WYMAGANIA STAWIANE PODŁOŻOM STAWIANYM DO HODOWLI SZCZEPÓW PRZEMYSŁOWYCH

Pożywki ze względu na ich podstawowe znaczenie w diagnostyce mikrobiologicznej powinny spełniać określone wymagania drobnoustrojów, a także pracowników laboratorium, dlatego podczas ich sporządzania należy tak dobrać składniki, aby:

1. Miały odpowiednią wartość odżywczą

Ten warunek zapewnia dobór składników niezbędnych do życia, wzrostu i rozmnażania drobnoustrojów. Wszystkim organizmom są niezbędne pierwiastki biogenne tj. C, O, N, P, S, a ponad to inne pierwiastki w ilościach śladowych tj. mikroelementy.

W podłożu odżywczym do hodowli heterotrofów muszą być obecne substancje organiczne w postaci peptonu, który jest źródłem azotu. Źródłami różnych pierwiastków są sole min., np. fosforany, siarczany.

2. Wykazywały odpowiedni odczyn pH

Reguluje się go wg potrzeb poszczególnych grup drobnoustrojów. Dla większości z nich optymalny jest odczyn słabo alkaliczny (7,2-7,4), natomiast dla grzybów odczyn kwaśny (5,5-6,5)

3. Były przejrzyste

Szczególnie ważna cecha pożywek płynnych, konieczna do wizualnego stwierdzenia wzrostu drobnoustrojów, które namnażając się powodują zmętnienie, powstanie osadu lub błonki na powierzchni podłoża.

4. Były sterylne (jałowe)

Podstawowa cecha warunkująca prawidłową pracę laboratorium mikrobiologicznego i wiarygodność wyników analiz.

5. Wykazywały izotoniczność

• Polega na stworzeniu w nich ciśnienia osmotycznego podobnego do ciśnienia w komórkach.

• Podłoże hipotoniczne - o niższym ciśnieniu osmotycznym niż w komórkach, powoduje ich pęcznienie a nawet pękanie.

• W podłożu o ciśnieniu hipertonicznym - o wyższym ciśnieniu osmotycznym niż w kom. następuje kurczenie się plazmy komórkowej i oddzielenie od ściany kom. drobnoustrojów.

• Zjawiska te powodują zmianę morfologii kom. drobnoustrojów i zaburzenie ich fizjologii.

• Pożywki izotoniczne nie powodują takich zaburzeń. W celu uzyskania izotoniczności do podłoża dodaje się NaCl.

6. Dokładność

• Dokładność uzyskanego wyniku w stosunku do wartości rzeczywistej. Oznaczana na podstawie znanych wzorów, porównanie z wynikami uzyskanymi inną opracowaną i znormalizowaną metodą. Wyliczona z rozcieńczenia zawiesiny bakteryjnej.

• W badaniach ilościowych należy tak dobrać rozcieńczenia aby otrzymać 30-300 cfu/płytkę.

• Wyrażona jako % odzyskanych drobnoustrojów w teście.

• Należy analizować co najmniej 5 rozcieńczeń.

• Kryterium akceptacji jest co najmniej 70% wartości wyjściowej.

7. Precyzja

• Oznacza stopień zgodności pomiędzy wynikami poszczególnych oznaczeń przy wielokrotnym badaniu tej samej próbki przez ten sam personel laboratoryjny przy użyciu tych samych sprzętów, aparatury.

• Określona przy wykonaniu odpowiedniej ilości oznaczeń i dla różnych stężeń.

• Wyrażona jako odchylenie standardowe lub jego współczynnik.

• Dla metod mikrobiologicznych akceptuje się współczynnik zmienności w zakresie 15-30%.

8. Czułość

• Wartość liczbowa najmniejszej wykrywalnej różnicy

• Obejmuje wykrywalność, oznaczalność, liniowość i zakres

• Granica wykrywalności - najmniejsza liczba drobnoustrojów którą można wykryć w próbie

• Granica oznaczalności - najniższa liczba drobnoustrojów, którą można oznaczyć zarówno ilościowo jak i jakościowo z określoną, akceptowaną dokładnością

• Liniowość - wskazuje czy istnieje proporcja między wynikami a liczbą drobnoustrojów. Miarą jest współczynnik korelacji (0,9)

9. Swoistość

Zdolność do zmierzenia jednego ze składników (drobnoustrojów) w obecności innych

PARAMETRY CHARAKTERYZUJĄCE POŻYWKĘ

Pożywka referencyjna - pożywka o określonych cechach i właściwościach stanowiąca punkt odniesienia w stosunku do badanej pożywki.

Pożywkami referencyjnymi są podłoża TSA i TSB

Pożywką referencyjną może być ta sama pożywka poprzedniej sprawdzonej serii lub też gotowe podłoże firmowe gotowe do użycia.

OCENA ŻYZNOŚCI POŻYWKI - żyzność pożywki zależy od składu podłoża

Współczynnik żyzności PR=

Ns - całkowita liczba jednostek tworzących kolonie na pożywce badanej

No - całkowita liczba jednostek tworzących kolonie na pożywce referencyjnej

PR dla pożywki nieselektywnej =0,7, dla selektywnej =0,1

OCENA SELEKTYWNOŚCI POŻYWKI

Współczynnik selektywności SF=Do-Ds.

Do - najwyższe rozcieńczenie wykazujące wzrost przynajmniej 10 kolonii na pożywce referencyjnej

Ds - najwyższe rozcieńczenie wykazujące wzrost przynajmniej 10 kolonii na pożywce badanej

SF dla drobnoustrojów niespecyficznych na pożywce selektywnej nie powinien być większy niż 2. Wartość SF wyrażona jest w jednostkach LOG.

CECHY BIOCHEMICZNE I FIZJOLOGICZNE

W przypadku pożywek różnicujących niezbędne jest określenie specyficzności reakcji biochemicznych z zastosowaniem zestawu szczepów kontrolnych.

Partia pożywek może być uznana za odpowiednią pod względem jakości jeśli szczepy kontrolne dają reakcje zgodne w zakresie cech ogólnych i hodowlanych.

KOLEKCJE SZCZEPÓW

DROBNOUSTROJE REFERENCYJNE

• Muszą pochodzić z uznanych kolekcji lub od (producentów) dostawców posiadających systemy zapewnianie jakości, muszą być namnażane zgodnie z ich zaleceniami

• Dla każdej normatywnej metody … lub oznaczenia l. drobnoustrojów jak też składu i przygotowanie pożywek opracowane są zestawy odpowiednich drobnoustrojów testowych oraz kryteria oceny

• Laboratorium może opracować szczepy własne i je stosować, muszą one być odpowiednio scharakteryzowane.

Kolekcje szczepów gromadzą mikroorganizmy tzw. czyste kultury o znanej charakterystyce.

SZCZEPY POWINNY

• być niepatogenne

• nie mogą wytwarzać toksycznych produktów

• muszą być stabilne biologicznie

Celem kolekcji jest zapewnienie referencyjnych szczepów bakteryjnych dla celów badawczych, porównawczych ,edukacyjnych. Wiele z nich ma znaczenie praktyczne, jest stosowana w przemyśle, biotechnologii. Szereg szczepów wzorowych używa się jako standardy.

ZADANIE KOLEKCJI -

- poszukiwanie nowych szczepów o przydatnych cechach oraz ich ulepszanie z zastosowaniem metod klonalnych i inż. gen.

-klasyfikacje i identyfikację drobnoustrojów

-badania nad doborem skutecznych metod przechowywania drobnoustrojów w war. Lab.

PRZECHOWYWANIE KOLEKCJI

-zasadniczym celem jest utrzymanie drobnoustrojów żywych, niezniszczonych, bez mutacji

-dokumentacja kolekcji kultur roboczych

-metody przechowywania drob. Standardowych

-długotrwałe (liofilizacja, głębokie zamrożenie)

-krótko terminowe (pasażowanie, zamrożenie w temp. Do -20oC, suszenie, imersja W oleju)

PRZYGOTOWANIE KULTUR ROBOCZYCH

-szczep referencyjny : liofilizat w temp. -80oC (kilka lat)

-szczep macierzysty : hodowle na porcelanowych. Koralikach w temp. -80⁰C do 2 lat (I pasaż)

-szczep roboczy : hodowle na podłożach (skosy) temp. 2-8⁰C - II pasaż

hodowle na podłożach stałych - III pasaż

METODY SELEKCJI SZCZEPÓW PRZEMYSŁOWYCH

WYSIEWANIE NA PŁYTKI Z RÓŻNYMI PODŁOŻMI

Przez dobór

1. składu chemicznego pożywki,

2. ciśnienia osmotycznego,

3. pH,

4. temp.,

5. natężenie światła,

6. natlenienie,

7. potencjał ox-red,

8. czasu hodowli,

9. zastosowanie selektywnych inhibitorów

ZASTOSOWANIE DODATKOWYCH ZABIEGÓW, które powodują wzrost ilości drobnoustrojów będących przedmiotem poszukiwań przy jednoczesnym zmniejszeniu udziału innych niepożądanych.

