Tematy wykładów z biologii molekularnej

- wprowadzenie do biologii molekularnej: definicja, historia: budowa i funkcja DNA, RNA: od genu do białka: dogmat biologii molekularnej, kod genetyczny, budowa białek

- wybrane metody oczyszczania i analizy białek

- organizacaj genomu: genom bakteryjny, genom eukariotyczny - jądrowy, chloroplastowy i mitochondrialny, eukarityczne wirusny DNA i wirusy RNA:

- Ekspresja genów: transkrypcja, dojrzewanie RNA, transport przez błonę jądrową, translacja, fałdowanie i degradacja białek, regulacja ekspresji genów:

- cykl komórkowy i jego regulacja

- apoptoza

- biologia molekularna w medycynie: choroby mitochondrialne i nowotworowe, przeciwciała jako narzędzie w biologii molekularnej i wspólczesnej medycynie.

Historia biologii molekularnej

• 384 - 322 p.n.e. - Arystoteles ogłasza teorię pangenezy (cechy dziedziczne są zawarte i przenoszone w gemulach z poszczególnych komórek ciała)

• 1866 r. - G. Mendel (ojciec wspólczesnej genetyki) publikuje swoją pracę na temat dziedziczenia cech u grochu

• 1869 r - F. Miescher izoluje bogatą w fosfor substancję zwaną „nukleiną” z jąder kwrinek białych

• 1875 r. - E.Strasburger opisuje twory, zwane później chromosomami

• 1929 r. - P.A. Levene charakteryzuje i nazywa kwas rybonukleinowy i kwas deoksyrubonukleinowy

• 1938 r - pojawia się wiele badań nad bialkami i DNAz wykorzystyaniem krystalografii rentgenowskiej, W. Weaver proponuje temrin biologia molekularna;

• 1950 r. - E. Chargaff pokazuje że ilości zasad T i A oraz C i G w DNA są równe;

• 1952 r - A. Hershey i M. Chase wykorzystują badania nad bakteriofagiem T2, by potwierdzić że DNA jest nośnikiem informacji genetycznejj

• 1952 r - Maurice Wilkins i Rosalind Franklin, wykorzystując krystalografię rentgenowską, wyjaśniają, że w DNA znajdują się struktury powstarzające się

• 1953 r - Francis Crick i James Watson prezentują DNA jako helisę złożoną z dówch nici powiązanych wiązaniami wodorowymi

DNA jest materiałem genetycznym; każdy chromosom jest pojednynczą cząsteczką DNA; geny są fragmentami sekwencji DNA.

Biologia molekularna

Nauka podstawowa zajmująca się badaniem struktury i funkcji makromolekul, przede wszystkim białek i kwasów nukleinowych. Zazębia się ona z takimi dziedzinami wiedzy jak genetyka, biochemi, biofizyka czy cytologia.

Wiliam Astbury w „Nature” (1961) opisał, że biologia molekularna: „(…) jest szczególnie zainteresowana formami biologicznych cząsteczek, ich trójwymiarową strukturą, genezą i ich funkcjonowaniem”.

DNA jest polimerem zbudowanym z powstarzających się jednostek zwanych nukleotydami (dNTP:) dATP, dGTP, dCTP, dTTP

Długość komórkowych cząst. DNA może sięgać kilkaset milionów nukleotydów, długość dwuniciowej cząst. DNA wyraża się liczbą par zasad (pz) - kilo par zasad (kpz) lub milion pz (mpz). W laboratoriach często wykorzystuje się krótkie łańcuchy jednoniciowego DNA, zazwyczaj krótsze niż 50 nt, określane mianem oligonukleotydów

DTP - deoksyrybonukleotydotrifosforan

do deoksyrobozy dołączona zasada azotowa (base) - A, T, G, C - w pierwszym węglu, w piątym trifosforan, w trzecim OH.

Formy przedstawienia podwójnej helisy DNA

A - w środku os, na zewnatrz szkielet fosfocukrowy, do środka zasady połączone wiązaniami wodorowymi

B - widoczne jest ulożenie warstwowe zasad w podwójnej helisie DNA, na zewnątrz szkielet fosfocukrowy

C - forma wstęgowa - szkielet fosfocurkowy w postaci podwojnej wstęgi, pomiędzy nimi łączą się wiązaniami wodorowymi komplementarne zasady A i T, C i G, tworzą się duży rowek i mały rowek.

Formy dwuniciowej helisy DNA

A- DNA B-DNA Z-DNA

Kierunek skrętu Prawoskrętna Prawoskrętna Lewoskrętna

Duży rowek Głęboki i wąski Średnio glęboki, szeroki Płytki, w zasadzie nieobecny

Mały rowek Płytki i szeroki Średnio glęboki, wąski Bardzo głęboki, wąski

Liczba par zasad na

pełny obrot helisy 11 10,5

Dwuniciowa cząsteczka DNA może podlegać odwracalnemu rozpleceniu do pojedycznych nici

Natywny DNA (podwójna helisa) - podgrzanie, OH-, formamid → Zdenaturowany DNA (Statystyczny kłębek)

Temperatura topnienia (Tm) DNA - to taka temp., przy której 50% podwójnej helisy DNA jest rozpleciona do pojedynczych nici

Budowa RNA

Cząsteczka RNA jest liniowym polimerem zbudowanym z nukleotydów połączonych ze sobą wiązaniami fosfodiestrowymi

DNA - cząsteczka dwuniciowa, występujące zasady

C - cytozyna

G - guanina

A - adenina

T - tymina

Deoksyryboza - węgiel w pozycji 2'

RNA - cząsteczka jednoniciowa, występujące zasady

C - cytozyna

G- guanina

A- adenina

U - uracyl

Ryboza - wodór w pozycji 2'

Struktury drugorzędowe RNA

Drugorzędowa struktura RNA charakteryzuje się obecnością podwójnej helisy typu A oraz jednoniciowych pętli, które można podzielić na:

struktury spinki do włosów (ang. hairpins)

wybrzuszenia (ang. bulges)

pętle wewnętrzna (ang. internal loop)

połączenia (ang. junctions)

Rodzaje par zasad zidentyfikowane w dwuniciowych helisach RNA

Kanoniczne pary zasad typu Watson-Crick: AU; GC

Niekanoniczne pary zasad (ponad 20 różnych typów), najczęściej spotykane to:

GU (ang. wobble GU); GA (ang. sheared, po polsku tzw. nożycowa)

AU

Oddziałujące trójki zasad w RNA

Trójki zasad mają zwykle parę oddziałującą w sposób klasyczny, zgodnie z zasadami par typu Watson-Crick a trzecia zasada oddziałuje wieloma różnymi, niekonwencjonalnymi sposobami,

Niekanoniczne pary oraz trójki zasad są ważnymi elementami procesow zwijania się RNA i oddzialywań RNA-białko i RNA-ligand.

