5. Enzymy

Wiadomości wstępne

Podstawy katalizy enzymatycznej

Enzymami nazywamy białka o specyficznych właściwościach katality­cznych, tj. przyspieszających przebieg reakcji chemicznych w komórce. Przy­spieszanie reakcji następuje w wyniku obniżania przez enzym wielkości tzw. energii aktywacji, czyli energii, jaką muszą dysponować cząsteczki związków, aby mogły z sobą reagować. Obni­żenie ener­gii aktywacji powoduje bowiem, że większy procent cząsteczek posiada wystarczająco dużą energię kinetyczną i dzięki temu może wziąć udział w reakcji, przez co reakcja ta przebiega wielokro­tnie szybciej (Rys. 5.1) . Enzymy nie mogą natomiast zmieniać kierunku reakcji, a więc przyspieszają przebieg reakcji tylko wówczas, gdy prowadzi ona w kie­runku stanu równowagi.

Rys. 5.1. Udział enzymu w obniżeniu energii aktywacji cząsteczek substratu w reakcji chemicznej

Budowa enzymu i jego działanie

Część enzymu odpowiedzialną za przyłączanie substratu oraz prowadzenie katalizy nazywamy centrum katalitycznym (aktywnym). Centrum katalityczne enzymu może być zbudowane wyłącznie z reszt aminokwasowych, lub też może je tworzyć część niebiałkowa, stanowiąca tzw. grupę prostetyczną lub koenzym. W tym drugim przypadku część białkowa cząsteczki enzymu nazywa się apoenzymem. Grupa prostetyczna jest trwale związana z apoenzymem, natomiast koenzym może funkcjonować samodzielnie. Rolą koenzymu jest przenoszenie jakiejś grupy związków, atomów lub elektronów. Zarówno koenzym jak i grupa prostetyczna czy jony metali łączące się chelatowo z atomami apoenzymu nazywane są kofaktorami. Rys. 5.2. przedstawia strukturę peroksydazy z jonem żelaza w centrum jako kofaktorem. Enzymy wykazują silną specyficzność w stosunku do substratu, stąd też czasem porównuje się pasowanie enzymu do substratu jak klucza do zamka.

Rys. 5.2. Struktura peroksydazy z atomem żelaza w centrum katalitycznym jako kofaktorem

Cząsteczka enzymu wchodzi w reakcję z cząsteczką substratu. Zmienia się przy tym zarówno struktura enzymu, jak i substratu. Dzięki zmianie struktury substrat może ulec reakcji chemicznej, natomiast zmiana struktury enzymu jakiej weszła do niej. Reakcję katalizowaną enzymatycznie można zatem przedstawić następującym schematem:

E + S → ES → E + P

gdzie: E - enzym, S - substrat, ES - kompleks enzym-substrat, P - produkt

Teoria aktywnego kom­pl­eksu zakłada, że reakcja katalizo­wana enzymatycznie zachodzi poprzez wytworzenie kompleksu pomiędzy centrum katalitycznym a cząsteczką subs­tra­tu. Wytworzenie tego kompleksu jest ko­niecznym warunkiem zajścia reakcji enzymatycz­nej. Efektowność własności katalitycznych określonego enzymu definiuje tzw. „liczbę obrotów”, czyli liczba pełnych cykli jednostkowej reakcji (wytworzenie kom­pleksu ES, reakcja chemiczna przeprowadzona na cząsteczce substratu i rozpad kompleksu enzym - produkt) w czasie jednej se­kundy. Jeśli wszystkie cząsteczki enzymu występują w formie komplek­su z substratem, wówczas stan ten określamy jako maksy­malną szybkość pro­cesu enzymatycznego (V_max).

