LABORATORIUM BIOTECHNOLOGII OGÓLNEJ

Biotechnologia

czwartek godz. 8¹⁵-12⁰⁰

Adam Cuperek

Katarzyna Świątek (4)

Paulina Kij

ĆWICZENIE nr 9

ENZYMATYCZNA HYDROLIZA PEKTYN

1. Wstęp teoretyczny

Pektyny są głównym składnikiem wiążącym w ścianach komórkowych roślin i owoców. Chemicznie są polisacharydami o strukturze liniowej utworzonej z połączonych cząsteczek kwasu galakturonowego.

Struktura pektyn :

Pektyny mają zdolność wytwarzania żeli w obecności cukru. Z tego powodu pektyny, w połączeniu z cukrem, są używane w przemyśle spożywczym jako środek zagęszczający. Najpowszechniej znane zastosowanie pektyn to wykorzystanie ich w produkcji dżemów. Większość owoców zawiera pektyny ale w ilości nie wystarczającej do wytworzenia mocnego żelu, dlatego dla poprawy jakości produkowanych dżemów są one dodawane. Pektyny są dodawane do specjalnego cukru, który jest przede wszystkim używany do produkcji dżemów (cukier żelujący). Pektyny z cukrem, podczas ogrzewania, tworzą strukturę usieciowaną, dlatego dżemy gęstnieją podczas gotowania a nie w temperaturze pokojowej.

Grupa owoców zawierających ilość pektyn wystarczającą do wytworzenia żelu, jest bardzo mała; przykładem takiego owocu jest pigwa. Powszechnie pektyny są wytwarzane z pulpy jabłkowej oraz pomarańczowej.

Każdy rodzaj enzymu degraduje inny fragment cząsteczki pektyny. Za

depolimeryzację nierozgałęzionych fragmentów pektyny odpowiedzialne są:

-liaza pektynowa (PL)

-pektynoesteraza (PE)

-poligalakturonaza (PG)

-liaza pektatowa (PGL)

-polimetylogalakturonaza (PGM)

Wymienione enzymy degradują tylko rozgałęzione fragmenty pektyn, co w konsekwencji prowadzi do powstania niestabilnych zmętnień podczas przechowywania soków oraz trudności w zastosowaniu procesu ultrafiltracji. Dlatego konieczne jest również stosowanie enzymów rozkładających rozgałęzione fragmenty pektyn. Pierwszym z poznanych enzymów, zdolnym

do degradacji rozgałęzionych fragmentów pektyny uwalnianych przez klasyczne enzymy pektynolityczne, okazała się ramnogalakturonaza A, wykryta w 1990 r., wytwarzana przez Aspergillus aculeatus.

Innymi enzymami zdolnymi do depolimeryzacji rozgałęzionych fragmentów pektyn są:

-endoarabanaza (niezbędna do hydrolizy liniowychłańcuchów arabanu),

-ß-galaktozydaza (zdolna do odłączenia wszystkich bocznych reszt galaktozy, obecnych w oligosacharydach uwolnionych z rozgałęzionych fragmentów pektyny).

2. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia było poznanie metody enzymatycznej hydrolizy pektyn stosowanej do klarowania soków owocowych.

3. Wykonanie ćwiczenia

Ekstrakcja pektyn z materiału biologicznego

Rozdrobnione owoce gotowano przez jedną godzinę w wodzie, co pewien czas mieszając, a następnie oddzielono części stałe przez sączenie.

Pomiar spadku lepkości ekstraktu w trakcie hydrolizy pektyn.

Wiskozymetr Ostwalda wstawiliśmy do łaźni wodnej o temperaturze 30°C i mierzyliśmy czas wypływu kolejno sporządzonych mieszanin zawierających:

1. 30 ml wody destylowanej

2. 26 ml roztworu pektyny i 4 ml wody destylowanej

3. 26 ml roztworu pektyny i 3 ml wody destylowanej oraz 1 ml enzymu

4. 26 ml roztworu pektyny i 2 ml wody destylowanej oraz 2 ml enzymu

5. 26 ml roztworu pektyny i 1 ml wody destylowanej oraz 3 ml enzymu

6. 26 ml roztworu pektyny i 4 ml enzymu

Wszystkie mieszaniny przed dokonaniem pomiaru inkubowaliśmy w temperaturze 30°C.