Motywy struktury trzeciorzędowej RNA

„cząsteczka tRNA wygląda tak, jakby Natura chciala zmusić cząsteczki RNA do wykonywania zadań przeznaczonych dla bialek” - F. Crick (1966)

Zidentyfikowano liczne, bardzo zachowawcze i złożone motywy strukturalne RNA,

m.in. pseudowęzły, zwroty K

Rodzaje i funkcje RNA w komórce

Cały RNA:

-kodujący (4%)

RNA kodujący - pre-mRNA (hnRNA, heterogenny nuklearny RNA) - kom eukariotyczne ->mRNA

- niekodujący (96%)

pre-rRNA → rRNA

pre-tRNA → tRNA

w komórkach eukariotycznych występują także

snRNA, - small nuclear RNA, potrzeby do dojrzewania mRNA

snoRNA - mały jąderkowy RNA, potrzebny do dojrzewania rRNA (?)

scRNA - mały cytoplazmatyczny RNA, np. siRNA, mikroRNA

w komórkach bakteryjnych występuje także:

tmRNA - RNA trochę jak tRNA, a trochę jak mRNA

Większość RNA występuje w kompleksach RNA-białko zwanych cząstkami rybonukleoproteinowymi (RNP)

Komórka bakteryjna zawiera 0,05 - 0,1 pg RNA co stanowi ok. 6% jej masy

Komórka ssaków jako większa zawiera 20-30 pg DNA.

Funkcje RNA w komórce

• RNA może służyć jako „rusztowanie” na którym osadzają się białka, np. cząstka sygnałowa SRP;

• oddziaływania RNA-białko mogą wpływać na aktywność katalityvzną białek, np. telomeraza.

• krótkie cząsteczki RNA mogą bezpośrednio kontrolować ekspresję genów, np. ryboprzełączniki, RNA związane z interferencją RNA (RNAi);

• RNA może być meteriałem dziedzicznym, np. wirusy RNA

• RNA może być katalizatorem reakcji chemicznych, tzw, rybozymy.

Katalityczne RNA - rybozymy

Samowycinające się introny - introny grupy I i II

Rybonukleaza P - enzym który wytwarza końce 5' bakteryjnych tRNA składa się z podjednostek RNA i podjednostek białkowych, przy czym aktywnośc katalityczną ma RNA

RNA rybosomowy - aktywność transferazy pepdtydylowen potrzebna do wytworzenia wiązania pepdtydowaego w czasie syntezy białka jest związana z dużym rRNA

Spliceosom - kompleks rybonukleoproteinowy biorący udział w splicingu pre-mRNA

Genomy wirusowe - podczas replikacji genomów RNA niektórych wirusów następuje autokatalityczne przecięcie łańcuchow nowo zsyntetyzowanych genomów. Przykładem są wiroidy roślinne (rybozymu typu: hammerhead, hairpin), wirusoidy i zwierzęcy wirus zapalenia wątroby delta (HDV)

1958 - Sformułowanie centralnego dogmatu biologii molekularnej przez Francisa Cricka

Informacja genetyczna, która zawarta jest w DNA w większości przypadków przenoszona jest z DNA na DNA w procesie replikacji, następnie z DNA na RNA w procesie transkrypcji i z RNA na białko w procesie translacjii (biosyntezy białka)

General Special Unknown

DNA-DNA RNA-DNA Protein-DNA

DNA-RNA RNA-RNA Protein-RNA

RNA-Protein DNA-Protein Protein-Protein

Podstawowy przepływ informacji w komórce

DNA → (transkrypcja) → RNA → (translacja) → Białko

DNA i RNA stanowią genotyp - „język nukleotydów”

Białko stanowi o fenotypie - „język aminokwasów”

Rybosom pełni funkcję „tłumacza” genotypu na fenotyp

Informacja genetyczna zawarta jest w DNA w poszczególnych genach.

Gen - fragment funkcjonalny cząsteczki DNA kodujący białko bądź funkcjonalną cząsteczkę RNA.

Geny nawinięte na chromosom.

Kod genetyczny

Mamy podwójną helisę DNA która ma ulec transkprycji, musi ona ulec rozpleceniu, na jednej z nici syntetyzuje się RNA, jeżeli ma potem powstać z tego bialko to mRNA, trzy kolejne nukleotydy w mRNA stanowią kodon - są one tłumaczone na jeden aminokwas, synteza lańcucha aminokwasowego - powstaje białko, fałduje się.

Kod genetyczny jest trójkowy

61 kodonów koduje 20 podstawowych aminokwasów (ogólnie w komórce występuje 100 aminokwasów powstających na drodze modyfikacji podstawowych0 - kod jest zdegenerowany - kilka kodonów - kilka kodonow może kodowac ten sam aminokwas

Tylko metionina jest kodowana przez jeden kodon - AUG - kodon start.

Inne aminokwasy 2-6 kodonów.

Sekwencja stop - 3 kodony.

Kodon jest także jednoznaczny - dany kodon koduje tylko jeden aminokwas.

Długo mówiono, że jest uniwersalny, ale teraz nie do końca - prawie te same trójki kodują te same aminokwasy, ale występują drobne różnicy - trochę inaczej u niższych zwierząt.

21 i 22 aminokwas w białkach

UGA Stop - selenocysteina (prokariota i eukariota, z wyjątkim drożdży i roślin)

UAG Stop - pirolizyna (archeony i bakterie)

Białka

Polimery składające się z 'cegiełek' aminokwasów, połączonych wiązaniami peptydowymi.

Początek białka ma (N-koniec) wolną grupę aminową, koniec białka (C-koniec) wolną grupę karboksylową, z boku łańcuchy boczne.

Opis cząteczki Wygląd cząteczki Liczba aminokwasów

Peptydy krótki łańcuch aminokwasowy

Poziomy organizacji cząteczki białka

Struktura pierwszorzędowa - sekwencja, czyli kolejność ułożenia aminokwasów

Drugorzędowa - alfa helisa, beta kartka

Struktura trzeciorzędowa - wzajemne przestrzenne ułożenie fragmentów struktury drugorzędowej

Struktura czwartorzędowa - wzajemne przestrzenne ułożenie łańcuchów polipeptydowych.

Tylko białka zawierające więcej niż jedną podjednostkę mają strukturę czwartorzędową!!!

(a) Collagen

włókienko splecione z kilku łańcuchów polipeptydowych

Denaturacja - renaturacja białka

W wyniku denaturacji zniszczeniu ulega struktura 2, 3, 4-rzędowa, zostaje pierwszo.

Native form → (denaturation) → białko zdenaturowane → (refolding) → native form

Sposoby prezentacji struktury atomowej białka

• str. szkieletowa - sam szkielet białka, bez wiązań bocznych

• str. wstążkowa - za pomocą wstążek i strzałek ukazane są alfa helisy i beta kartki - strzałki pokazują nam kierunek białka

• str. chemiczna - pokazane wiązania

• str. powierchniowa - kuleczkowa struktura

n-koniec niebieski, c- czerwony

Wybrane metody oczyszczania i analizy białek

Analiza białek pozwala odpoweidzić na wiele ważnych biologicznie pytać dotyczących badanego białka:

• jaka jest całkowita ilość badanego białka w komórce, a jaki jest poziom syntezy w poszczegolnych typach komórek;

• jaka jest subkomórkowa lokalizacja badanego białka (np. jądrowa, błonowa, mitochondrialna itd.);

• czy białko ulega translokacji w odpowiedzi na pewne warunki;

• czy białko ulega modyfikacjom postranslacyjnym i jak wplywają one na funkcje białka;

• czy poziom danego białka w komórce jest rgulowany przez szok cieplny, hormony, czynniki wzrostowe;

• jaka jest funkcja badanego białka w komórce;

• z jakimi innymi bialkami oddziałuje badane białko;

• czy poziom białka w komórce zmienia się u chorych osobników.