Inhibicja

Jeśli cząsteczka nie będąca substratem ma budowę dostatecznie podobną do naturalnego sub­stratu, staje się zdolna do wytworzenia kompleksu z enzy­mem, chociaż nie jest mo­żliwe zajście procesu enzymatyczne­go. W takiej sytuacji powstały kompleks nie może się rozpaść i dana cząsteczka enzy­mu pozostaje zablo­kowana. O substancji ma­jącej opisane właściwości mówimy, że jest inhi­bitorem kompetycyjnym, czyli konkurującym z naturalnym sub­stratem o centrum katalityczne en­zymu na zasadzie podobieństwa struk­turalnego. Inhibicja kompetycyjna jest odwracalna, ponieważ w obecności nadmiaru substratu inhibitor może zostać wyparty przez substrat z kompleksu. W przy­pa­dku, gdy substan­cja wiąże się z centrum katalitycz­nym, chociaż nie wykazu­je strukturalnego podobień­stwa do substratu, mówimy o niekom­pety­cyjnym hamowaniu enzymu. Inhibicja niekompetycyjna jest nieodwracalna, ponieważ tego rodzaju inhibitor zmienia strukturalnie centrum katalityczne.

Enzymy allosterycznezny

Niektóre enzymy, oprócz centrum katality­czne­go, posiadają rów­nież specyficzny fragment cząs­teczki, któ­rego stan de­cyduje o aktywnoś­ci cen­trum katalitycznego, mimo iż prze­strzennie mogą być znacznie od siebie oddalone. Jest to tzw. al­loste­ryczne cen­trum regulatorowe, a sub­stan­cje, które poprzez to cen­trum wpływają na ak­tywność enzymu, na­zywają się inhibitorami lub akty­wato­rami al­lostery­cznymi (Rys. 5.3).

Rys. 5.3. Wpływ aktywatora i inhibitora na przebieg reakcji z udziałem enzymu allosterycznego

Klasy enzymów

Stosownie do rodzaju katalizowanej reakcji rozróżniane są następujące klasy enzymów:

1) oksydoreduktazy - katalizujące reakcje utleniania i redukcji,

2) transferazy - katalizujące reakcje przenoszenia grup atomów, np. grup funkcyjnych,

3) hydrolazy - katalizujące reakcje hydrolizy, czyli rozpadu różnych wiązań z udziałem wody,

4) liazy - katalizujące niehydrolityczne rozrywanie różnych wiązań,

5) izomerazy - katalizujące reakcje izomeryzacji, czyli przegrupowania atomów lub grup atomów wewnątrz cząsteczek substratu,

6) ligazy - katalizujące tworzenie nowych wiązań połączone z hydrolizą ATP.

W poszczególnych klasach wyróżnia się kolejno ponumerowane podklasy i pod-podklasy, a każdy enzym wewnątrz pod-podklasy otrzymuje numer kolejny, zależny od tego, kiedy enzym ten został odkryty. Dzięki temu każdy enzym jest opisany przez zespół 4 liczb (numer klasy, podklasy, pod-podklasy i numer kolejny w pod-podklasie). Ten czteroczłonowy numer jednoznacznie identyfikuje każdy znany enzym i umieszcza go w międzynarodowym katalogu klasyfikacji enzymów (E.C. - Enzyme Commission). Na przykład trypsyna ma numer EC 3.4.21.4. Klasyfikacja enzy­mó­w, czyli przy­porządkowanie każdemu zna­nemu enzymowi specyficznego ze­stawu liczb opisujących jego właściwo­ści, dokonuje się poprzez okre­ś­lenie typu enzymu, rodzaju sub­stra­tu poddawanego reakcji enzyma­tycz­nej i np. rodzaju przenoszonej grupy atomów, koenzymu uczestni­czą­cego w procesie itp. Niektóre enzymy występują w postaci wolnych cząs­te­czek, inne, zwłaszcza takie, które katalizują reakcje wchodzące w skład np. zespołu większej liczby re­akcji (np. łań­cuch oddechowy), za­jmują ściśle określone miejsce w or­ga­nellach komórki i łączą w sobie dwie funkcje, tj. enzymatyczną i stru­kturalną.

Czynniki wpływające na aktywność enzymu

Ważną cechą enzymu jest szybkość katalizowanej przez niego reakcji. Szybkość ta jest wprawdzie cechą charakterystyczną enzymu, jednak mają na nią wpływ liczne czynniki takie jak: temperatura, pH, stężenie cząsteczek enzymu, obec­ność i stężenie aktywatorów, inhibitorów i jonów akty­wujących (lub jonów me­tali ciężkich dezaktywujących en­zym) i wreszcie siła jono­wa roztworu, czyli su­ma­ry­czne stężenie wszystkich jonów. Ponadto ge­ne­ralnie aktywność enzymów jest hamowana produktami reakcji, a sty­mu­lo­wa­na zwięk­sz­onym stężeniem substratów (Rys. 5.4). Optimum temperaturowe wynosi zazwyczaj 30-45°C, natomiast większość enzymów ulega dezaktywacji w temperaturze powyżej 60°C (Rys. 5.5). Każdy enzym posiada pewne optymal­ne pH dla swojej aktyw­ności (Rys. 5.6).