Pomiar pierwszy wykonaliśmy z trzykrotnym powtórzeniem, pomiar drugi z dwukrotnym, pozostałe zaś jednokrotnie, przy czym każda z mieszanin zawierająca roztwór enzymu przed dokonaniem pomiaru była inkubowana przez okres 10 minut w temperaturze 30°C.

4. Wyniki pomiarów

Tabela1. Czas przepływu badanych mieszanin przez wiskozymetr Ostwalda

próba	czas przepływu cieczy [s]
1	45
		45
		42
	2	84
		84
3	62
4	51
5	50
6	48

Na podstawie wykonanych pomiarów, korzystając z poniższego wzoru obliczyliśmy spadek lepkości substratu:

Bx = (t_p - t_x) / (t_p - t_w) * 100%

gdzie:

Bx - spadek lepkości po czasie t_x

t_p - czas wypływu ekstraktu z owoców

t_w - czas wypływu wody

t_x - czas wypływu ekstraktu z owoców z enzymem po danym czasie hydrolizy

Przykładowe obliczenia dla roztworu zawierającego 26 ml roztworu pektyny, 1 ml enzymu i 3 ml wody destylowanej:

B_x= [( 84 - 62 ) / (84 - 44 )]*100 = 56%

Analogicznie wykonaliśmy obliczenia dla pozostałych prób zawierających enzym, a wyniki zestawiliśmy w tabeli.

Tabela 2. Spadek lepkości poszczególnych prób zawierających roztwór enzymu

próba	ilość enzymu [ml]	spadek lepkości [%]
3	1	56
4	2	83
5	3	85
6	4	90

5. Opracowanie wyników pomiarów

Tabela 3. Spadek lepkości roztworu dla różnych temperatur prowadzenia procesu

objetość enzymu [ml]	temperatura prowadzenia procesu hydrolizy [°C]
		10	10'	20	30	30'	40	40'
0,5	40	33	55	56	56	69	74
1	60	43	71	83	61	71	87
1,5	77	62	87	85	69	83	92
2	87	65	89	90	71	86	95

Na podstawie wyników obliczeń sporządziliśmy wykresy zależności spadku lepkości roztworów od objętości enzymu.

Wykres1. Wykres zależności spadku lepkości roztworu od objętości dodanego enzymu.

Na podstawie sporządzonego wykresu wyznaczyliśmy objętość enzymu (po uśrednieniu wyników), która powoduje spadek lepkości roztworu o 40%, jako że z technologicznego punktu widzenia jest to wartość wystarczająca.

Tabela 4. Optymalna wartość objętości dodanego enzymu dla reakcji hydrolizy prowadzonej w danej temperaturze

Temperatura [^oC]	Objętość enzymu [ml]
10	0,55
20	0,35
30	0,35
40	0,25

Następnie sporządziliśmy charakterystykę zależności objętości enzymu dodanego do roztworu, która spowoduje spadek lepkości o 40 % od temperatury prowadzenia reakcji hydrolizy.

Wykres 2. Wykres zależności optymalnej objętości dodanego enzymu od temperatury prowadzenia procesu

6. Zadanie rachunkowe

Oblicz całkowity koszt hydrolizy 10 m³ roztwotu pektyny o temperaturze 10°C, jeżeli 1 litr preparatu enzymatycznego kosztuje 100 zł, a koszt podgrzania 10 m³ pektyny o 1°C wynosi 5 zł

Koszt całkowity procesu obliczyliśmy korzystając z poniższego wzoru wzoru:

K_c= K_enz + K _podgrz

gdzie:

- K_c - koszt całkowity procesu

- K_enz - koszt użytego enzymu

- K_podgrz - koszt energii zużytej na podgrzanie preparatu

a) Koszt całkowity dla reakcji zachodzącej w 10^oC.