W tym celu stosuje się :

• Odpowiednie oddziaływanie na środowisko przed poborem próbki np. zakwaszenie, alkalizacja

• Wprowadzenie do środowiska wabików (pułapek)

• Wstępną obróbkę fizyczną lub mechaniczną próbki

• Hodowlę wzbogacającą

TESTY SELEKCYJNE, w których konstrukcji poszukuje się cechy biochemicznej powiązanej bezpośrednio lub pośrednio ze zdolnością mikroorganizmu do produkcji wybranego produktu.

CHARAKTERYSTYKA SZCZEPÓW PRZEMYSŁOWYCH

1. korzystny wpływ na smak i aromat produktu

2. antagonizm do patogenów

3. nie mogą zawierać żadnych wyznaczników chorobotwórczości

4. muszą pochodzić z naturalnych środowisk

5. muszą być stabilne biologicznie (nie ulegać mutacjom)

6. nie powinny reagować na czynniki fizykochemiczne (temp., pH, zmiana składu podłoża)

7. powinny być odporne na bakteriofagi

8. powinny wykazywać odpowiednią aktywność biochemiczną

9. brak antagonizmu do innych składników kultur

METODY UTRWALANIA I PRZECHOWYWANIA SZCZEPÓW

ZAMRAŻNIE- jest najpowszechniejszą i najprostszą metodą utrwalania mikroorganizmów. Wykorzystuję się do tego tradycyjne dostępne urządzenia. W celu uzyskania zadowalających wyników do utrwalonej kultury dodaje się składników osłaniających. Ważne jest aby temp. przechowywania była niższa od -20 oC

Tradycyjne zamrażanie : pożywka z namnożoną biomasą lub komórki zebrane ze skosu umieszczone są w specjalnych fiolkach i przechowywane w zamrażarce.

-5 do -20 (zachowują żywotność 1-2 lata)

Zamrażanie w ultra niskich temp.

-60 do -80 w specjalnych zamrażarkach mechanicznych

-156 do -196 przy użyciu ciekłego azotu

KRIOPROTEKTANTY

10% v/v glicerol

10% roztwór DMSO (dimetylosulfotlenek)

W temp.-60oC można przechowywać większość szczepów bakterii i grzybów nawet 5 lat.

LIOFILIZACJA - jedna z najbardziej efektywnych metod przechowywania długotrwałego.

Proces polega na usuwaniu wody z zamrożonej suspensji komórek drobnoustrojów.

Składniki ochraniające dodawane do zamrożonej suspensji :

- odtłuszczone mleko w proszku ok. 20%

- sacharoza w ilości 12%

Większość szczepów przechowywana za pomocą tej metody 10 lat.

Należy je przechowywać w temp. <5oC

Przy długotrwałym ich przechowywaniu jest wskazane przechowywanie w zamrażarkach w temp. -20 do -70oC

SUSZENIE ROZPYŁOWE - metoda utrwalania przebiegająca natychmiastowo, jednak liczba żywych bakterii jest znacznie mniejsza, niemniej w czasie długiego przechowywania (do 8 m-cy) w temp. 8oC liczba bakterii nie ulega zmianie. Suszenie biomasy wymaga uprzedniego zastosowania substancji ochronnej np. mleka odtłuszczonego w proszku. W celu zapewnienia dużej przeżywalności bakterii zaleca się ich suszenie w temp. <50oC.

SZCZEPIONKI PRZEMYSŁOWE

Kserówki - koło III

BAKTERIE FERMENTACJI MLEKOWEJ I PROPIONOWEJ

BFM :

1. Gram (+)

2. W większości względnie beztlenowe, choć niektóre pałeczki są mikroaerofilami, Bifidobacterium to ścisłe beztlenowce

3. Nie mają systemu cytochromów

4. Nie tworzą katalazy

5. Nie są przetrwalnikujące

6. Nie redukują azotanów

7. Nie mają zdolności ruchu (wyjątek - niektóre ziarniaki)

8. Mają duże wymagania pokarmowe jeśli chodzi o azot i witaminy

9. Nie syntetyzują niektórych aminokwasów/witamin

10. Występują na zielonych częściach roślin, w organizmach ludzi, zwierząt, na błonach śluzowych jamy ustnej w przewodzie pokarmowym

11. Są stałą mikroflorą urządzeń w mleczarstwie, mleka surowego, mięsa

12. Są bardzo wrażliwe na antybiotyki i środki dezynfekujące

13. Znaczenie ich w żywności jest bardzo różnorodne

• Pieczywo ciemne i mieszane na zakwasie

• Szynki i kiełbasy dojrzewające np. salami

• Kiszonki

• Sery, twarogi, jogurty, masło

• Fermentowane soki

14. W pewnych warunkach są przyczyną wad żywności

BFM homofermentatywne

Paciorkowce kwaszące:

Lactococcus:

-Lc. Lactis ssp. Lactis

-Lc. Lactis ssp. Cremoris

-Lc. Lactis ssp. Lactis biovar

-Lc. Diacetylactis- kwasząco aromatyzujące

Streptococcus

-S. teromphilus

Enterococcus

-E. faecalis

-E. faecitum?

-E. durans?

Ziarniaki:

Pedicoccus

-P. pertosaceus

Pałeczki:

Lactobacillus

a)Mezofilne ok. 30 st C do 1,5 % kwasu mlekowego b)termofilne 2,7 % kw. Mlekowego optimum 37- 44st C

- Lb. Alimentarius -Lb. Audophilus

-Lb. Casei - Lb. Helieticus

-Lb.curvatus - Lb. Delbueckii ssp. bulgaricus

-Lb.oris -Lb. Delbruecki ssp. lactis

-Lb. Plantarum

-Lb. rhamnosus

BFM heterofermentatywne z wytworzeniem CO2

Lactobacillus:

-Lb. brevis

- Lb. buchneri

-Lb. fermentum kefyr

-Lb. reuteri

-Lb. sanfranciscensis

-Lb. viridescens= …… viridenscens

Carnobacterium

-C. discergens

-C. piscicole

Leuconostoc

-Leuc. Lactis

-Leuc. Mesenteroides ssp. Cremoris

-Leuc. Mesenteroides ssp. Dextranicum

-Leuc. Mesenteroides ssp. Mesen…?

Heterofermentacja bez CO2

Bifidobacterium

-B. adolescentis

-B. bifidum

-B. breve

-B. longum

Bakterie propionowe:

-Beztlenowe lub wzg. Beztlenowe

-większość tworzy kolonie G(+)

- charkteryzuje się zmiennością kształtu

- występuje w mleku i jego przetworach

- zdolne do syntezy Wit. B12

- nie tworzą przetrwalników

- nie ruchliwe

- mezofile

Pałeczki propionowe:

Propionibacterium:

-P. freudenreichii ssp. Szermorii???///

-P. toenii

-P. audipropionici

-P. fenseni

9. Metabolity BFM i fermentacji propionowej

Fermentacja mlekowa

4 CH₃CHOHCOOH - kw. Mlekowy

2 CH₃CHOHCOOH + 2 C₂H₅OH + 2CO₂

C₁₂H₂₂O₁₁ 2 CH₃CHOHCOOH + 2 CH ₃COOH +2CO₂

2 CH₃CHOHCOOH + 2 CH₃COOH

Kwas mlekowy CH₃CHOHCOOH

Wpływa na:

- tworzenie i zwięzłość skrzepu mleka

- konsystencję (zaw. H₂O, elastyczność)

- smak

- obniżenia pH - hamowanie rozwoju bakterii szkodliwych

- stymuluje aktywność proteolityczna podpuszczki

- stymuluje rozwuj Penicillium ssp.

- rozwój bakterii propionowych (substrat)

CO₂ - kształtowanie os….. struktury sera

Etanol kw. Octowy - wpływ na smak i aromat serów, właściwości antybakteryjne

FERMENTACJA PROPIONOWA

_{kw. propionowy kw. octowy}

C₆H₁₂O₆ CH₃CH₂COOH + CH₃COOH + CO₂

Smak słodki działanie tworzenie

orzechowy konserwujące oczek

10 . PRODUKCJA DEKSTRANU

Dekstran- polisacharyd pochodzenia mikrobiologicznego. Produkowany przez BFM: Leuconostoc mesenteroides ssp. Dekstranicum. Używany jako środek zastępujący plazmę krwi. Zapewniającego utrzymanie jej objętości i ciśnienia w krwioobiegu. W przypadku jej ubytku .