Rys. 5.4. Wpływ stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej (V_max - maksymalna szybkość reakcji enzymatycznej, K_M - stała Michaelis'a

Rys. 5.5. Wpływ temperatury na aktywność enzymów

Rys. 5.6. Wpływ pH na aktywność różnych enzymów: amylazy, pepsyny i arginazy

ĆWICZENIA

5.1. Oznaczanie aktywności kwaśnej fosfatazy (fosfomonoesterazy)

Zasada:

Fosfatazy są enzymami hydrolizującymi estry fosforanowe róż­ny­ch metabolitów. Specyficzność fosfataz jest bardzo zróżnicowana. Jed­nym ze standardowych substratów dla pomiaru aktywności fosfatazy jest p-nitrofenylofosforan (PNP): O₂N-C₆H₄-O-PO₃H₂. Związek ten jest hydrolizowany przez fosfatazę, która uwalnia z niego cząsteczkę kwasu fosforowego pozostawiając p-nitrofenol, związek o in­tensywnie żółtym zabarwieniu, uwidaczniający się zwłaszcza w alkalicznym środowisku (Rys. 5.7). Umo­żliwia to spektrofotometryczny pomiar ilości uwolnionego p-nitrofe­nolu przy  = 400 nm. Przebieg analizy jest następujący: w pro­bówce miesza się enzym i PNP jako substrat w odpowiednim buforze, a następ­nie przetrzymuje się mieszaninę przez okre­ś­lony czas w stałej tempe­ra­tu­rze, po czym zatrzymuje się reakcję pop­rzez nagłą al­kalizację mie­sza­niny inkubacyjnej i wykonuje pomiar spektrofo­tome­try­czny.

Rys. 5.7. Schemat reakcji katalizowanej przez fosfatazę

Wynik aktywności enzymu, tj. masa przetworzonego substratu za­leży między innymi od stężenia substratu, ilości enzymu oraz czasu re­akcji. Przedłużenie czasu reakcji prowadzi do zużycia substratu, w wy­niku czego szybkość reakcji maleje asymptotycznie do zera (zbliża się do tej wartości, ale nigdy jej nie osiąga). Zwiększe­nie stężenia substratu przy zachowaniu stałości pozosta­łych parametrów prowadzi początkowo do wzrostu szybkości reakcji aż do uzyskania ma­ksymalnej prędkości, przy której wszystkie cząsteczki en­zymu są ma­ksymalnie aktywne i dalsze zwiększanie stężenia substratu nie przy­spiesza reakcji. Osiągnięta została tzw. maksymalna aktywność enzymu.

Wykonanie:

a) Otrzymywanie ekstraktów z ziemniaka

Sporządzenie ekstraktu w buforze: Zetrzeć na tarce 10 g ziemniaka, dodać ok. 15 cm³ 0,1 M buforu octanowego o pH = 5,5, wycisnąć sok przez warstwę gazy, po czym o­dwi­rować przez 15 min przy ok. 9 300 x g.

Sporządzenie ekstraktu wodnego: Przygotowanie jak wyżej, ale zamiast buforu octanowego użyć wody (ekstrakt wodny będzie potrzbny do ćwiczenia 5.1 d).

b) Dobranie czasu inkubacji

Do trzech probówek wlać po 0,1 cm³ eks­traktu enzyma­tycznego w buforze, dodać po 0,9 cm³ 0,1 M buforu octanowego o pH = 5,5 i po 1 cm³ 0,4% roz­two­ru PNP w tym samym buforze octanowym. Zamieszać, odstawić na czas inkubacji reakcji enzymatycznej (odpowiednio: jedną probówką na 3, drugą na 6 a trzecią na 9 minut w temperaturze pokojowej), po czym zastopować reakcję 1 cm³ 0,3 M NaOH i zmierzyć absorbancję próbek przy λ = 400 nm względem ślepej próby (bufor octanowy o pH=5,5). Wynik wyrazić jako liczbę optycznych jednostek aktyw­ności enzymu (rozcieńczenie razy absorbancja). Za optymalny uznać należy czas inkubacji, po którym absorbancja osiągnie wartość pomiędzy 1 a 1,5. Jeśli żaden z czasów inkubacji nie okaże się odpowiedni, należy dokonać interpolacji liniowej.