K_c= K_enz + K _podgrz

Do hydrolizy 13 ml roztworu pektyny, aby uzyskać spadek lepkości równy 40% użyto

ok. 0,55 ml enzymu, zatem :

13*10^-3 dm³ roztworu pektyny - 0,55*10^-3 dm³ enzymu

10⁴ dm³ roztworu pektyny - x

x = (10⁴* 0,55*10^-3)/ 13*10^-3= 423,08

Po uwzględnieniu rozcieńczenia (użyty do reakcji hydrolizy enzym rozcieńczony był 600-krotnie) :

423,08/600= 0,71 dm³

Koszt użytego enzymu wynosi:

K_enz = 0,71 l * 100 zł/l = 71 zł

K_podgrz = 0 zł

K_c = 71 + 0 = 71 zł

b) Koszt całkowity dla reakcji zachodzącej w 20^oC.

K_c= K_enz + K _podgrz

Do hydrolizy 13 ml roztworu pektyny, aby uzyskać spadek lepkości równy 40% użyto

ok. 0,35 ml enzymu, zatem :

13*10^-3 dm³ roztworu pektyny - 0,35*10^-3 dm³ enzymu

10⁴ dm³ roztworu pektyny - x

x = (10⁴* 0,35*10^-3)/ 13*10^-3= 269,23 dm³

Po uwzględnieniu rozcieńczenia (użyty do reakcji hydrolizy enzym rozcieńczony był 600-krotnie) :

269,23/600= 0,45 dm³

Koszt użytego enzymu wynosi:

K_enz = 0,45 l * 100 zł/l = 45 zł

K_podgrz = 10 * 5zł = 50 zł

K_c = 45 + 50 = 95 zł

c) Koszt całkowity dla reakcji zachodzącej w 30^oC.

K_c= K_enz + K _podgrz

Do hydrolizy 13 ml roztworu pektyny, aby uzyskać spadek lepkości równy 40% użyto

ok. 0,35 ml enzymu, zatem :

13*10^-3 dm³ roztworu pektyny - 0,35*10^-3 dm³ enzymu

10⁴ dm³ roztworu pektyny - x

x = (10⁴* 0,35*10^-3)/ 13*10^-3= 269,23 dm³

Po uwzględnieniu rozcieńczenia (użyty do reakcji hydrolizy enzym rozcieńczony był 600-krotnie) :

269,23/600= 0,45 dm³

Koszt użytego enzymu wynosi:

K_enz = 0,45 l * 100 zł/l = 45 zł

K_podgrz = 20 * 5zł = 100 zł

K_c = 45 zł + 100 = 145 zł

d) Koszt całkowity dla reakcji zachodzącej w 40^oC.

K_c= K_enz + K _podgrz

Do hydrolizy 13 ml roztworu pektyny, aby uzyskać spadek lepkości równy 40% użyto

ok. 0,25 ml enzymu, zatem :

13*10^-3 dm³ roztworu pektyny - 0,25*10^-3 dm³ enzymu

10⁴ dm³ roztworu pektyny - x

x = (10⁴* 0,25*10^-3)/ 13*10^-3= 192,31 dm³

Po uwzględnieniu rozcieńczenia (użyty do reakcji hydrolizy enzym rozcieńczony był 600-krotnie) :

192,31 / 600= 0,32 dm³

Koszt użytego enzymu wynosi:

K_enz = 0,32 l * 100 zł/l = 32 zł

K_podgrz = 30 * 5zł = 150 zł

K_c = 32 zł + 150 = 182 zł

Na podstawie wykonanych obliczeń sporządziliśmy wykres zależności kosztów całkowitych od kosztów enzymu, użytego do przeprowadzenia hydrolizy.

Wykres 3. Charakterystyka zależności kosztów całkowitych od kosztów użytego enzymu w procesie hydrolizy pektyn.

7. Wnioski :

Na podstawie wykonanego doświadczenia można stwierdzić, że wraz ze wzrostem temperatury hydrolizy roztworu pektyn zmniejsza się ilość enzymu, konieczna do uzyskania 40% spadku lepkości roztworu ( korzystnego z punktu widzenia procesów technologicznych).

Wzrost temperatury jednak wiąże się ze wzrostem kosztów prowadzenia procesu.

---