka kompleksu Aurora ( kinaza serynowo/treoninowa)- INCENP, Aurora B surwiwina, w anafazie przemieszczają się z chromosomów do centralnej części wrzeciona podziałowego i regulują segregację chromosomów i cytokinezę, wpływając na lokomocję białek motorycznych>>> białka motoryczne - kinezyny>>>> podczas anafazy zachodzi inaktywacja kompleksu cyklina B- cdk1

WNIOSEK 4 : w wyznaczaniu płaszczyzny podziału oprócz mikrotubul biegunowych zaangażowane są mikrotubule astralne

Budowa pierścienia kurczliwego

Wnioski:

1 - bruzda podziałowa w błonie kom. powstaje w wyniku skurczu pierścienia kurczliwego

  1. siła generowana przez pierścień kurczliwy jest wynikiem ślizgania się filamentów aktynowych po miozynowych

  2. ponadto pęcherzyki transportowane są do bruzdy podziałowej- uzupełninie błony kom. miedzy dzielącymi się kom.

  3. pomiędzy komórkami powstaje ciałko środkowe

  4. w ostatnim etapie zanika pierścień kurczliwy - depolimeryzacja filamentów aktynowych

  5. rozdział komórki

CYTOKINEZA W KOM. ROŚLINNYCH

  1. PASMO PREPROFAZOWE - wyznaczanie płaszczyzny podziału

  2. Mikrotubule, mikrofilamenty aktyny i białka kinezynopodobne to fragmoplast>> organizacja wrzeciona cytokinetycznego

  3. Mkrotubule- transport pęcherzyków sekrecyjnych

  4. Przegroda pierwotna- podział komórki

PASMO PREPROFAZOWE

Kofeina - inhibitorem cytokinezy>> działanie kofeiny jest widoczne w tubularno-pęcherzykowym stadium przegrody pierwotnej>> stabilizacja struktury rosnącej przegrody zależy od obecności kalozy w przedziale międzybłonowym przegrody>>. Przegroda tworzy się tylko meiedzy siostrzanymi komórkami

Zmiana morfologii fragmoplastu podczas cytokinezy:

  1. koalescencja MT anafazowych

  2. polimeryzacja MT de novo

  3. ustalenie antyrównoległego układu MT (ślizg)

  4. uformowanie fragmoplastu złożonego z 2 spolaryzowanych warstw MT ze strefą zachodzenia

  5. lateralna ekspansja fragmoplastu (depolimeryzaca MT w centrum fragmoplastu i polimeryzacja na obwodzie rosnącej przegrody pierwotnej)

  1. MEJOZA

Inicjacja cyklu mejotycznego (drożdże)

-kompleks cyklin fazy G1 z cdc2B zapobiega jednoczesnej inicjacji cyklu mejotycznego i mitotycznego

aktywny Ime1 promuje transkrypcję genów wczesnej mejozy i kinazy Ime2

PREMEJOTYCZNA FAZA S

  1. Do chromosomów dołączana jest specjalna mejotyczna kohzyna z podjednostką Rec 8

  2. Przygotowywanie DNA do rekombinacji rozpoczyna się w leptotenie

PROFAZA I - LEPTOTEN

- w leptotenie przebiegają niezależnie od siebie: 1- parowanie chromosomów homologicznych 2- inicjacja DSB (dwuniciowe przerwy w DNA)

ZYGOTEN

WĘZŁY REKOMBINACYJNE

ENZYMY

Endonukleaza DNA>> otwieranie 1 lub 2 nici w cząsteczce DNA

Helikazy>> rozwijanie łańcuchów nukleotydowych

Białka SSBP>> stabilizacja rozwiniętego 1-niciowego DNA

Topoizomeraza I DNA>> rozwijanie lub zwijanie DNA

Topoizomeraza II DNA>> porządkowanie struktury DNA z zapętleń powstałych po rekombinacji

Egzonukleaza - nadtrawianie wystających wolnych końców łańcuchów DNA

Polimeraza Dna>> wypełnianie przerw powstałych w łańcuchach polinukleotydowych

Enzymy rekombinacyjne rec>>

Enzym Ruvc>> rozwiązanie struktury Hollidaya

PACHYTEN

DIPLOTEN

DIAKINEZA

METAFAZA I

ANAFAZA I

Warunki niezbędne do zredukowania liczby chromosomów podczas mejozy:

  1. do końca pierwszej metafazy chromosomy homologiczne muszą być połączone w biwalent >>> jest to możliwe dzięki chiazmom i połączeniu siostrzanych chromatyd w obydwu chromosomach (kohezyna) do końca interfazy>>> połączenie jest wystarczająco trwałe aby wytrzymać siły generowane przez oddziaływanie MT wrzeciona z kinetochorami

  2. kinetochory chromatyd siostrzanych muszą być połączone mikrotubulami wrzeciona z jednym jego biegunem (monopolarnie)

  3. kinetochory każdego z chromosomów w biwalencie muszą być połączone z różnymi biegunami wrzeciona>>>> do prawidłowego połączenia kinetochorów z MT wrzeciona konieczna jest współorientacja siostrzanych kinetochorów>> współpracę kinetochorów zapewnia kohezyna zasocjowana z centromerowym DNA

4.- siostrzane chromatydy połączone są kochezyną w centromerach aż do anafazy II

SHOGUSHIN (SGO1) - asocjuje z kohezyną zlokalizowaną w przycentromerowej heterochromatynie i chroni kohezynę przed degradacją

11. CYKLE ENDOREPLIKACYJNE

Endoreplikacja- zwielokrotnienie ilości DNA poza cyklem komórkowym

Powielenie całości DNA:

ENDOMITOZA - wzrost liczby chromosomów, powstają komórki 4c/8c/16c w obrębie 1 jądra - dochodzi do rozdzielenia siostrzanych chromatyd

ENDOREDUPLIKACJA - liczba chromosomów nie ulega zmianie; zwielokrotnieniu ulega liczba chromatyd (chromosom politeniczny- wielochromatydowych)

Powielenie części DNA:

WYBIÓRCZA REPLIKACJA (AMPLIFIKACJA)- geny kodujące rybosomowe rRNA- poza chromatyną

NIEPEŁNA REPLIKACJA - zachodzi w kom. których różnicowanie kończy się programowaną śmiercią np. kom. wieszadełka, liścieni zarodka, bielma

Endomitoza, endoreplikacja i amplifikacja towarzyszą wczesnym stadiom rozwoju rośliny lub jej organów. Np. kom.epidermy, miękisz u sukulentów, włośniki

Endorepilacja w kom. owadów i ssaków >> kom. przetchlinek, cewek Malphigiego, ścian jelita, kom. troficzne, follikularne, megakariocyty - produkują płytki krwi . trofoblasty- budują lewą warstwę kosmówki

Zmienione mechanizmy w przejściu:

Endomitoza- megakariocyty >>cykl endoreplikacyjny jest inicjowany przez trombopoetynę

Megakariocyty= struktury znajdujące się na powierzchni naczyń krwionośnych, mają wypustki które wnikają do tych naczyń >>> w endomitozie nie ma anafazy B - reszta jest normalnie.>>> wyjście z mitozy z powodu przedwczesnej lub zintensyfikowanej degradacji cykliny B

Endomitoza- komórki miękiszowe >> zahamowanie degradacji otoczki jądrowej, nie powstaje wrzeciono kariokinetyczne>> chromosomy dzielą się na chromatydy

Endoreduplikacja >> po replikacji DNA chromatydy nie oddzielają się> powstają chromosomy politeniczne- złożone z wielu cząsteczek DNA >> Puffy- Pierścienie Balbianiego- chromatyna aktywna transkrypcyjnie

W cyklach endoreduplikacyjnych muszą być spełnione 2 warunki:

  1. blokada wejścia w mitozę

  2. cykliczna replikacja DNA

Replikacja jest możliwa po osiągnięciu przez chromatynę stanu kompetencji.

W typowym cyklu komórkowym chromatyna jest kompetentna do replikacji w fazie G1, aby ją ponownie uzyskać musi przejść mitozę.