Wybór analizowanego białka

Wybór źródła badanego białka

- naturalne

- nadekspresja

Ułatwia oczyszczanie

Umożliwia otrzymanie dużych ilości białka

- Analizy biochemiczne (badanie aktywności enzymatycznej, stabilności, interakcji białko-białko, białko-DNA)

- Analizy strukturalne (krystalizacja, NMR)

- Otrzymanie przeciwciał

Hodowle komórkowe

- komórki drożdżowe są tańsze, łatwiejsze do przeprowadzenia. Można otrzymywać kolonie drożdżowe na plytkach agarowych lub w pożywkach plynych na odpowiednich wytrzasarkach w odpowiedniej temperaturze

- komórki ssacze tzw. linie komórkowe

Szalki w podłożu płynnym w odpowiednich inkubatorach zapewniających temperaturę i dwutlenek węgla;bądź duże naczynia hodowlane

Wyższe wymogi sterylności, aby nam się nie zakaziło.

Metody dezintegracji komórek/lizy komórek

• mechaniczne

• homogenizacja

• młyn kulkowy

• nie-mechaniczne

• fizyczne (sonikacja, mrożenie/odmrażanie)

• chemiczne (detergenty, rozpuszczalniki)

• enzymatyczne (lizozym, litykaza)

Dezintegracja komórek

• moździerz ceramiczny

• homogenizator szklano-teflonowy (rurka, do niej roztwor komórkowy, tłok chodzi w górę i w dół, rozbja komorki, pomagają w tym czynniki chemiczne zawarte w roztworze)

• homogenizator ultradźwiękowy - zawiesina komórek, wkładamy pręt ultradźwiękowy, niszczy się integrację komórek

Frakcjonowanie komórek poprzez wirowanie różnicowe

Homogenat wirujemy (1500g - 10 min.)

• osad I (całe komórki, pozostałości komórek, jądra)

• supernatant I wirujemy (30000 g - 20 min)

• osad II (mitochondria, lizosomy, peroksysomy)

• supernatant II wirujemy (100000g - 2 godz)

• osad III (mikrosomy)

• supernatant III (białka cytoplazmatyczne)

Przed wirowaniem - cząsteczki zawieszone w roztworze → wirowanie za pomocą szybko obracającego się rotora kątowego - po wirowaniu na górze supernatant, osad osiada na dole.

Wirowanie w gradiencie gęstości

Do probówki wirówkowej nalewany roztwór sacharozy - bliżej dna gęsciejszą sacharozę - 20%, bliżej wierzchu 5% sacharozy, rzadzsza, gradient gęstości - na górze nanosimy próbkę - wirujemy w rotorze w którym probówki są ustawione poziomo, w wyniku działania siły odśrodkowej rozdziela się mieszanina w gradiencie sacharozy - z inicjalnego nanosu powstają oddzielone frakcje

małe cząsteczki na wirzechu, średnie cząsteczki w środku, duże cząsteczki na dnie

Wysalanie białek

Mamy płaszcz wodny przykrywający białko

Wraz ze zwiększeniem koncentracji soli do pewnego momentu rozpuszczalnosc białek rośnie (nasycanie roztworu solą) - tworzy się płaszcz hydratacyjny i rozpuszcza się lepiej

Tak się dzieje tylko do pewnego momentu, po dodaniu kolejnej porcji soli rozpuszczalnosc gwałtownie spada i białko wytrąca (wysala się) z roztworu.

Dializa białek - przechodzenie przez błony półprzepuszczalne cząsteczek rozpuszczalnika i innych małych cząsteczek, którymi zanieczyszczany jest roztwór białka.

Początek dializy

Stężony roztwór (białka + zanieczyszczenia) umieszczamy w półprzepuszczalnym woreczku dializacyjnym i umieszczamy w zlewce z rozpuszczalnikiem, zostawiamy na kilka godzin.

Po ustaleniu równowagi

Z woreczka dializacyjnego przeszła połowa zanieczyszczeń, po wymiani rozpuszczalnika proces powtarza się

Oczyszczanie białek metodą chromatografii cieczowej

Mieszanina białek (np. frakcja cytoplazmatyczna) - nanosimy ja na odpowiedni złoże chromatograficzne, które znajduje się w odpowiedniej kolumnie, na dole kolumy otwór, na górze próbka → u gorze podłączamy rozpuszczalnik, na dole probówkę, nasz roztwór wędruje przez złoże, rozdziela się, po kolei do próbówek zbieramy różne frakcje zawierające rozdzielone białka.

Wykres chromatograficzny

na osi x poszczególne probówki do których zbieramy białka, na y absorbancja

nic - potem ścieka białko jeden - nic - potem ścieka białko dwa - pik wskazuje na białko - pik wskazuje nam na rodzaj białka.

To z automatycznych, zmaszynowanych chromatografów.

Różne rodzaje chromatografii cieczowej

Rozdział białek ze względu na:

rozmiar - filtracja żelowa (sito molekularne)

ładunek - chromatografia jonowymienna

hydrofobowość - chromatografia oddziaływań hydrofobowych

powinowactwo - chromatografia powinowactwa

Filtracja żelowa

W kolumnie mamy kolumnę wypełnioną złożem chromatograficznym - kuleczkami agarozowymi, które mają określoną wielkość porów

Na takie złoże chromatograficzne nakladamy mieszaninę dużych i małych białek

Podłączamy rozpuszczalnik, u dole kranik, białka przechodza przez kolumnę i się rozdzielają

Najpierw białka duże, małe potem, najmniejsze najpóźniej.

Białka duże nie są zatrzymywane przez pory bo się w nich nie mieszczą, przenikajś więc między kuleczkami złoża i idzie im szybciej,

białka małe przenikają przez pory w złożu (wchodza do kuleczki i muszą potem znaleźć z niej wyjście) - więc schodzi im dłużej.

Chromatografia powinowactwa

W chromatografii powinowactwa wykorzystujemy powinowactwo białka do złoża chromatograficznego

Mamy złoże chromatograficzne, oraz mieszanine białek o różnej strukturze.

Tylko jedno białko ma powinowactwo do złoża (łączy się ze złożem)

Nanosimy mieszaninę białek - jedne białka łączą się ze złożem, reszta nie - przepłukujemy rozpuszczalnikiem (płukanie) - z kolumny wypadają wszystkie białka, które nie łączyły się ze złożem, jeden rodzaj białek został.

Wykres chromatograficzny

- najpierw absorbancja zero po tym jak nałożyliśmy tylko mieszaninę,

płuczemy - absorbancja rośnie - płuczemy aż znowu nie spadnie (aż nie wypłuczemy całego białka i będzie leciał sam rozpuszczalnik)

- stosujemy wtedy drugi rozpuszczalnik który sprawia że wydzielone białko odczepia się od złoże i wyletuje też - pik numer dwa ostrzejszy znowu płuczemy aż nie spadnie (krócej)

- Następnie możemy do drugiej kolumny która sprawia że wysalamy (?) owe białko

Ilościowe oznaczenie białka wbadanych frakcjach komórkowych

• Metody spektrofotometryczne - Metoda Whitakera i Granuma

C białka (mg/ml) = (A235 - A280)/2,51

• Metody kolorymetryczne - Metoda Bradford

Zabarwienie kompleksu proporcjonalne do stężenia białka

Białko + kumasi → kompleks barwi niebieskiej mierzy się spekrofotometrycznie przy 595 nm.