Proces biosyntezy mikrobiologicznej ( metoda klasyczna)

-polega na badaniu wyselekcjonowanego szczepu Leconostoc mesenteroides

- podłoże zewnętrzne 10-12% sacharozy ( źródło C i energii)

- z sacharozy jest uwalniana fruktoza - wykorzystywana przez komórki bakteryjne

- w podłożu muszą być źródła witamin i aminokwasów np. : autoilzaty drożdżowe i ekstrakty drożdżowe, ekstrakty zarodków zbożowych, hydrolizat kazeiny (0,2 - 0,5%)

- podłoże musi zawierać składniki mineralne i niskocząsteczkowy dekstran (0,2- 1,0%)

- proces biosyntezy trwa 1-2 doby (24- 48 h)

- temperatura 23-25 stC !!!!

- obniżenie pH z początkowego 6,5 - 7,5 do 4,5- sygnał do przerwania procesu!!!

- optymalne pH 5,0 - 6,0

- w celu przedłużenia biosyntezy można regulować pH przez wprowadzanie do podłoża CaCO₃

- z przedłużeniem procesu wiąże się też obniżenie sacharozy

- wydajność procesu (24- 48 h) 80- 95%

- otrzymuje się dekstran rodzimy

Modyfikacja procesu w met. Klasycznej

I faza

- namnożenie komórek i synteza enzymu dekstranosacharozy

II faza - produkcja dekstranu

Optymalne warunki dla obu faz są różne, dlatego opracowano technologię, gdzie fazy te są oddzielnymi procesami technologicznymi

I faza- wzrost i synteza enzymu zachodzi w podłożu zaw. do 2% sacharozy, jest niezbędna jako induktor dekstranosacharozy. Źródłem C do namnażania biomasy mogą być też inne cukry, niskocząsteczkowe alkohole, alifatyczne, kw. organiczne lub aminokwasy

Stosuje się tu dawki wyższe niż w klasycznej metodzie

N- do 2%

P-do 0,2% - fosforan sodowy lub potasowy temp. 20 - 25 st C

pH optymalne 6,5 - 7,5 utrzymywane przez NaOH lub KOH

czas namnażania komórek ok. 24 h w tych warunkach aktywość dekstranosacharozy jest ok. 5- krotnie wyższa niż w klasycznej.

II faza- otrzymaną hodowlę wprowadza się w ilości 10% do roztworu sacharozy 10-20%.

Wysokie stężenie sacharozy sprzyja, wysokiej biosyntezie dekstranu. Optymalne pH 5,0- 5,5. Temperatura 25- 30 st C.

Dekstran- kilka- kilkaset milionów Da.

Sumaryczny czas procesu ulega w znacznym stopniu skróceniu.

METODA ENZYMATYCZNA OTRZYMYWANIA DEKSTRANU

- używanie wyselekcjonowanego enzymu: dekstranosacharazy

- otrzymywanie preparatu enzymatycznego: 1 dobowa hodowla szczepu prowadzonego w war. Faza I służącej do produkcji dekstranosacharazy

- po oddzieleniu biomasy- roztwór enzymu może być użyty bezpośrednio lub enzym wytrąca się etanolem w ilości 40% objętości hodowli liofilizuję i w takim stanie przechowywać do użycia.

Synteza enzymatyczna w roztworze sacharozy 10% - stężenie początkowe, a następnie dozuje się stęz. roztwór sacharozy w odstępach 2 h do sumarycznego stęż. Substratu 30%.

Enzym wprowadza się w ilości odpowiadającej takiej jednostce aktywności dekstranosacharozy, która w temp. 30 st.C katalizuje przemianę 1 mikromola sacharozy/min

Wartość ph 5,5 (korekta KOH)

Temperatura 25 st C

-1- 2% dodatek niskocząsteczkowego dekstranu

Wydajność > 90%

40- 100000 Da

Wytrącenie dekstranu (metanol, etanol) hydroliza do wymaganej masy cząsteczkowej. Otrzymanie na …. i C aktywnym

11. PRODUKCJA WIT Z GR B

Witamina B (ryboflawina) Plaśnie z rodzaju Ascomycetes i drożdże Saccharomyces

Produkcja- otrzymywanie ryboflawiny z hodowli wgłębnej w warunkach kontrolowanego napowietrzania.

Podłoże hodowlane:

-glukoza

-fruktoza

-sacharoze w ilości 20-30 g/l

Szczególnie dobra wydajność biosyntezy Wit.B2 uzyskuje się stosując ciekłe oleje roślinne. Jako źródło C i jako środek przeciwpianowy w przypadku zastosowania olejów roślinnych- najczęściej sojowy.

źródło C - oleje gł. roślinne

źródło N- aminokwasy, glicyna, asparagina, hydrolizaty białkowe

Niezbędny czynnik wzrostowy dla szczepów producenta: biotyna ( Wit H), inozytol, mikroelementy Co, Zn, Mo, Cu, Fe, Mn

W przemyśle: podłoża kompleksowe - zawierają wymieszane składniki a przygotowane są na bazie melasy lub wywaru gorzelniczego

Fermentacje 26 - 28 stC! - dodając do podłoża produkcyjnego 1% 24- 48h hodowli szczepu producenta wyższy dodatek hodowli powoduje nadmierny wzrost grzybni i obniża wydajność produktu

Produkcja ryboflawiny rozpoczyna się w 2 dobie procesu - pomarańczowa barwa podłoża . W podłozu zaw. oleje biosynteza rozpoczyna się wcześniej.

Fermentacja trwa 96 - 120h a wydajność 5g/l!! Po zakończeniu biosyntezy hodowlę neutralizuje się kwasem siarowym, zagęszcza w wyporze próżniowej. Odwadnia w suszarce bębnowej.

Wyodrębnianie B₂ prowdzi się stosując

- ekstrakcję

- adsorpcję na węglu aktywnym

- krystalizację

Następnie masę się tabletkuje.

PRODUKCJA WITAMINY B₁₂ (KOBALAMINA)

W chwili obecnej Wit. B₁₂ otrzymuje się gł. na drodze biosyntezy mikrobiologicznej. Drobnoustroje syntetyzujące B₁₂

-Propionibacterium - gł. producent

-Bacillus, Streptomyces - mniejsze ilości

Propionibacterium freudenreichii ssp. shermani, propionibacterium freudenreichii ssp. Freudenreichii

Cecha- beztlenowe warunki przez I okres 48- 72 h, a następnie przez 2-3 doby umiarkowane napowietrzanie hodowli

Tlen hamuje powstawanie kobalaminy, ale jest potrzebny podczas syntezy fragmentu nukleotydowego i jego wiązanie z kobalaminą

Żródło C- glukoza lub sacharoza (melasa)

Źródło N- ekstrakt drożdżowy, hydrolizat kazeiny, mąka sojowa, pepton, sole amonowe

Prekursor: jon kobaltu 3mg/l, met-thre

-proces prowadzi się w temp 28st C, czas trwania procesu 4-6 dób (96 - 144 h) po zakończeniu procesu hodowlę zakwasza się do pH 5,0 za pomocą H₂SO₄ w celu stabilizacji witaminy

Czysty preparat krystalicznej Wit. B₁₂ otrzymuje się ze stabilizowanej zawiesiny pohodowlanej na drodze wielokrotnej re ekstrakcji:

-Butanolem

- wodą

- benzyną

-fenolem

Oczyszczanie Wit B₁₂ prowadzi się na węglu aktywnym i krzemionce

Końcowy etap można też prowadzić na kolumnach chromatograficznych na tlenku glinu Al₂O₃

Prekursorami są : CO (2-5 mg/l)

-metionina

- treonina

12. Produkcja kwasu mlekowego

W produkcji biologicznego kw. mlekowego stosuje się Lactobacillus delbruecki ssp. delbruecki - wyselekcjonowane szczepy o znaczeniu przemysłowym o korzystnych cechach biologicznych.

Homofermentatywne BFM mają enzymy zdolne do fermentacji cukrów prostych i dwucukrów a nie form wielocukrów → dlatego ten surowiec przed ferm. musi być zhydrolizowany enz. lub kwasowo

Heterofermentatywne BFM są zdolne do fermentacji pentoz wytwarzając jako główne produkty kwas mlekowy i kwas octowy.

Najtańsze źródła cukru dla fermentacji mlekowej: serwatka, melasa, ługi posiarczynowe

Jednak ich stosowanie wymaga odpowiednich metod oczyszczania → dla uzyskania odpowieniej jakości kwasu mlekowego.