Ochrona przed przedwczesną inicjacją replikacji:

!!! niski poziom białka Dacapo (CIP/KIP) inhibitora kinazy cdk2 pozwala na utrzymanie aktywności kompleksu cdk2/ E, niezbędnego do inicjacji replikacji

Endoreduplikacja - trofoblasty (ssaki)

Niepełna replikacja i amplifikacja

>> endonukleaza rozcina jedną z nici DNA

>> wolny koniec 3' jest miejscem inicjacji replikacji

>> polimeraza cyrkuluje po kolistej matrycy - wydłuża się przecięta nić DNA

Korzyści endoreplikacji:

12. HODOWLE KOMÓREK I TKANEK - IN VITRO

hodowla komórek- utrzymywanie komórek poza organizmem w medium hodowlanym w ściśle określonych warunkach (temp. Wilgotnosć ph)

Sprzęt:

Sterylizacja:

W zależności od ilości komórek: szalki, butelki, leptek

Inkubator> stałe warunki jakei panowało w organizmie

Pożywki>> kom. zwierzęce musza mieć wszystkie niezbędne składniki do życia> dawniej pożywki naturalne, osocze krwi, wyciąg tkankowy, surowica krwi >>> pożywki sztuczne MEM DMEM, sól fizjologiczna ,,, MEM- podstawowa pożywka, inne zmodyfikowane

Surowice- hormony, czynniki wzrostu, białka transportuyjące

Hodowla pierwotna- prowadzona z materiału pobranego bezpośrednio z organizmu

Linia komórkowa - powstaje z hodowli pierwotnej po pierwszym pasażu - ustalona linia komórkowa

Kom. macierzyste- mogą przekształcać się w różne tkanki

Kom. progenitorowe- wyznaczone do bycia komórkami określonej tkanki

Hodowla z ekspantantu- hodowla drobnych fragmentów tkanki>> z fragmentów tych przyczepionch do dna naczynia i umieszczonych w pożywce wywędrowują komórki>> nie zawsze można uzyskać komórki które wymigrowują- niektóre trzeba wyseparować

Enzymy:

  1. kolagenaza- tam gdzie kolagen

  2. dispaza- zdolne do degradacji różnych białek

Wyizolowane komórki muszą mieć podłoże twarde do wzrostu- nie rosną na szklanym ani w zawiesinie>> hoduje się na sterylnych plastikowych szalkach>> niektóre kom. muszą mieć białka z tkanek>> zelatyna, kolagen

Hodowla na mikronośnikach- wykorzystująca kuleczki żelatynowe, polistyrenowe, poliakrylamidowe, sefandeksowe nagie lub pokryte białkami macierzy>> w celu zwiększenia powierzchni

Krzywa wzrostu:

  1. komówki w fazie adaptacyjnej- nieznaczny spadek liczby

  2. namnażanie

  3. logarytmiczny wzrost

  1. faza platau - równowaga

  2. procesy obumierania

zamrażanie i odmrażanie komórk>> do ciekłego azotu>> odmrażanie przez zewnętrzne ogrzanie propówki lub dodanie ciepłego medium i umieszczenie w środowisku hodowlanym



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
egzamin BK, Biologia, Biologia komórki
bk wszystkie pytania, BIOLOGIA KOMÓRKI
BK-CW-calosc-druk, Studia, biologia komórki
jak sklonowano myszy, biologia komórki
kontrola cyklu komorkowego i smierc komorki, BIOLOGIA UJ LATA I-III, ROK II, semestr I, biologia kom
ćwiczenie 2 pomiary, Biologia Komórki, Prezentacje, 2011 lato
Wykład piąty biologia komórki
Biologia Komorki Cykl Komorkowy Nieznany (2)
Test biol kom, biologia komórki(3)
MITOCHONDRIA, biologia komórki
EgzaminBiologia 2013, Edukacja (UMCS Lublin), Biologia Komórki (UMCS), Egzamin
jądro interfazowe, STUDIA, biologia komórki
BIOL.KOM pytania chyba Witaliński, biologia uj, biologia II, biologia komorki, egz
Apoptoza, Materiały, Biologia komorki materialy
JĄDRO KOMÓRKOWE, biologia komórki
EgzaminMikrobPytania2008, chemia organiczna, biologia ewolucyjna-wykłady, genetyka, biologia komórki

więcej podobnych podstron