Trzeba zrobić krzywą wzorcową → tworzymy kompleksy białko-barwnik o znanym stężeniu → wiemy wtedy że dane stężenie białka odpowiada danej absorbancji, następnie odczytujemy z niej stężenia w próbie badanej

(równanie prostej można też obliczyć)

Elektroforeza żelowa białek

- Metoda ta umożliwia monitorowanie składu mieszaniny białek, sprawdzanie czystości białek, oznaczanie masy cząsteczkowej, analizy struktury podjednostkowej, określenie punktu izoelektrycznego białka

- W analizie białek stosowane są żele poliakrylamidowe (dobra rozdzielczość, duża wytrzymałość mechaniczna)

- Elektroforeza w żelu poliakryamidowym umośliwia rozdział cząsteczek białkowych różniących się wielkością i ładunkiem elektrycznym;

- Rozdział może być jednokierunkowy (1D) - lub dwukierunkowy (2D)

Analiza białka elektroforezy jednokierunkowej w warunkach denaturujących (SDS/PAGE)

Elektroforeza pionowa

próbki dodajemy za pomocą pipety automatycznej do studzienek

- wierzch - (katoda), dno + (anoda), białka idą z - do +

Do roztworu białka dodawany jest

• SDS - skladnik detergentów i środków myjących; ma on ujemny ładunek, przykrywa białka i maskuje ich ładunek, dzięki czemu wszystkie są ujemne i wędruja do anody.

• DTT - substancja o zapachu zgniłych jaj, zawiera grupy -SH, niszczy mostki siarczkowe pomiędzy podjednostkami białka dzięki czemu każda podjednostka wędruje w żelu oddzialnie

• Barwnik - najczęściej niebieski

Żel ma różne wielkości porów, z zależności od tego jakie bialka chce się zatrzymać.

- mniejsze białka zatrzymują się niżej

- większe wyżej

- największe najwyżej

Rozdzielamy białka pod względem ich masy.

Ile jednostek ma białko, tyle prążków widzimy po wybarwieniu.

Barwienie białek w żelu poliakrylamidowym.

• Barwienie barwnikiem Coomassie Blue

zwykle powyżej 25 ng/prążek

barwienie fioletowe - prązki to poszczególne polipeptydy

Porównujemy z prązkami wzorcowymi, o znanej masie, porównujemy i okreslamy jaką masę ma nasze białko.

• Barwienie srebrem (teoretycznie bardziej czulsza, ale to zależy od białka)

ok 0,5ng/prążek

Prążki są wtedy żółtobrązowe

• Barwienie cynkiem

Nie wybarwiamy prążków białkowych, tylko wybarwia nam się tło - żel robi się mleczny i tylko te miejsca gdzie są prążki są przezroczyste

czulość od 4000 - 0,25 ng/prążek

• Barwienie barwnikiem fluorescencyjnym

dwa protokoły - szybki i podstawowy

metoda bardzo czuła i uniwersalna, ale drogie barwniki, konieczna aparatura dodatkowa.

• Barwienie glikoprotein

Blue Stain (Coomassie) - barwimy wszystko

Glycoprotein stain - barwimy tylko glikoproteiny

• Barwienie foffobiałek

Blue Stain (coomassie)- barwimy wszystko

Phosphoprotein stain - barwimy tylko białko posiadające grupę fosforanową (fosfbiałka); meoda czulsza niż coomassie i specyficzniejsza

Coomassie nie barwi wszystkiego.

Analiza białek metodą ogniskowania izoelektrycznego (IEF)

punkt izoelektryczny (pI) - pH w którym cząsteczka ma zerowy ładunek sumaryczny, oznaczany przy pomocy programu komputerowego dla białek o znanej sekwencji, lub empirycznie.

Jeżeli żel podłączymy z jednej strony do katody (-) i anody (+) to wytworzy nam się gradient pH odpowiednio od pH 10,0 do pH 3,0 - białka w mieszaninie wędruja tak dlugo, aż osiągną pH które odpowiada ich punktowi izoelektrycznemu - mają wtedy zerowy ładunek sumaryczny i przestają się poruszać w polu elektrycznym

Rozdzielają i ustawiają się więc zgodnie z rosnącym pI od anody do katody, a nie względem masy.

Ogniskowanie izoelektryczne

Zestawienie rozdzielczości SDS/PAGE - mamy jeden prążek, wyknujemy dla niego elektroforezę IEF - otrzymujemy osiem prążków w rozpiętości pH od 5,0 do 3,5 (?) - są to białka rybosomalne o prawie takiej samej masie cząsteczkowym lecz innym pI.

Analiza białek metodą elektroforezy dwukierunkowej (2D)

Pierwszy kierunek - IEF

długie cienkie paseczki ustawiające się w gradiencie pH

Drugi kierunek - SDS/PAGE - rozdzielone już białka pod względem punktu izoelektrycznego kieruje się do elektroforezy SDS/PAGE gdzie ustawiaja się dodatkowo względem masy.

Następnie barwimy barwnikiem Coomassie Blue lub srebrem

- zamiast prążków widzimy kropeczki

jeden wymiar żelu to gradient pH a drugi wymiar żelu to gradient masy.

Sekwencjonowanie białek - ustalenie kolejności aminokwasów w łańcuchu peptydowym

W 1953r F. Sanger jako pierwszy zsekwencjonował białko (łańcuchy insuliny)

Sekwencję białka możemy poznać

- poprzez sekwencjonowanie łańcucha peptydowego;

- poprzez sekwencjonowanie DNA odpowiedniego genu (lub cDNA), a nstępnie ustalenie sekwencji białka na podstawie kodu genetycznego.

Metody sekwencjonowanie/identyfikacji białek:

- chemiczne (degradacja Edmana)

- spektrometria mas

Etapy analizy sekwencji białka

Roztwór białka/mieszaniny białek

- 2D; SDS/PAGE; IEF → trawienie proteolityczne w żelu → rozdział chromatograficzny peptydów lub spektrometria mas (MALDI TOF MS) lub spektrometria mas (LC-MS/MS) → degradacja Edmana lub spektrometria mas (MALDI TOF MS)

- trawienie proteolityczne - spektrometria mas (LC-MS/MS)

W celu ustalenia sekwencji dlugiego polipeptydu należy go rozciąć na krótsze peptydy składające się z 20-50 reszt, które po rozdzieleniu poddaje się sekwencjonowaniu. Specyficzne pocięcie polipeptydu można osiągnąć metodami chemicznymi lub enzymatycznymi np. bromocyjanu (BrCN), który rozrywa wiązanie peptydowe utworzone przez grupę karboksylową metioniny

Cyanogen bromide cleavage np. przy udziale trypsyny która rozcina łańcuch polipeptydowy po karboksylowej stronie reszt aminokwasów zasadowych (Lys, Arg), lub chymotrypsyny, rozdzinającej łncuch polipeptydowy po karboksylowej stronie reszta aminikwanós arometycznych (Phe, Tyr, Trp).

Peptydy otrzymane w wyniku secyficznej hydrolizy rozdziela się chromatograficznie i oznacza sekwencję każdego z oczyszczonych peptydow techniką degradacji Edmana.