Jednostką optyczną nazywamy taką ilość danej substancji, która rozpuszczona w 1 cm³ roztworu wykazuje absorbancję równą 1,0 na drodze optycznej 1 cm (tj. w naczynku pomiarowym o grubości 1cm).

Przykładowe obliczenia

Dodając do siebie objętości wszystkich roztworów: 0,1 cm³ eks­traktu, 0,9 cm³ buforu, 1 cm³ PNP oraz 1 cm³ NaOH, razem otrzymujemy 3 cm³. Absorbancja roztworu była mierzona w kuwetce spektrofotometrycznej o grubości 1 cm, zatem liczbę jednostek optycznych uzyskujemy mnożąc uzyskaną absorbancję przez 3.

c) Wyznaczenie zależności aktywności kwaśnej fosfatazy od st­ężenia substratu

Zastosować uzyskany w poprzednim doświadczeniu a) ekstrakt z ziemniaka w buforze octanowym. Do probówki pobrać 4 cm³ roz­tworu substratu (PNP) o stężeniu 4% w buforze octanowym. Z tej pro­bówki pobrać do kolejnej 2 cm³ roz­tworu substratu (PNP) a następnie dodać 2 cm³ samego buforu octanowego (pH 5,5), tym razem uzyskując tym samym stężenie 2% PNP. Uzyskany roztwór zamieszać i pobrać z niego 2 cm³ do kolejnej probówki, do której ponownie dodajemy 2 cm³ samego buforu octanowego (pH 5,5). Tym razem uzyskaliśmy stężenie 1% PNP. Procedurę powtórzyć jesz­cze 7-krotnie, uzyskując w efekcie końcowym 10 probówek zawierających po 2 cm³ PNP o dalszych stężeniach: 0,5; 0,25; 0,125; 0,064; 0,032; 0,016 i 0,008% (w ostatniej probówce będą 4 cm³ roztworu). Następnie, do nowych 10 probówek pobrać po 1 cm³ przygotowanych roztworów PNP oraz po 0,9 cm³ buforu octanowego o pH 5,5. Reakcję enzymatyczną rozpocząć przez dodanie do każdej probówki po 0,1 cm³ ekstraktu z ziem­niaka w buforze octanowym. Inkubację reakcji przepro­wadzić w czasie dobranym w podpunkcie b) i w tej samej temperaturze. Reakcję zastopować NaOH (jak w punkcie a), po czym zmierzyć absorbancję przy λ=400 nm względem ślepej próby (bufor octanowy o pH=5,5).

d) Określanie zależności aktywności kwaśnej fosfatazy od pH

W 11 pro­bówkach przygotować mieszaniny 0,4 M kwasu octowego i 0,4 M octanu sodu w proporcjach poda­ny­ch w tabeli. Bufor (np. octanowy) składa się ze składnika kwaśnego (kwas oc­to­wy) i alkalicznego (octan sodu). Zmieszanie tych składników w różnych proporcjach poz­wala uzyskać różne wartości pH buforu, w którym jest mierzona ak­tywność enzymu. Zmierzyć wartości pH każdego z buforów.

	Nr probówki
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
octan sodu [cm^3]	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
kwas octo­wy [cm^3]	10	9	8	7	6	5	4	3	2	1	0
pH buforu

Do nowych 11 probówek pobrać po 0,9 cm³ poszczególnych sporządzonych buforów oraz po 1 cm³ 0,4% wodnego roztworu PNP. Reakcję enzymatyczną rozpocząć przez dodanie po 0,1 cm³ wodnego ekstraktu z ziem­niaka przygotowanego w zadaniu a). Następnie przepro­wadzić inkubację w czasie i temperaturze jak w poprzednim do­świadcze­niu. Reakcję zastopować przez dodanie po 1 cm³ 0,3 M NaOH. Zmierzyć absorbancję przy λ=400 nm względem ślepej próby (woda destylowana).