I etap to ożywienie kultur BFM jeśli były one w postaci liofilizatu lub uaktywnienie i namnożenie jeśli były one w podłożu płynnym. Przy namnażaniu stosunek hodowli do nowo przygotowanego podłoża 1:5 - 1:10

Podłoże przy namnożeniu jak najbardziej podobne do substratu fermentacyjnego.

Podłoże powinno być bogate w subst. odżywcze w celu zapewnienia prawidłowego namnożenia szczepu.

• W okresie normalnej produkcji gdy FM przebiega prawidłowo, bez zakażeń można kontynuować przeszczepianie z kadzi do kadzi fermentacyjnej.

• Wybór źródła C wpływa na zastosowanie odpowiedniego szczepu BFM.

• Surowiec może być pozbawiony substancji azotowych i wzrostowych np. przy zastosowaniu czystej sacharozy lub może być bogaty w te związki przy stosowaniu serwatki lub skrobi kukurydzianej. W zalezności od zastosowanego surowca węglowego pożywkę melasy uzupełniać w zw. azotowe

• Temperatura fermentacji zależy od zastosowanego szczepu BFM np. Lb. Delbruecki ssp. Derbruecki - proces fermentacji w temp. ok 50 stopni C przy szczepach mezofilnych temp. procesu 30-35 stopni C

• Wytworzony kwas mlekowy musi być neutralizowany CaCO₃ lub Ca(OH)₂ do pH utrzymanego na poziomie 5,6 - 6,0

• Celem uniknięcia przekwaszenia lub przegrzania konieczne jest częste mieszanie roztworu fermentacyjnego

• W zależności od ... lub stężenia 0.5% cukru ferm. może być zakończona po 2-8 dniach

• Przy dobrze prowadzonym procesie wydajność 98%

Oczyszczanie kwasu mlekowego

Wybór metody oczyszczania zależy od rodzaju zastosowanego surowca do fermentacji

1. Przy zastosowaniu czystej sacharozy

Stosuje się metody bezpośredniego oczyszczania → kwas mlekowy jest czysty i odpowiedniej jakości

• Usunięcie Fe i Cu → traktowanie zatężonego roztworu kwasu mlekowego żelazocyjankiem sodu, potasu lub wapnia.

• Usunięcie związków barwnych → węglem aktywnym

• Dla poprawy smaku i zapachu → traktowanie H₂O₂

• Lotne składniki → wydmuchiwanie sprężonym powietrzem

2) Przy zastosowaniu nieoczyszczonych lub odpadowych produktów przemysłowych (melasa, serwatka)

• Krystalizacja mleczanu wapnia z zagęszczonego roztworu do zawartości ok 25% mleczanu, który był otrzymany poprzednio przez filtrację

• Schłodzenie mleczanu wapnia przez mieszanie powoduje wytrącenie się go w postaci drobnych granulek. Mleczan wapnia wytrącony oddziela się na porach. Oddzielony od ługu macierzystego mleczanu przetwarza się na kwas mlekowy rozkładając H₂SO_4, wytrącony osad gipsu oddziela się na filtrach i otrzymany kwas mlekowy zagęszcza i oczyszcza do otrzymania czystego produktu.

• Ekstrakcja rozpuszczalnikami org. (eter etylowy) (po oddzieleniu warstwy eterowej odpędza się eter przez destylację a kwas mlekowy oczyszcza na C aktywnym)

• Metoda estryfikacji - przeprowadzenie CH₃CHOHCOOH w ester

• Destylacja:

- w próżni

- pod ciśnieniem atmosferycznym w obecności pary przegrzanej 240 - 230^o C

- przepuszczenie przez wodny roztwór kwasu pary przegrzanej w temp. 160^o C

- destylacja w temp. 40- 80^o C z użyciem strumienia powietrza 120 - 130^o C

13. Produkcja kwasu propionowego

Propionibacterium acidipropionici

Surowce: melasa, mleczan, (glukoza, sacharoza, laktoza, pentozy, glicerol)

Temperatura procesu: 30^o C

Otrzymuje się mieszaninę kwasu propionowego i octowego. Po rozdzieleniu otrzymujemy czysty kwas propionowy. Kwas stosowany jest jako konserwant, hamuje rozwój pleśni i drożdzy.

Bakterie propionowe często wchodzą w skład szczepionek do produkcji soków fermentowanych i sałatek.

Są bardziej beztlenowe niż BFM i tolerują niskie stężenie tlenu.

14. Metabolizm i fizjologia drożdży

• wykształcenie jądra kom. oddzielonego cytoplazmą

• komórki drożdży nie mają chloroplastów → nie prowadzą fotosyntezy → należą do chemoorganotrofów

• wyróżniamy wśród drożdży saprofity i pasożyty

• rozmnażają się generatywnie a niektóre wegetatywnie - Deuteromycetes i Ascomycetes

• cechy morfologiczne:

- kształt (okrągły, elipsoidalny)

- sposób rozmnażania wegetatywnego

- cechy hodowlane (kształt kolonii, wielkość)

- tworzenie barwników

- tworzenie pseudogrzybni

- tworzenie grzybni właściwej

- szybkość kiełkowania w surowicy krwi

• cechy biochemiczne:

- tworzenie ureazy (rozkład mocznika)

- uzdolnienie do asymilacji i fermentacji różnych źródeł C

- uzdolnienie do asymilacji azotanów (V) i (III)

- bada się budowę ściany kom. (zawartość chityny, mannitolu, glukaronu)

- budowa DNA jądrowego przedstawione jako % molowy G i C w stosunku do całkowitego DNA

Metabolizm drożdży: przebieg i regulacja ogółu reakcji enzymatycznych zachodzących w obrębie komórki

• zdolność do wzrostu i rozmnażania się w warunkach tlenowych i beztlenowych

• drożdże fermentujące w zależności od warunków środowiska (dostępność C, obecność O₂) mogą prowadzić metabolizm tlenowy lub beztlenowy

Ścisłe oddzielenie metabolizmu w czasie przemian tlenowych, beztlenowych jest niemożliwe, dlatego, że fermentacja węglowodanów jest prowadzona w czasie wzrostu komórek przy ograniczonym dostępie O₂

Fermentacja stanowi szereg reakcji enzymatycznych prowadzonych do przemiany cukrów → C₂H₅OH + CO₂ oraz wytworzenia energii niezbędnej do produkcji biomasy oraz jako donory i akceptory atomów H⁺ i e^-

Większość drożdży zdolnych jest do fermentacji: glukozy, galaktozy, fruktozy, mannozy.

15. Produkcja drożdży piekarskich (Saccharomyces cerevisiae)

• przemysłowa produkcja drożdży piekarskich: prowadzenie kilkuetapowej hodowli tlenowej ze zwiększeniem objętości pożywki hodowlanej w kolejnych stadiach,

• surowiec: Melasa (trzcinowa lub buraczana)

• buraczana melasa jest częściej wykorzystywana pomimo tego, że jest uboższa w zw. azotowe i nie zawiera biotyny (niezbędnej do wzrostu drożdży piekarskich)

• choć melasa trzcinowa jest bogatsza w biotynę to zawiera też zw. barwne powodujące ciemnienie biomasy. Dodatkowe przemywanie mleczka drożdżowego hodowanego na tej melasie wydłuża czas procesu produkcji i zwiększa koszty.

• Sporządzanie pożywki:

- źródła N i P (fosforan amonu, woda amoniakalna)

- biotyna, kwas pantotenowy, inozytol, tiamina, pirydoksyna, niacyna

• wodę, melasę i powietrze powinny być pozbawione mikroflory powodującej zakłócenie w procesie produkcyjnym

W nowoczesnych drożdżowniach proces prod. obejmuje 3 etapy:

I faza - stosowany szczep hodowany na pożywce na bazie melasy

II faza - pierwsze namnażanie się drobnoustrojów

III faza - generacja handlowa

Namnożenie w warunkach laboratoryjnych jest prowadzone bez napowietrzania.

Generacja I, handlowa - stosuje się napowietrzanie przez filtry bakteriologiczne

Na etapie namnażania handlowego prowadzi się w kontrolowanych warunkach. Oprócz mieszadła i systemu napowietrzania fermentor ma układ czujników połączonych z pompami dozującymi pożywkę.