Degradacja Edmana

Znakowanie peptydu którego sekwencję chcemy ustalić związkiem fenyloizoitocyjanianem

W środowisku zasadowym przyłącza się do pierwszego aminokwasu z N-końca polipeptydu - mamy fenylotiokarbamylową pochodną peptydu - w środowisku kwaśnym fenylotiocyjanian + aminokwas z N-końca odłączają się - powstaje fenylotiohydantaionowa (PTH) pochodna N-końcowego aminokwasu, i polipeptyd (N-1)- cykl powtarzamy

Kolejność ułożenia peptydów w polipeptydzie możemy wyjaśnić na podstawie tak zwanych nakładających się peptydów

peptydy trypsynowe peptyd chymotrypsynowy

Ala-Gly-Trp-Gly-Lys Asn-Val-Lys-Ala-Gly-Trp

Asn-Val-Lys

peptydy trypsynowe nakładają się na peptyd trypsynowy:

• peptydy trypsynowe Asn-Val-Lys Ala-Gly-Trp-Gly-Lys

• peptyd chymotrypsynowy Asn-Val-Lys-Ala-Gly-Trp-Gly-Lys

Spektrometria mas - techniki polegające na jonizacji badanej substancji, a następnie analizie utworzonych produktów ze względu na ich masę i ładunek.

Analizowana substancja → jonizacja badane substancji w jonizatorze → rozdział jonów o różnym stosunku masy do ładunku (m/z) w analizatorze m/z → rejestracja danych w systemie rejestracji danych detektorze)

Wynik: widmo masowe.

Metoda „odcisku palca” mapy peptydowej

(PMF, ang. peptide mass fingertprinting)

Eksperyment: mamy białko → trawienie do mapy peptydowej → spektrometria mas daje nam listę mas - porównujemy z teoretyczną lista mas poszczególnych mas dla różnych białek w programie komputerowym

Program komputerowy: baza danych sekwencji danych → trawienie teoretyczne do wirutalnej mapy peptydowej → symulacja spektrometrii mas → otrzymujemy hipotetyczne listy mas dla poszczeŋólnych białek.

Różnice w metodach sekwencjonowania

Degradacja Edmana

chemiczne usuwanie aminokwasów z N-końca peptydu (1 aa/ na cykl) i określenie sekwencji białka od N-końca (analiza chromtograficzna PTH pochodnych aminokwasów)

>~50 pmol polipeptydu

Spektrometria mas

umożliwia niewykle dokładne pomiary mas polipeptydów co z kolei pozwala na identyfikację peptydów poprzez wyszukiwanie w bazie danych, białek zawierających peptydy o takiej samej masie

>~50 fmol polipeptydu (lC MS/MS)

To, czego nie można dowieść metodami biochemicznymi, można teraz po prostu zobaczyć, czyli...

przyżyciowa analiza procesów biologicznych metodą mikroskopii konfokalnej

Obraz w mikroskopie konfokalny uzyskiwany jest poprzez skanowanie preparatu wiązką lasera, która wzbudza fluorescencję barwnika

Zalety:

- otrzymywanie obrazów o większej rozdzielczości i lepszym kontraście

- uzyskanie trójwymiarowego obrazu

- jednoczesna rejestracja kilku barwników

Białko GFP (Green Fluorescent Protein) z meduzy Aequorea victoria (nagroda Nobla 2008), białko z meduzy po wzbudzeniu go światłem o długości 395 nm emituje światło zielone o długości 509 nm

jest to bialko beczułkowe, beczułki tworzą beta-harmonijki, w środku mamy fluorofor czyli to co fluoryzuje

następnie z teog białka Roger Tsien otrzymal pochodne świecące różnymi barwami

- możemy otrzymać świecąc bakterie, króliki.

Musimy otrzymać konstrukt genetyczny zaiwerającyc sekwencję badanego białka (np. Beta-aktyny) i sekwencję fluorescencyjnego białka

miszamy to z liposomowym czynnikiem transfekcji (przenoszenia obych genów do komórki), inkubujemy przez trzydzieści minut

plazmidy tworzą kompleks z z kationowymi liposomami - tworzą się lipopleksy

dodajemy to do komórek ssaczych, inkubujemy.

Dodajemy utworzonego DNA do komórki ssaczej - ono przenika do jądra, ulega transkrycji do mRNA, mRNA wędruje do ctyoplazmy - ulega translacji - powstaje nam białko badane związane z białkiem fluorescencyjnym - powstaje świecący szkielet aktynowy

FRET (ang. Fluorescence Resonance Energy Transfer lub Foerster Resonance energy Transfer) - metoda badania interakcji między białkami

- Zasada tej metody opiera sę na istnieniu transferu energii między dwiema fluorescencyjnymi cząsteczkami.

- Jeśli dwa białka są fluoroforami to wzbudzenie fluorescencji pierwszego z nich (donor) prowadzi pobudzenie drugiego (akceptor)

Warunku aby doszło do transferu

- nakładające się widmo emisji donora i wzbudzenia akceptora

- odległości między nimi rzędu 1-10 nm

Przypadek 1

Białka A i B są badane. Do A doczepiono białko fluorescencyjne emitujące barwę zieloną, a do białka B emitujące barwę żółtą

- widma nakłądają się, ale odległości między nimi nie są rzędu 1-10 nm

po wzbudzeniu donora światłem 405/440 nm widzimy emisje tylko donora światłem 475 nm.Jeżeli odległość jest rzędu 1-10 nm po wbudzeniu donora światłem jego emisja wzbudza akceptor i akceptor świeci na żółto

Struktura komórek bakteryjnych i eukariotycznych

Komórka bakteryjna

materiał genetyczny - nukleoid - rozmieszczony w cytoplazmie, brak jądra, w cytoplazmie rybosomy, na zewnątrz blona komórkowa i ściana komórkow.

Komóka eukariotyczna - ma jądro

Nukleodi (DNA chromosomowy z superzwiązanymi domenami) - E.coli ~4700 kpz

superzwinięte domeny DNA nawinięte na histonopodobne białka

Oprócz chromosomu bakteryjnego mamy plazmidy - geny dodatkowe np. odporności na antybiotyki

Główna powtzarzająca się jednostka strukturalna chromatyny to nukleosom

Rdzeń tworzy osiem cząsteczek histonów (4 pary: H2A, H2B, H3, H4), nań nawinięty DNA, pomiędzy rdzeniami linkerowy (łącznikowy) DNA do niego jeszcze doczepiony histon H9.

U człowieka nić DNA ma ok. 2 m długości i zwinięta jest w 23 parach chromosomów

Całkowita długość 46 chromosomów metafazowych wynosi tylko 200 mikrometrów.

Organizacja genomu eukariotycznego

Nić DNA kondensuje - powstaje włókno nukleosomowe kondensuje - powstaje włókno 30nm które kondensuje - powstaje chromatyna interfazowa, przy podziale kondensuje - skondensowany fragment chromosomu tworzący chromosom metafazowy.

Ile genów znajduje się w ludzkim genomie?