Sprawozdanie

a) Na podstawie otrzymanych wyników wykreślić fun­kcję zależności aktyw­ności enzymu od stężenia substratu. Wykres zinterpretować.

b) Na podstawie otrzymanych wyników wykreślić wykres zależności aktywności enzymu od pH. Wykres zinterpretować.

5.2. Wykazanie aktywności oksydaz w ziemniaku

Zasada:

W tkankach występują różne enzymy powodujące utlenianie substratów, a wśród nich oksydazy (utleniające substraty przy udziale tlenu cząsteczkowego) i peroksydazy (wykorzystujące nadtlenek wodoru jako źródło tlenu dla utleniania substratów). Produkty utlenienia mają zwykle ciemne zabarwienie, stąd ciemnienie przekrojonego i poddanego działaniu powietrza jabłka lub ziemniaka. Zwilżenie powierzchni tkanki substratem dla działania enzymów utleniających (np. p-fenylenodiamina), jak i rozcieńczonym, ok. 0,1% roztworem nadtlenku wodoru przyspiesza proces ciemnienia tkanki. Oksydazy i peroksydazy są enzymami, w których istotną rolę odgrywają jony aktywujące. Stąd też zwilżenie powierzchni ok. 1% roztworem EDTA (kwasu etylenodiaminotetraoctowego) wiążącego w trwały kompleks różne dwuwartościowe kationy, opóźnia zjawisko ciemnienia powierzchni przekrojonej tkanki.

Wykonanie:

Ćwiartkę jabłka lub ziemniaka zwilżyć roztworem p-fenylenodiaminy, drugą zwilżyć roztworem nadtlenku wodoru, trzecią zwilżyć roztworem EDTA i wreszcie ostatnią pozostawić jako kontrolną. Porównać szybkość ciemnienia poszczególnych połówek.

5.3. Wykazanie obecności katalazy w ziemniaku

Zasada:

Katalazy są enzymami rozkładającymi nadtlenek wodoru powstający jako produkt uboczny w niektórych procesach metabolicznych. Nadtlenek wodoru jest szkodliwy ze względu na jego utleniające właściwości. Przyjmuje się zatem, że katalazy pełnią w organizmie funkcję ochronną przed szkodliwym działaniem tego związku.

Wykonanie:

Do miazgi ziemniaczanej dodać kroplami wodę utlenioną. Następuje burzliwe wydzielanie się pęcherzyków tlenu świadczących o aktywności katalazy. Wydzielanie pęcherzyków tlenu następuje również podczas przemywania wodą utlenioną skaleczenia; oznacza to, że katalaza występuje nie tylko w tkankach roślinnych.

5.5. Spektrofotometryczne oznaczanie aktywności peroksydazy niespecyficznej

Zasada:

Peroksydazy są powszechnie występującymi enzymami utleniającymi różne substraty przy udziale nadtlenku wodoru H₂O₂. Nazwą peroksydaza niespecyficzna określa się całkowitą pulę peroksydaz cytoplazmatycznych i apoplastycznych. Najczęściej substratem dla peroksydaz są różne związki fenolowe oraz diaminy, których produkty utleniania charakteryzują się wyraźną barwą. W pomiarach aktywności peroksydaz wykorzystuje się reakcję utlenienia N,N'-difenylo-1,4-fenylenodiaminy (czyli p-fenylenodiaminy) do związku N,N'-difenylo-1,4-benzo-quinondiiminy.

Wykonanie:

Odważyć 200 mg świeżej masy liści. Ucierać w ciekłym azocie dodając stopniowo (3 x 1 cm³ = 3 cm³) bufor ekstrakcyjny (50 mM bufor fosforanowy pH 7,0 z 1mM EDTA). Następnie ekstrakt wirować przy 14000 × g przez 10 minut w temp. 4°C. Aktywność peroksydazy zmierzyć spektrofotometrycznie jako wzrost absorbancji przy długości fali 460 nm.