Ostatni etap namnażania jest prowadzony przez 12-18 h przy stęż. Cukru na poziomie 0,2

Po namnożeniu:

Odwirowanie

Przemycie woda

Zagęszczenie

Porcjowanie

Formowanie kostek

Pakowanie

Proces przebiega w temp. 30°C przy silnym napowietrzaniu i pH 4,5- 4,8

16) ŹRÓDŁA ZANIECZYSZCZEŃ DROŻDŻY PIEKARSKICH

1. Niewłaściwie wysterylizowana melasa.

2. Niesterylna woda.

3. Wprowadzenie zanieczyszczonych soli mineralnych.

4. Wprowadzenie niewyjałowionego powietrza do fermentatora.

5. Zły stan sanitarny pomieszczeń produkcyjnych, maszyn, urządzeń.

6. Niedostateczna higiena personelu.

W niektórych zakładach by zmniejszyć ryzyko zanieczyszczeń mleczko drożdżowe poddaje się każdorazowo kwaśnej kąpieli w roztworze kwasu ortofosforanowego, pH = 2,0/30 min.

• Niebezpiecznym źródłem zanieczyszczeń są wtórne infekcje pochodzące z nieusuniętych resztek osadu drożdżowego, z podłoża melasowego gdzie nastąpi rozwój drobnoustrojów. Tego rodzaju zanieczyszczenia ujawniają się w trudnodostępnych miejscach instalacji technologicznej.

• Źródłem zanieczyszczeń mogą być niewłaściwie przechowywane opakowania jednostkowe lub zbiorowe preferowane do wielokrotnego użytku.

17) PRZYKŁADY, CHARAKTERYSTYKA, IZOLACJA DROBNOUSTROJÓW ZANIECZYSZCZAJĄCYCH DROŻDŻE PIEKARSKIE

• Bakterie

• Drożdże

• Pleśnie

Drożdże dzikie: Candida mycoderma, Candida utyli, Candida tropicali , Hansenula, Pichia.

• Pochodzą głównie z powietrza, rzadziej z wody, urządzeń i maszyn.

s19

• Mają optymalne warunki rozwoju, ale są one niższe-wymagania odżywcze są niższe.

• Są prototrofami witaminowymi - niedobór witamin nie hamuje ich wzrostu.

• Mają krótki czas generacji.

W pierwszych etapach po zanieczyszczeniu drożdżami dzikimi następuje silne pienienie pożywki-> obniżenie parametrów wydajności, mała trwałość-> szybko dochodzi do autolizy.

Bakterie:

• Bacillus: subtilis i cereus -> ich enzymy powodują lizę komórek drożdży

• BFM: Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc -> silnie zakwaszają środowisko hamując wzrost komórek drożdży. Leuconostoc mesenteroides ssp destranium -> zanieczyszczają melasę bo szybko namnaża się w pożywce i tworzy egzopolisacharydy

• Proteus, Pseudomonas ->w czasie przechowywania mogą zachodzić procesy gnilne

• Bakterie chorobotwórcze z rodziny Enterobacteriaceae -> są oporne na niskie wartości pH

Pleśnie:

• Geotrichum,

• Aspergillus,

• Penicilium,

• Mucor.

Są zauważalne dopier podczas przechowywania.

s20

18) CHARAKTERYSTYKA DROŻDŻY BROWARNICZYCH

Drożdże piekarnicze górnej i dolnej fermentacji morfologicznie się nie różnią- przemysłowe rasy są starannie wyselekcjonowane

• Organizmy poliploidalne

• Nie wytwarzają przetrwalników

• Nie wykazują procesu płciowego

	Drożdże fermentacji górnej		Drożdże fermentacji dolnej
wielkość	7-9um	morfologia	7-9um
Tworzenie łańcuszków	tak		Nie (tylko komórki pączkujące)
Zdolność fermentacji rafinozy	33,3% (nie zawierają β-galaktozydazy)	fizjologia	100%
Sporulacja	48 godz		72 godz
?	40-75% lub więcej		nie
Cytochromy	4 pasma		2 pasma
Optymalna temp wzrostu	25°C		28°C
Fermentacja głównie	15-25°C gromadzą się na powierzchni brzeczki pod koniec fermentacji osadzają	Technologia fermentacyjna	5-10°C drożdże kłacz kujące i pyliste, kłacz kujące opadają na dno a pyliste po jakimś czasie opadają (pod koniec fermentacji)

S21

Drożdże fermentacji górnej i dolnej różnią się :

1. Zapotrzebowaniem na czynniki wzrostowe

2. Szybkością wzrostu

3. Zdolnością do flokulacji

4. Asymilacją związków azotowych

5. Rodzajem wytwarzanych produktów ubocznych

6. Opornością na wytwarzane metabolity

DROŻDŻE BROWARNICZE POWINNY SIĘ CHARAKTERYZOWAĆ:

1. Szybkość wzrostu i wydajność produkcji biomasy komórki zapewniający 3-krotny przyrost biomasy

2. Zdolność do prowadzenia szybkiej fermentacji cukrów brzeczki

3. Wysoka czystość mikrobiologiczna populacji

4. Dobra żywotność

5. Dobra stabilność cech morfologicznych w ciągu 12-16 generacji

6. Wytwarzanie odpowiednich związków smkowych i zapachowych warunkujących odpowiedni bukiet piwa

7. Uzdolnienie flokulacyjne

8. Właściwa szybkość osadzania się komórek ->wolniej podczas fermentacji szybciej w leżakowaniu

DROŻDŻE NASTAWNE

1. Kształt elipsoidalny

2. Wyrównane wymiary

3. Przewaga komórek pączkujących

4. 70-90% komórek zawiera glikogen

5. Liczba martwych komórek < 10%

6. Obecność mieszanej mikroflory obcej do 0,5%

19) ŹRÓDŁA ZANIECZYSZCZEŃ MIKROBIOLOGICZNYCH W BROWARNICTWIE

1. Drożdże zawracane z cyklu fermentacji

Dlatego, że obecna tu mikroflora jest już zaadaptowana do warunków fermentacji ( temperatura, obecności CO₂, pH, etanolu, związków wprowadzonych z chmielem).

Im wyższa liczba generacji tym większe prawdopodobieństwo zanieczyszczeń mikrobiologicznych.

2) wtórne skażenie powstałe podczas procesu technologicznego występujące podczas chłodzenia brzeczki z chmielem

3) proces fermentacji

4)przez filtr ??? rozlewni

5) zły stan higieniczny urządzeń i opakowań

6) niedostateczna higiena pracowników

20. WPŁYW NA JAKOŚĆ PIWA DROBNOUSTROJÓW WYSTĘPUJĄCYCH W SUROWCACH STOSOWANYCH W PROCESIE PRODUKCJI PIWA.

Drobnoustroje takich surowców jak chmielu, H2O i słodu nie powinny mieć praktycznego znaczenia, ponieważ przy właściwym zachowywaniu parametrów technologicznych mikroflora obecna w surowcach zostaje wyeliminowana na czas gotowania brzeczki z chmielem.

21. WADY PIWA POCHODZENIA MIKROBIOLOGICZNEGO

G (+)- BFM-

1. Lactobacillus, Pediococcus

• Powodują zmętnienie piwa, wady organoleptyczne (kwas mlekowy, diacetyl)

• Kwas mlekowy- kwaśny smak piwa

• Diacetyl- maślany smak

2. Pediococcus dextranicus- śluzowaty osad (egzopolisacharydy)

3. Pediococcus acidilactici

4. Pediococcus dammosies??- piwo gotowane, gęstwa drożdżowa

ROZWIJAJĄ SIĘ W GOTOWYM PRODUKCIE

1. Leuconostoc mesenteroides sp. dextranium- śluzowaty osad, zmętnienie piwa

2. Micrococcus, Staphylococcus- z wtórnych zanieczyszczeń

3. Bacillus stearothermophilus,

Geobacillus stearothermophilus,

Bacillus coagularis- tworzą nitozoaminy w obecności azotanów

Występuje w brzeczkach

G(-)

Hafnia- opóźnienie procesu fermentacji (występuje w gęstwie drożdżowej)

Citrobacter freundii- selerowy zapach (n-propanol, izo-butanol, diacetyl, zw. siarki)

Klebsiella- fenolowy posmak piwa powodują jego metabolity

Acetobacter i Glukonobacter- kwas octowy- kwaśny posmak, ostry zapach, zmętnienie, cienka błonka na powierzchni, wytwarzanie zw. hamujących rozwój drożdży

Zymomonas- wzrost poziomu zw. siarki i aldehydu octowego

DROŻDŻE:


Honsenula

Torulopsis

Pichia mętnienie piwa, drożdżowy posmak

Candida

PLEŚNIE:


Alternaria

Cladosporum

Fusarium pleśnienie

Aspergillus

Penicillum

22. CHARAKTERYSTYKA DROŻDŻY WINIARSKICH

1. - krótki okres adaptacji do środowiska moszczu i szybkie zafermentowanie

2. - intensywne fermentacje o prawidłowym przebiegu

3. - produkcja etanolu do wymaganego poziomu

4. - wytwarzanie produktów ubocznych fermentacji decyduje o prawidłowym smaku i zapachu