Pierwsze szacunki mówiły o 6 000 000 - 1964 r

potem mówiono o 100 000 - lata dziewięćdziesiąte

teraz mówi się że ilość genów między 20-30 000

Mamy ilość genów między kurą (ok 16 000 gen) a winogronami (30 000 gen)

Genom człowieka w liczbach

- cały genom człowieka ma ok 3,2 mld par zasad (bp)

- tylko około 1,5% DNA człowieka to geny kodujące białka, reszta to introny (fragmenty genów niekodujące białęk), geny kodujące RNA, sekwencje regulatorowe i DNA, któ¶ego funkcji nie znamy

- Chromosom 1 ma 345 milionów par zasad,chromosom 21 ma a<z 47 milionów par zasad

DNA mitochondrialne (mtDNA)

- mtDNA koduje białka biorące udział w wytwarzaniu ATP;

- występuje zwykle w postaci kolistej dwuniciowej cząsteczki;

- długość mtDNA

mtDNA człowieka 15kb

mtDNA drożdży 78 kb

mtDNA niekt.roślin > 3000 kb

- liczba kopii mtDNA namitochondrium wynosi od kilku u większości organizmów do 30 u pierwotniaków z rodzaju Euglena

Genom mitochondrialny człowieka

mtDNA człowieka koduje informację o syntezie 13 białek związanych z fosforylacją oksydacyjną, 22 rodzajach tRNA, 2 rodzajach rRNA

Genom mitochondrialny jest kulisty, zwarty, jedyną sekwencją niekodującą jest tzw lupa D, wykazuje on dużą zmiennośc więc służy do porównywania pokrewieństwa i datowania filogenetycznego.

DNA chloroplastów (cpDNA)

- cpDNA koduje białka biorące udział w fotosyntezie oraz ekspresji informacji genetycznej (replikacja, transkrypcja, translacja(

- występuje w postaci kolistej

Przeićetna ilość genów na cpDNA wynosi ok. 124 w tym 4 gny kodujące rRNA 30 genów kodujących tRNA 90 genów kodujących białka

Wirusy DNA ssaków

Wirus brodawczaka ludzkiego (HPV) - dwuniciowa, kolista cząsteczka DNA

Wirus SV40 - dwuniciow, kolistacząsteczka DNA - struktura jego genomu przypomina minichromosom pod mikroskopem elektronowym.

Adenowirus - dwuniciowa, liniowa cząsteczka DNA

Eukariotyczne wirusy RNA

Typ wirusa Genom Sposób replikacji Rodzina wirusw Przedstawiciele

Eukariotyczne ssRNA (nić +) RNA → RNA Picornaviridae Rynowirus

wirusy RNA Wirus polio

Wirus pryszczycy

ssRNA (nić -) Coronaviridae Wirus SARS

Rhabdoviridae Wirus wścieklizny

Paramyxoviridae Wirus odry

Wirus świnki

Filoviridae Ebola

Marburg

Retrowirusy

genom stanowi RNA, otoczke stanowi białkowy kapsyd okryty bloną, na tym jeszcze kolce

Retrowirus zawiera enzym zwany odwrotną transkryptazą

po wniknięciu wirusowe RNA w wyniku odwrótnej transkryptazy zostaje przepisane na wirusowe DNA i wtedy rpzenika do jądra i ulega integracji z genomem gospodarza.

Wiroidy - koliste cząsteczki RNA długościok. 240-400 nt, niezawierające genów, nie zamknięte w kapsydac, rozprzestrzeniają się z komórki do komórki jako nagi RNA, np. wiroid łuszczycy kory drzew cytrusowych, hamujący ich wzrost;

Wirusoidy - koliste cząsteczki RNA długości ok. 320-400 nt, niezawierające genów, przemiszczające się z komórki do komórki w kapsydach wirusów pomocniczych → genomy wiroidów i wirusoidów mają autkatalityczną aktywność rozcinania się.

Autokatalityczne cięcie RNA wiroidów i wirusoidów

Genomy są połączone w sposób głowa-ogon, tworzą one pofałdowaną strukturę która może się sama wyciąć bez dodatkowego enzymu -? cięcie autokatalityczne → poszczególne genomy liniowe → cyrkularyzacja

Jak badać subkomórkową lokalizację i funkcje białek ssaczych?

Dlaczego badanie lokalizacji białek może być interesujące?

1. Subkomórkowa lokalizacja → funkcja (błona komórkowa, jądro komórkowe)

2. Zmiana lokalizacji w czasie → fizjologia komórki (transport białek, podział komórki, apoptoza)

3. Zmiana lokalizacji zmieniona czynnikiem zewnątrznym → wpływ antybiotyków

Interakcje między białkami są kluczowe dla każdego procesu zachodzącego w komórce.

Jak możemy badać te interakcjie in vivo?

Jak zobaczyć białka w mikroskopie?

- białko hybrydowe/białko fuzyjne

do DNA kodującego białko dołączamy plazmid kodujący białko fluorescencyjne (restryktaza, potem ligaza) - powstaje cząsteczka hybdrydowa - DNA kodujące badane + DNA kodujące fluorescencyjne → wprowadzamy do bakterii, namnażamy, rozbijamy bakterie, ekstrahujamy gen, wprowadzamy do komórki zwierzęcej, gen ulega ekspresji, widzimy pod mikroskopem świecące białko.

Zaplanowanie eksperymentu

1. Jaki jest cel eksprymentu?

2. Z jakimi biomolekułami będziemy pracować?

3. Charakterystyka źródła materiału biologicznego

4. Jakie techniki będą używane?

5. Charakterystyka komórek z kŧórymi będziemy pracować.

Przygotowanie DNA kodującego białko X

1. Garbage in - garbage out - przygotowanie próbki DNA

2. Izolacja DNA genowego/ plazmidowego (wydajność, czystość, jakość)

3. Liza alkaliczna/kolumienki (zestaw Plasmid Mini)

Genomowe DNA

a) Liza komórki - zniszczenie ściany komórkowe, błony komórkowej → ekstrakt komórek

b) centryfugacja w celu usunięcia resztek komórki → wirowanie ekstraktu kom → na górze mamy DNA, RNA, białka - resztki w osadzie

możemy też mieszać z fenolem i robi się to samo.

Wybór odpowiedniego wektora

- Wektor bakteryjny - plazmid

Plazmidy to pozachromosomowe cząsteczki DNA w komórce bakteryjnej nadające jej dodatkowe funkcję

sekwencja ORI

sekwencja kodująca jakiś gen (np. odporności)

sekwencja polilinkera (sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne → tnące DNA w ściśle określonym miejscu)

Wybór odpowiedniego wektora

- Bakteryjny wektor ekspresyjny

Wektor zawiera sekwencję promotorową rozpoznawaną przez polimerazę DNA

Izolacja plazmidów

Mamy w ekstrakcie liniowe DNA i superskręcone plazmidy → alkalizacja pH do 12.5 z 12.0 → wiązanai wodorowe się niszczą → pH 7.0 → z DNA robi się skręcona masa bo wiązania wodorowe nie odtworzyły się idealnie, plazmidom nic nie jest → wirowanie → na górze superskręcone plazmidy, na dole DNA

Elektroforeza plazdmidu.

Amplifikacja DNA kodującego białko X → reakcja PCR

- woda

- genomowe/plazmidowe DNA

- dNTP

-MgCl2

- polimeraza Taq

- bufor dla polimerazy Taq

Denaturacja

A PCR recation starts with a denaturing step. Samples are heated to 94-96 C for one to several minutes.