Do kuwety jednorazowej o pojemności 3 cm³ dodać: 2 cm³ buforu ekstrakcyjnego, 12 µl 0,5% roztworu p-fenylenodiaminy w buforze ekstrakcyjnym, 12 µl ekstraktu, a następnie „zerujemy” spektrofotometr. Natychmiast dodajemy 12 µl H₂O₂ w buforze ekstrakcyjnym (50 cm³ buforu ekstrakcyjnego + 0,15 cm³ 30% H₂O₂)_. Należy odczytać początkową wartość absorbancji oraz po upływie 1 minuty. Aktywność enzymów wyrażamy w różny sposób: można np. podawać ilości (mg, μg, μmole, nmole) rozłożonego substratu lub powstającego produktu w reakcji w przeliczeniu na świeżą lub suchą masę, bądź też na mg białka w jednostce czasu. W tym przypadku aktywność peroksydazy niespecyficznej podajemy jako ΔABS/g świeżej masy/minutę.

Przykładowe obliczenia:

Jeżeli utarto 200 mg świeżej tkanki w 3 cm³ buforu, a potem do reakcji zostało z tego pobrane 12 µl ekstraktu, to z przeliczeń wynika, że w 12 µl ekstraktu było białko uzyskane z 0,8 mg świeżej masy. Przykładowo, obserwowano wzrost absorbancji (ΔABS) wynoszący 0,500 w ciągu minuty. Był on spowodowany aktywnością peroksydazy niespecyficznej zawartej w 0,8 mg tkanki, a zatem ilość tego enzymu zawartego w 1 g świeżej masy spowodowałaby wzrost ABS o 625.

5.6. Oznaczanie aktywności katalazy w ekstrakcie z roślin (EC: 1.11.1.6.)

Zasada:

Katalazy są enzymami rozkładającymi nadtlenek wodoru powstający jako produkt uboczny w niektórych procesach metabolicznych. Ponieważ nadtlenek wodoru jest silnym utleniaczem, podobnie jak inne reaktywne formy tlenu, stąd też katalazy pełnią w organizmie funkcję ochronną przed jego szkodliwym działaniem.

Wykonanie:

Odważyć 200 mg świeżej masy liści. Ucierać w ciekłym azocie stopniowo dodając (3 x 1cm³) 3 cm³ buforu ekstrakcyjnego (50 mM buforu fosforanowego pH 7,5 z 1mM EDTA). Następnie ekstrakt wirować przy 14000 × g przez 10 min w temp. 4°C.

Do kuwety spektrofotometrycznej (kwarcowej!) dodać kolejno: 2 cm³ H₂O₂ w buforze (50 cm³ buforu fosforanowego o pH 7,5 + 0,3 cm³ 30% H₂O₂). Na nim „zerujemy” spektrofotometr, a następnie dodajemy bardzo szybko mieszając 200 µl ekstraktu. Odczytać wartość absorbancji przy długości fali 240 nm na początku pomiaru oraz po 1 minucie. Jeżeli dokonujemy pomiaru na spektrofotometrze mierzącym kinetykę enzymatyczną, odczytujemy tzw. slope (kąt nachylenia krzywej) i notujemy jego wartość. Spadek absorbancji o 0,0145 odpowiada rozkładowi 1µmola H₂O₂. Aktywność katalazy wyrażamy w µmolach H₂O₂/mg białka/min (w tym przypadku należy zmierzyć ilość białka w badanym materiale roślinnym, np. metodą Bradford) lub w przeliczeniu na g świeżej masy.

Przykładowe obliczenia:

Przy spadku absorbancji wynoszącej 0,5 na minutę z przeliczeń wynika, że odpowiada to rozkładowi 34,48 µmoli H₂O₂. Jeżeli tkanka o masie 200 mg została utarta w 3 cm³ buforu ekstrakcyjnego, a do pomiaru enzymatycznego zostało pobrane 200 μl, to w tych 200 μl znajdowało się białko pochodzące z 13,33 mg tkanki. Należy wyliczyć z proporcji: białko (w domyśle katalaza) z 13,33 mg tkanki rozłożyło 34,48 µmoli H₂O₂ , to z 1000 mg świeżej masy rozłoży x µmoli nadtlenku wodoru.

Piśmiennictwo:

Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.

73

---