5. - mała wrażliwość na niskie pH środowiska fermentacyjnego i wysokie stężenie kwasów organicznych

6. - zdolność do flokulacji i szybkiego osadzania się po zakończeniu fermentacji- szybkie klonowanie …

7. - w zależności od rodzaju stosowanego surowca oraz gatunku wina stosowane drożdże powinny spełniać dodatkowe warunki:

1. Oporność na podwyższone stężenie etanolu- drożdże do produkcji win mocnych

2. Oporność na obecność zw. siarki- drożdże Sufitonie ??

3. Zdolność do cząsteczkowego metabolizowania kw. Jabłkowego- główne przyczyny nadmiernej kwasowości

4. Możliwość przeprowadzenia prawidłowej fermentacji w środowisku o podwyższonym stężeniu cukru- drożdże osmotolerancyjne

5. Oporność na wysokie ciśnienie CO2

6. Tolerancyjne na wysokie stężenie garbników

7. Kriofilne - pracują w niższych temp.

WYMAGANE SĄ ODPOWIEDNIE CECHY MORFOLOGICZNE:

1. - odpowiedni kształt

2. -wyrównana wielkość komórek

3. -niedużo glikogenu w kom

4. -niewielkie wodniczki w komórce

Liczba możliwych komórek nie więcej niż 5%

23. ŹRODŁA ZANIECZYSZCZEŃ MIKROBIOLOGICZNYCH W WINIARSTWIE

Obecność i rozwój drobnoustrojów zanieczyszczających w cyklu produkcyjnym wina może być wynikiem:

1. *zastosowanie moszczu o niewłaściwej czystości mikrobiologicznej

niewłaściwy przebieg procesu technologicznego- np. złe temp., nieodpowiednia kwasowość, moc nastawów, zbyt późny obciąg młodego wina

2. *infekcje w czasie dojrzewania

3. *infekcje podczas rozlewu

4. *infekcje w gotowym produkcie

24.PRZYKŁADY I CHARAKTERYSTYKA DROBNOUSTROJÓW ORAZ WADY WIN

Drobnoustroje tlenowe wprowadzone do moszczu rozwijają się najintensywniej w początkowej fazie fermentacji- uniemożliwiają rozwój drożdży szlachetnych- lub zahamowanie fermentacji!

W późniejszych etapach produkcji, przy wysyceniu środowiska CO2, ograniczonym dostępnie O2, sprzyjającym pH mogą się rozwijać BFM oraz bakterie mannitowo-mleczanowej

-Schizosaccharomyces pombe-

rozkład kw. Jabłkowego- etanol +CO2. Odtwarzanie nawet do 80% moszczu

-Candida, Pichie, Hansenula-

• Kożuch na powierzchni moszczu lub wina, tworzy kwiat winny

• Utleniają etanol- kw. Octowy +ester etylenowy

• Nadają winu zjełczały smak. Współdziałając z pleśniami przy wzroście temp mogą być przyczyną- śluzowacenie win i drożdżowego posmaku

-Pichie- biorą udział w przemianach siarki w wyniku czego tworzą się merkaptany- ostry zapach

-Acetobacter- w warunkach o spadku zawartości etanolu, przy dost. Ilości O2 przekształcają etanol- kw octowy, dochodzi do zaoctowania wina, smak ostry i kwaśny, błonka na powierzchni (A. aceti)

-Leuconostoc- tworzenie śluzu w winach słodkich

-Lactobacillus buchneri, Lactobcillus fermentum-

-przechodzą fermentacje cukru z wytworzeniem kw mlekowego, octowego, mannitolu?? -ostry zapach, drapiący posmak wina

-Aspergillus-produkcja mykotoksyn w winie

-Botnitis- w winach gronowych specyficzny aromat i smak. Są zanieczyszczeniami gdy występują na jabłkach

25. PLEŚNIE - METABOLIZM I FIZJOLOGIA

• Grzyby wielokomórkowe

• Chemoorganotrofy: pasożyty, saprofity

• Metabolizm tlenowy

• Zazwyczaj mezofile (20-35 ^oC temp. optymalna), występują też psychofilne, …. i termofilne

• Optymalne pH: 3,0-5,5 (zakres 1,5-10)

• Minimalna zawartośc wody w pożywce: 11-14%

• Rozmnażanie bezpłciowe:

- za pośrednictwem zarodników tworzonych na grzybni powietrznej (na ….. )

- za pomocą zarodników tworzonych w zarodnikach na strzępkach powietrznych (w sporangioforach)

• Rozmnażanie płciowe

- za pomocą gamet

26. PLEŚNIE I ICH METABOLITYSTOSOWANE W PRZEMYŚLE

1. Produkcja antybiotyków

• Penicylina (Penicilium nonatum…., Penicilium chrysogenum…..

• Cyklosporyna A (Trichoderma polysporum)

• Produkcja enzymów

• α-amylaza, glukoamylaza, pektynaza, celulozy, proteazy, lipazy, katalaza (Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus, Trichoderma)

• Produkcja kwasów organicznych

• Kwas cytrynowy (Aspergillus niger)

• Kwas itakonowy (Aspergillus itaconicus, Aspergillus terreus)

• Kwas mlekowy (Rhizopus oryzae)

• Produkcja stymulatorów wzrostu roślin

• Gibereliny (Giberelle fujikuroi)

• Produkcja lipidów

• Kwas γ-linoleinowy (Mucor favanienes, Mucor rauxii)

• Produkcja chityny i chitozanu (Aspergillus giganteus)

• Produkcja serów pleśniowych (Penicillium rogueforti, Penicillium camembertii, Penicillium candidum …, Penicillium glaucum …)

27. CHARAKTERYSTYKA PLEŚNI STOSOWANYCH DO PRODUKCJI KWASU CYTRYNOWEGO

Aspergillus niger :

• wytwarzają konidie… o zabarwieniu brunatno - czarnym lub purpurowo - brunatnym lub prawie czarnym

• kolonie szybko narastają

• grzybnia początkowo jest biała, później żółta aż do brunatno-czarnej

• konidie… na początku gładkie, później o szorstkiej powierzchni

• wykazują metabolizm tlenowy

• rozmnażanie wegetatywne przez konidie

• należy do Deuteromycetes

• należące do tej grupy grzyby są wykorzystywane do wytwarzania kwasu cytrynowego, do produkcji enzymatycznych preparatów: amylolitycznych, proteolitycznych, pektolitycznych; mogą rozkładac taninę, wytwarzac kwas galusowy

28. PRODUKCJA KWASU CYTRYNOWEGO METODĄ WGŁĘBNĄ.

• Wgłębna metoda biosyntezy kwasu cytrynowego jest prowadzona w bioreaktorach:

• z mieszaniem i napowietrzaniem V=50+500 m³

• typu air-lift V=100+500 m³

• Stosuje się surowce o wyższym stopniu czystości niż w metodzie powierzchniowej

• cukier handlowy (sacharoza)

• soki cukrownicze

• mączki cukrowe

• hydrolizaty skrobiowe

• Rzadziej stosuje się melasę buraczaną, ponieważ nie zapewnia odpowiedniej wydajności produkcji C₆H₅O₇

• W przypadku stosowania pożywki numeralnej:

• Węgiel: 100 - 150 g/dm³

• Sole mineralne: (NH₄)₂SO₄ - 2,0 g/dm³

• MgSO₄ x 7H₂O - 0,2 g/dm³

• KH₂PO₄ - 0,2 g/dm³

• pH regulowane jest do 2,5-3,0

• W zależności od specyficzności szczepu Aspergillus niger pożywkę szczepi się

• zawiesiną konidiów…. 10⁵ - 10⁶/cm³ po 6-8 h inkubacji

• zawiesiną grzybni inokulacyjnej po 24-36 h hodowli

• Inokulum stanowi 10% w stusunku do objętości pożywki

• W metodzie - hodowli wgłębnej w wyniku ciągłego mieszania grzybnia rozwija się w całej objętości pożywki (podłoża)

• Fermentacja przebiega dwuetapowo

I - 48-72h - intensywny wzrost grzybni do wyczerpania źródeł azotu w pożywce

II - faza produkcji kwasu cytrynowego - do momentu wyczerpania żródła węgla, czas 120-168h, temp. 30-32^oC

• intensywnośc napowietrzania jałowym powietrzem w ilości 0,1-0,4 V/Vxmin.