Przyłączenie primerów forward and reverse

polimeraza

Cięcie produktu reakcji PCR i wektora enzymami restrykcyjnymi

- DNA

- bufor dla enzymów

-BamHI

Hodowle komórkowe

Hodowle komórek - umożliwia utrzymywanie poza organizmem, czyli in vitro, żywych komórek fragmentów tkanek lub narządów. W powszechnym rozumieniu jest do hodowla zdyspergowanych komórek, rosnących w systemie jednowarstwowym (monolayer) lub w zawiesinie. Termin ten obejmuje hodowle wycinków tkankowych, hodowle narządowe, hodowle komórkowe pierwotne i hodowle linii oraz

Warunki hodowli

- Hodowle komórkowe prowadzi się w odpowiednich naczyniach hodowlanych

Laboratorium obrazowania zywych komórek

- mikroskop konfokalny

Podstawy fluorescencji

Promienie świetlne padają na substancję zdolną do fluorescencji → substancja przechodzi do stanu wzbudzonego → przechodząc do podstawowego emituje światło o mniejszej energii (dłuższa długość fali)

Główne drogi światła w mikroskopii konfokalnej

Źródło światła (laser) → szczelina (do dektora dociera światło tylko z jednej płaszczyzny - zapewnia ostrość obrazu) → światło pada na listro dichroiczne (przepuszcza światło o jednej długości fali - emitowane przez próbkę - inne, jak światło lasera, odbija) → przez obiektyw na preparat → preparat emituje światło, przechodzi ono oprzez lustro dichroiczne i do obiektywu

Odkrycie GFP z Eqora Victoria - wyizolowal ekforynę emitującą swiatło niebieskie pod wpływem jonów wapnia oraz zielone białko fluorescencyjne - emitujące swiatło zielone po pochłonięciu niebieskiego

Ekspresja GFP w E.coli i C. elegans - połączenie DNA gospodarza z DNA kkodującym GFP - powstaje białko hybrydowe (fuzyjne)

Problemy z wild type GFP

Widmo absorpcji podobne do widma emisji

Widmo absorpjci cytotoksyczne (światło o wyk energii)

Skłonność do dimeryzacji

Rozwój i modyfikacje GFP

- pprzez mutacje punktowe - zamiany poszczeŋólnych aminokwasów dały nam białka fluorescncyjne o całej palecie komórek

Modyfikacje GFP

Optymalizacja ekspresji w różnych typach komórek

Optymalizacja właściwości spektralnych - absorpcja bardziej długofalowa, pojedynczy pik

Obserwacje mikroskopowe

Do badanego białka dołączony GFP

- możemy je zobaczyć w jądrze, w cytoplazmie mało

- albo tylko w cytoplazmie, w jądrze nie

- albo tylko w jąderkach

- albo tylko w cytoplazmie i jąderkach etc.

Możemy zaobserwować jak zmienia się lokalizacja białek po dodaniu antybiotyku - gdzieś zanika fluoresecencja, gdzieś się zwiększa, etc.

Składanie obrazu w 3D z wielu płaszczyzn (mikroskop konfokalny zbiera światło tylko z jednej płaszczyzny naraz)

Badanie ruchu organelli przez wybarwianie białek specyficznych dla danych organelli

- mitochondriów, aktyny, chromosomów

Obserwujemy w czasie - robimy zdjęcia w odstępach czasowych.

FRAP - Fluorescence Recovery After Fotobleaching - po potraktowaniu silnym światłem po jakimś czasie białko traci zdolność do fluorescencji (fotowybielanie),

gdzieś kierujemy silny laser, tam chromofor przestaje emitować światło, robi się ciemno - jeżeli cząsteczki białka są ruchliwe to fotowybielone dyfunduja do innych obszarów, a niefotowybielone dyfundują w miejsce gdzie były fotowybielone, świecenie wraca, do tego jest krzywa.

Jeżeli są nienobilne (związane przez coś), nie ma dyfuzji, ruchu.

Czego możemy się dowiedzieć?

- Jak szybko poruszają się białka

- przez jakiś czas białka pozostają związane?

- jaki jest % białek związanych

- jak wpływają substancje

Fotoaktywacja/fotokonwersja.

Konwersja molekuły w jednym rejonie, obserwować dyfuzję do innych rejonów - obserwowanie, jak szybko przemieszczaą się białka

Badanie interakcji między biiałkami - dlaczego kolokalizacja nie wystarcza

rozdzielczosc jest za mała = 200 nm

białka mają 1; 2 nm.

Foerster Resonsnce Energy Transfer

Zrobimy dwa białka fluoresecncyjne, donor i akceptor,

wzbudzamy donor → przekazujeon energie akceptorowi i wraca do podstawowego → akceptor świeci, po czym wraca do podstawowego

Donor nie świeci, zachodzi to przy oldegłości < 10nm.

Widmo emisji donora musi się pokrywać z widmem akceptora

Standard do FRETa zestaw add gena Cerulean Venus

FRET - Zasada fotowybielania akceptora

Mamy donor i akceptor, energia d idzie do a, wybielamy akceptor i donor odżywa, zaczyna świecić.

Ekspresja informacji genetycznej

U prokariota

Fragment DNA (gen - ciągły) zawieszony w cytoplazmie ulega transkrypcji i powstaje mRNA, mRNA ulega translacji i powstaje białko.

U eukariota

W cytoplazmie mamy wydzielone błonami jądro, w jądrze siedzi DNA → jednostka transkrypcyjna składa się z intronów (elementy niekodujące - usuwane w trakcie dojrzewania RNA) i eksonów (elementy kodujące - gen nieciągły) → ulega transkrypcji i powstaje pierwotny transkrypt RNA → następuje modyfikacja potranskrypcyjna → dodawanie czapeczki na końcu 5', splicing (wycinanie intronów) RNA, poliadenylacja na końcu 3' → powstaje mRNA z czapeczką na końcu 5' i z poliadenylowanym końcem 3' → następuje eksport tej cząsteczki z jądra a następnie translacja w wyniku której powstaje białko.

Rodzaje chromatyny:

- euchromatyna - luźna, aktywna transkrypcyjnie - jasna na elektrogramie, bardziej w środku jądra

- heterochromatyna - skondensowana, brak transkrypcji - ciemna na elektrogramie, skupiona bliżej błony jądrowej

Mechanizmy regulujące dostęp do genów:

- metylacja DNA

- modyfikacja post-translacyjna histonów

- kompleksy remodelujące

- warianty histonów (zmiana histonów)

- niekodujące RNA, ncRNA

chromosom → chromatyna → składa się z nukleosomów → cytozyny w DNA pod wpływem enzymów metylotransferaz mogą ulec metylacji

histony mogą zaś zostać metylowane, fosforylowane, acetylowane.

Transkrypcja możliwa

- chromatyna aktywna

- brak metylacji cytozyn

- acetylacja histonów

Transkrypcja zahamowana

- chromatyna skondensowana

- metylacja cytozyn

- deacetylacja histonów

Obie formy mogą w siebie przechodzić w zależności od potrzeb organizmu (ścisła regulacja)

Remodelowanie chromatyny - modyfikacja lub zmiana położenia nukleosomów w procesie zależnym do energii z ATP.

Mamy 3 ściśnięte nukleosomy (histony: H2A, H2B, H3, H4) nawinięte na nie ściśle DNA + remodeler chromatyny (kompleks białkowy) + ATP → zapętlanie, ślizganie, uwalnianie → pozycja otwarta przesunięta, pozycja otwarta stara, stara zamknięta pozycja

Może też nastąpić wymiana histonów.

Transkrypcja

- synteza RNA na matrycy DNA, katalizowana jest przez polimeraznę RNA zależną od DNA.

- synteza RNA zachodzi zawsze w kierunku od końca 5' cząsteczki RNA do jej końca 3'

- tylko jedna nić DNA jest transkrybowana,

- DNA wyznacza kolejność w jakiej reszty nukleotydowe zajmują swoje miejsce w powstającym polirybonukleotydzie, dzięki komplementarności zasad.