• Zakończenie fermentacji, gdy zawartośc cukru = 0%

• Wydajnośc procesu od 75-90% w zależności od źródła cukru

29. PRODUKCJA KWASU CYTRYNOWEGO METODĄ POWIERZCHNIOWĄ

• W metodzie powierzchnowej w warunkach… statycznych grzybnia rozwija?! się na powierzchni pożywki tworząc zwartą…. plechę złożoną z mocno rozgałęzionych strzępek

• Dwufazowośc otrzymywania C₆H₅O₇

I faza - 72h hodowli - intensywny rozwój grzybni - trofoaza

II faza - produkcja C₆H₅O₇ - idiofaza

• W hodowli powierzchniowej obie fazy przebiegają w systemie jednostopniowym

• Surowcem do otrzymywania kwasu cytrynowego jest melasa buraczana, jest ona … do zew. Sacharozy 16% i uzupełnia…. solami mineralnymi

KH₂PO₄ - 0,008%

ZnSO₄ x 7H₂O - 0,0008%

K₄Fe(CN)₆ - 0,08%

• Korekta pH= 6,4-6,8

Strona 29

• Sterylną pożywkę rozlewa się do tac (200 cm dłg x 250 cm szer x 16 cm wys) -> 800 dm3

• Tace są zamontowane na stojakach umieszczonych w komorach z regulacją temp i napowietrzenia.

• Gdy temp pozywki ok. 35-40 C, szczepi się konidiami pleśni 75mg/m2.

• intensywnosc napowietrzenie z począt. 5m3 powietrza /h/m2 wzrasta do 15 m3/h/m2

• Fermentacje przerywa się gdy zawartość cukru w pozywce 0,5% a zawartość C₆H₅O₇ = 15-20%

• Czas trwania procesu 168-216 godzin

• Temp 25-30C

• Wydajność 70-80%

• Oprócz C₆H₅O₇ jest wydzielany: kwas mlekowy, kwas glukonowy, śladoweilości kwasu z cyklu Krebsa

30. Surowce stosowane do Produkcji Kwasu Cytrynowego

Zastosowany surowiec do produkcji kwasu cytrynowego zależy od stosowanej metody:

• SSF - Solid State Fermentation - Metoda na pożywkach stałych

SUROWIEC: Otręby, wytłoki z trzciny cukrowej (wilgotnośc nie mniejsza niż 40%), melasa buraczana czy trzcinowa, inne odpadowe surowce roślinne

• LFS - Liquid Surface Fermenentation - powierzchninowa na pożywce płynnej

SUROWIEC: Melasa buraczana

zaw. sacharozy 16 %

uzupełnione solami mineralnymi:

KH₂PO₄ - 0,008%

ZnSO₄ x 7H₂O - 0,0008%

K₄Fe(CN)₆ - 0,08%

Korekte pH pożywki do pH 6,4 - 6,8

Strona 30

• SmF - Submerged Fermentation - wgłebne

SUROWCE: stostuje się o wyższym stopniiu czystości niż w metodzie powierzchniowej:

- cukier handlowy (sacharoza)

- soki cukiericze

- mączki sukrowe

- hydrolizaty skrobiowe

W przypadku stosowania pożywki mineralnej gdzie żródłem C jest sacharoza wydajność biosyntezy kwasu cytrynowego >80%

Skład pożywki mineralnej:

- 100-150 g/dm3 - węgiel

- Sole mineralne: - (NH₄)₂SO₄ - 2,0 g/dm³

- MgSO₄ x 7H₂O - 0,2 g/dm³

- KH₂PO₄ - 0,2 g/dm³

pH regulowane do wartości 2,5 - 3,0

31. Zanieczyszczenia mikrobilogiczne surowców stosowanych w produkcji kwasu cytrynowego

Źródłem zanieczyszczeń mikrobilogicznych w powierzchniowej metodzie otrzymywania kwasu cytrynowego jest melasa buraczana. W surowcu tym są:

- Bacillus, Pseudosomonas, E.Coli

- Enterobacter aerogenes

Odpowiadają one za redukcje azotanów, które hamują rozwój grzybni.

Źródłem tych ostatnich może być H₂O stosowana w procesie technologicznym. Jeżeli nie spełnia

wymagań określonych normą.

W podłożu melasowym po niewłaściwie przeprowadzonej sterylizacji mogą pozostać żywe bakterie:

Lactobacillus, leuconostoc - antagonistyczny wpływ na rozwój grzybni A.niger.

Pleśnie: Penicillium purpurogenum

Penicillium rubrum

Komórki tych pleśni dostają się z powietrzem stosowanym do przewietrzania komór

Pleśnie te są pogate w enzymy hydrolityczne -> powodują lizę grzybni A.niger.

strona 31

32. Zastosowanie pleśni w produkcji enzymów

Alfa-amylaza	Aspergillus oryzae Aspergillus amamon Aspergillus niger Rhizopus oryzae	Otrzymywanie syropów glukanowych, cukiernictwo, gorzelnictwo, przetwórstwo zbożowe
Glukoamylaza	Rhizopus nireus Aspergillus amamon Aspergillus niger	j.w
Pektynazy	Aspergillus niger Rhizopus sp.	Klarowanie soków owocowych, winiarstwo, przemysł owocowy,
Celulazy	Aspergillus niger Aspergillus nidulans	Przetwórstwo owoców Przemysł Przemysł papierniczy
Proteinazy	Penicillium roqueforti Aspergillus oryzae ?!?!?! sp.	serowarstwo (dojrzewanie serów), przemysł mięsny (poprawianie kruchości tkanek)
Lipazy	Aspergillus niger Rhizopus sp ?!?!?! sp.	Dojrzewanie serów Chemie gospodarcze
Oksydaza glukozowa	Aspergillus niger Penicillium sp.	Przemysł spożywczy Przemysł farmaceutyczny Analityka biochemiczna

33. Proces biosyntezy prowadzi się w bioreaktorach z mieszadłem mechanicznym, bełkotką (?!), układem regulującym temperature, natlenianie podłoże, dozowanie pożywki i prekursorów.

Bioreaktory o pojemności 150-200 m³. Wypełnienie nie przekracza 80% ze względu na zjawisko pienienia hodowli.

Proces biosyntezy przebiega w FAZACH:

1 FAZA WZROSTU GRZYBNI

• 36-40h

• Szybka asymilacja składników podłoża

• Intensywne oddychanie komórek

• Początkowe namnażanie komórek- korzystna temp.27st.C,potem obniża się ją do 24-25st.C

FAZA PRZEJŚCIOWA-po wyczerpaniu się zasadniczej ilości łatwo przyswajalnych składników, zwłaszcza glukozy, w fazie tej następuje ograniczenie wzrostu grzybni i dyspersja syntezy enzymów szlaku biosyntezy penicyliny

2 FAZA PRODUKCJI (BIOFAZA)

• Zredukowana szybkość wzrostu biomasy i intensywna synteza penicyliny

• Konieczność utrzymania szybkości wzrostu biomasy na określonym poziomie

• Powolny wzrost grzybni pozostaje w ścisłej korelacji z asymilacją wolno przyswajalnej laktozy

• W nowszych technologiach zamiast laktozy stosuje się zasilanie hodowli w czasie produkcji roztworem glukozy, utrzymując szybkość zasilania poniżej 1,5g / l x h i zmniejszając ją w miarę przebiegu procesu biosyntezy

• Optymalna temperatura 24 - 25 st. C

• Intensywne napowietrzanie przez cały czas procesu 0,5 - 1 m3 powietrza/m3 podłoża/1 min.

• Utrzymując stopień natlenienia hodowli powyżej 30% stanu nasycenia

34. PAŁECZKI Z RODZAJU ACETOBACTER SP. - MORFOLOGIA, FIZJOLOGIA, METABOLIZM

• Pałeczki o wymiarach 0,6 - 0,8 x 1 - 4 um,

• Urzęsione peritrichalnie

• W niesprzyjających warunkach tworzą formy inwolucyjne

• W pożywkach z etanolem lub sacharydami rosną w postaci charakterystycznej blonki suchej i pomarszczonej (Acetobacter pasteurianus) lub pajęczynowatej lub grubszej, gładkiej z tendencja do wspinania się po ściankach naczynia (Acetobacter aceti, A. hansenii) mogą tez tworzyć cienki śluzowaty nalot (A. liguefanens)

• Pałeczki gram -

• Należą do rodzin Pseudomonadaceae

• Do wzrostu wymagają złożonych i bogatych pożywek zawierających związki organiczne i mineralne

• Na podłożach agarowych rosną w postaci bezbarwnych koloni przypominających spłaszczone krople wody lub gliceryny

• Katalazo +

• Metabolizm oksydacyjny, wytwarzają kwas octowy na drodze niecałkowitego utlenienia etanolu

• Oprócz etanolu mogą wykorzystywać do produkcji kw. Octowego proste alkohole (n - propanol, n - butanol), sacharydy (glukoza, fruktoza i inne) oraz ich pochodne np. mannitol

• Metabolizują heksozy przez cykl pentozowy lub w glukoneogenezie

• Brak fosfofruktokinazy - nie zdolne do przemian w szlaku EMP

• Dysponują kompleksem enzymów Cyklu Krebsa (utlenianie kwasu octowego) - NADOSYDACJI

• Preferują środowiska bogate w alkohol, powodują szybkie zainfekowanie i zaoctowanie produktów przemysłu browarniczego, winiarskiego i owocowego

35. NATURALNE ŚRODOWISKA WYSTEPOWANIA PAŁECZEK KWASU OCTOWEGO

• Napoje alkoholowe

• Soki

• Owoce

36. CHARAKTERYSTYKA SUROWCOW STOSOWANYCH W PRODUKCJI KWASU OCTOWEGO

1. surowce będące źródłem etanolu np. spirytusy różnego pochodzenia, wino, piwo, przefermentowany sok owocowy.

Substraty węglowodorowe: słód, zboże, ziemniaki, trzcina, buraki cukrowe, melasa

Substraty zawierające etanol mogą być poddane bezpośrednio fermentacji octowej, surowce węglowodorowe wymagają uprzedniego przefermentowania do etanolu

2. składniki podłoża niezbędne do wzrostu bakterii octowych: cukier, azot, fosfor, potas, magnez, mikroelementy, biostymulatory

3. woda i powietrze

37. PARAMETRY PRODUKCJI KWASU OCTOWEGO

Temperatura w zależności od stosowanej metody

Orleańska temperatura 25 - 28st. C

Generatorowa temp. I warstwa - 28 - 30 st. C górna warstwa

II warstwa - 32 - 34 st. C środkowa warstwa

III warstwa - 34 - 36 st. C dolna warstwa

Wgłębna temp. 30 st. C

Napowietrzanie w generatorowej 0,8 - 0,9 m3/h/m3

pH 5,4 - 6,2

• PRODUKCJA KWASU OCTOWEGO METODĄ POWIERZCHNIOWĄ

• Najstarsza metoda wytwarzania kwasu octowego - nadal choć rzadko stosowana we Francji gdzie została opracowana

• Polega na samorzutnym zafermentowaniu wina umieszczonego w otwartych zbiornikach o dużej powierzchni między fazami gaz - ciecz

• Rozwijające się na powierzchni pożywki pałeczki Acetobacter aceti tworzą błonkę utrudniającą wymianę gazowa

• Efektywność metody nie jest duża gdyż zależy od wielkości swobodnej powierzchni cieczy, która powoduje natlenienie środowiska

• Do produkcji kwasu octowego na duża skale stosuje się beczki o V = 230 dm3, są one zaopatrzone w otwory wentylacyjne, których zadaniem jest napowietrzanie

• Beczki SA wypełniane w 70l zaoctowanym winem (wino + bakterie), następuje rozwój bakterii

• Co tydzień odbiera się produkowany kwas octowy i uzupełnia nowa porcja wina

• Metoda ta pozwala na otrzymanie octu o charakterystycznym zapachu

• Stężenie kwasu octowego wynosi max 8%

• Temperatura prowadzenia procesu 25 - 28 st.C, obniżenie temp. powoduje spowolnienie tema procesu, może doprowadzić do jego zahamowania, powoduje powstanie form inwolucyjnych Acetobacter aceti. Formy te obniżają syntezę kwasu octowego

39. PRODUKCJA KWASU OCTOWEGO METODA OCIEKOWĄ

• Stosuje się do produkcji kwasu octowego na duża skale w octowniach

• Polega na unieruchomieniu bakterii kwasu octowego (A. aceti) na porowatym materiale wypełniającym zbiornik roboczy

• Materiał stanowiący wypełnienie powinien charakteryzować się dużą powierzchnia, być lekki, mieć dużą zdolność pochłaniania cieczy (np. koks, pumeks, kolby kukurydzy, wióry bukowe)

• Od góry podaje się zaoctowanie wino lub etanol

• Spływając poprzez pietra w odcieku otrzymujemy kwas octowy

• Temp. 32 - 34 st.C

• Otrzymuje się ocet o stężeniu 9 - 15%

• Wyciek jest filtrowany ponieważ może zawierać elementy stale oraz komórki bakterii

Wśród metod ociekowych wyróżniamy

1. metodę stojakową - rzadko stosowana, przestarzałą, trudna do kontroli, mało efektywna, wydajność około 60% wydajności teoretycznej

2. metodę generatorową

- polega na porcjowanym wprowadzeniu zacieru do aparatu tj. 50, 25% całkowitej objętości zacieru przygotowanego do jednej szarży

- materiał nośny jest umieszczany w tzw. generatorach

- korpus generatora w kształcie ściętego stożka, najczęściej wykonany ze stali kwaso - odpornej

- wewnątrz kadzi generatora na wysokości około trze metrów od dołu usytuowany jest drewniany ruszt

- przestrzeń pod rusztem służy do odbioru i gromadzenia surowego produktu - tzw. Część robocza generatora

- w technologii octowania pożywkę hodowlaną określa się mianem zacieru lub brzeczki składającej się z 10 - 14% alkoholu etylowego i 1 -3 % kwasu octowego oraz stymulatorami wzrostu bakterii octowych, jak ekstrakt słodowy, ekstrakt drożdżowy, glukoza, sole mineralne, związki azotu i fosforu

- pierwszą porcje zacieru około 50 % całkowitej objętości miesza się z częścią surowego produktu z poprzedniej szarży pozostawiając celowo w zbiorniku generatora

- uzyskuje się wtedy stężenie etanolu około 4%, po kilku dniach, gdy część etanolu zostanie utleniona, dodaje się kolejna porcje zacieru. Następnie po kilku dniach gdy stężenie etanolu w zacierze jest niższe od 3 % dozuje się ostatnia trzecia część zacieru

- zacier przepływa wielokrotnie przez generator, dzięki zwracaniu płynu ze zbiornika generatora. Zacier spływając po wypełnieniu jest w kontakcie z tłoczonym od dołu powietrzem 0,8 - 0,9 m3/h/m3

- proces prowadzi się do momentu obniżenia się zawartości alkoholu w zacierze około 0,3%

- temperatura w generatorze utrzymuje się na poziomie 28 - 30 st.C w górnej warstwie, 32 - 34 st.C w środkowej, 34 - 36 st. C w dolnej

- kontrola temp. Jest zautomatyzowana. W przypadku przekroczenia temperatury regulacja odbywa się poprzez zwiększenie szybkości cyrkulacji zacieru. Natomiast w przypadku obniżenia się temperatury szybkość cyrkulacji zacieru należy spowolnić

- surowy ocet o stężeniu 9 - 15% odbierany jest w dolnej części zbiornika, następnie filtrowany w celu usunięcia garbników wypłukanych z wiórów bukowych oraz nielicznych bakterii

- taki ocet jest rozcieńczony do stężenia 6% lub 10%

40. PRODUKCJA KWASU OCTOWEGO METODA WGLĘBNA

• jej zalety: krótszy czas produkcji, wysoka efektywność procesu w stosunku do wydajności teoretycznej 90 - 98%, stężenie octu około 15%

• jej wada jest nadmierna biomasa bakterii octowych - musi być usunięta przez filtracje

• w metodzie wgłębnej wykorzystuje się fermentatory ze stali nierdzewnej, ich średnica 2 m, wysokość 4m , pojemność 16000 l

• proces otrzymywania kwasu octowego jest procesem okresowym, jeden cykl produkcji trwa 40 - 48 h

• skład zacieru (podłoża):etanol i kwas octowy 10 : 1

• w celu szybkiego namnożenia Acetobacter do zacieru dodaje się stymulatory wzrostu: glukozę, siarczan potasu lub magnezu, źródło azotu - ekstrakt drożdżowy

• następnie zacier szczepi się bakteriami Acetobacter, SA to wyselekcjonowane szczepy w kierunku wzrostu w hodowli wgłębnej

• napowietrzanie zacieru z bakteriami

• max stężenie kwasu octowego 10 - 15%

• kwas octowy poddaje się zaperzeniu w celu koncentracji gotowego produktu i obniżenia kosztów transportu

• zaperzenie może się odbywać przez destylacje frakcjonowaną otrzymujemy wtedy 20% kwas z 10% kwasu octowego

Metodami biologicznymi otrzymuje się wyłącznie ocet spożywczy.

---