Nić kodująca, sensowna 5' - 3', non-template strand.

Nić antysensowna, niekodująca 3' - 5'

Te dwie nici są ze zobą połączone wiązanami wodorowymi - potrójnymi między cytozyna a guaniną, potrójnymi między adeniną a tyminą. → transkrypcja, rozplątujemy nici DNA, polimeraza doczepia się do nici antysensownej i na tej matrycy syntetyzuje z komplementarnych do niej nukleotydów nić RNA → powstaje RNA o kolejności nukeotydów takiej samej jak w nici sensownej tyle że tymina zastąpiona uracylem.

Tworzenie wiązania fosfodiestrowego w trakcie transkrypcji - znaleźć mechanizm reakcji

Od 3' do 5' matrycy tworzy się nić od 5' do 3' RNA

Jednostka transkrypcyjna - sekwencja DNA rozciągająca się od promotora do terminatora, może zawierać jeden lub kilka genów

DNA 5' - 3' - nić sensowna

3' - 5' - nić antysensowna

upstream - sekwencja powyżej promotora dowsntream - region poniżej promotora

promotor →pierwszy nukleotyd po promotorze+1 region transkrybowany (ulega transkrypcji i powstaje RNA) → terminator

RNA powstałe po transkrypcji taka sama sekwencja jak nić sensowna.

Etapy transkrypcji

- rozpoznanie promotora - związanie polimerazy RNA do obu nici DNA w rejonie promotora (kompleks zamknięty) i rozplecenie DNA w rejonie promotora (kompleks otwarty)

- inicjacja - synteza pierwszych 2- 9 nukleotydów

- elongacja - opuszczenie przez polimerazę RNA promotora i wydłużani łańcucha RNA

- terminacja - zakończenie syntezy RNA

Polimeraza przemieszcza się w tzw. bąblu transkrypcyjnym

Tam gdzie przeszła DNA się zwija na powrót, tam gdzie siedzi polimeraza nić matrycowa i kodująca rozplataja się, syntetyzuje się RNA na nici matrycowej, powstaje hybrydowa helisa RNA-DNA powstającego RNA z nicią matrycową.

Budowa bakteryjnej polimerazy RNA zależnej od DNA

Podjednostki polimerazy bakteryjnej

alfa - składanie enzymu (40kDa)

beta - centrum katalityczne (155 kDa)

beta prim - wiązanie DNA (160 kDa)

omega - utrzymywanie aktywności enzymu (10 kDa)

sigma - rozpoznawanie promotora (32-90 kDa)

Holoenzym: dwie podjednostki alfa, jedna beta, jedna beta prim, jedna omega, jedna sigma.

Czynniki sigma

sigma70 - podstawowy czynnik E.coli zaangażowany w rozpoznawanie promotorów genów ulegających konstytutywnej transkrypcji

sigma32 - rozpoznaje promotory genów kodujących białka szoku termicznego

sigma54 - syntetyzowany przez Klebsiella pneumoniae w czasie głodu azotowego, stymuluję ekspresję genów asymilacji azotu

sigmaF i sigmaE - syntetyzowane przez Bacillus subtilis, stymulując ekspresję genów niezbędnych do utworzenia spor

Promotor rozpoznawany przez czynnik sigma70 E.col

TTCACA …..........16-18 pz...........TATAAT...........5-8pz.......CG/AT

sekwencja -35 sekwencja -10 + 1

sekwencje zgodne promotorów E.coli (najbardziej zachowawcze sekwencje zaznaczono tłustym drukiem)

Terminacja transkrypcji u E.coli

Terminacja z udziałęm terminatora samodzielnego

DNA 3' - 5' - nić matrycowa

5' - 3'

→ mamy sekwencję odwróconego palindromu (czytaną tak samo od 5 do 3, jak i od 3 do 5), umożliwiającą oddysocjowanie polimerazy od kompleksu transkrypcyjnego a potem AAAA

→ transkrypcja odwróconego palindromu daje RNA o strukturze spinki do włosów - jednoniciowe, potem dwuniciowe, między tym wiązania wodorowe - dalej, przy końcu 3' same uracyle

Dalej nie pójdzie, spinka do włosów się tworzy i nie zrobi się hybrydowa helisa (?), wiązania też są słabe do dalej idą same pary A-U - kompleks się rozpada, polimeraza się odlącza

Terminacja zależna od Rho

(kiedy mamy słabszy palindrom, ale nie mamy samej sekwencji A-U potem

do RNA dołącza się Rho

→ kompleks elongacyjny zatrzymuje się na pętli spinki do włosów → Rho rozbija wiązania wodorowe między zasadami RNA i DNA.

Dojrzewanie pre-rRNA u E.coli

Pre-rRNA: (tu działa endonukleaza III)-sekwencja 16SrRNA-(III)-tRNA-(III)-sekwencja 23SrRNA(III)(P)sekwencja 5SrRNA (F)

Dojrzewanie pre-tRNA u E.coli

5'- mamy sekwencję dodatkową odcinaną przez RNazę P → sekwencja dojrzała tRNA → sekwencja CCA odcinana przez Rnazę Z → sekwencja odcinana przez RNAzę D

Inhibitory transkrypcji u bakterii

- ryfampicyna - działa na podjednostkę beta polimerazy RNA i blokuje tworzenie pierwszego wiązania fosfodiestrowego

- aktynomycyna D - interkalator, wiąże się do DNA w regionach bogatych w pary G-C, uniemożliwiając wykorzystanie takiego DNA jako matrycy w syntezie RNA.

Polimerazy eukariotyczne w odróżnieniu od bakteryjnej polimerazy RNA nie wiążą się same z DNA.

Każda polimeraza eukariotyczna współdziała z określoną grupą czynników transkrypcyjnych

Tf1 (transcription factor 1) - wspołdziala z polimerazą I

Tf II - współdziała z polimerazą II

Promotor polimerazy I

Inicjacja transkrypcji przez polimerazę RNA I

UBF → TBP - TATA binding protein + trzy cząsteczki TAFs - TBP associated factors → polimeraza RNA I

Polimerazy RNA zależne od DNA (Eukariota)

Polimeraza Transkrybowane geny

Polimeraza RNA I (RNAP I) geny kodujące 25S/28S, 5,8 S i 18S rRNA

Polimeraza RNA II (RNAP II) geny kodujące białka: geny kodujące większość malych jądrowych RNA snRNA, miRNA

Polimeraza RNA III (RNAP III) geny kodujące tRNA, 5S rRNA, U6-snRNA, małe jąderkowe RNA (snoRNA), miRNA

Polimeraza RNA mitochondrialna i chloroplastowa.

Polimeraza RNA I - niewrażliwa na alfa-amanitynę

polimeraza RNA II - bardzo wrażliwa na alfa-amanitynę, kilka-kilanaście nM

polimeraza RNA III - wrażliwa na duże stężenia - 1µM.

Dojrzewanie pre-rRNA

- cięcia endo i egzonukleolityczne

- dodawanie grup metylowych

- przeksztalcanie urydyny w pseudourydynę

- splicing

Metylacja pre-rRNA

C/D snoRNA (ang. small nucleolar RNA)

snoRNA składa się z boxu C, sekwencji komplementarnej do rRNA, boxu D

przyłączają się komplementarne zasady rRNA

powstaje kompleks snoRNA -rRNA

następuje metylacja

kompleks snoRNA-zmetylowane w miejscu komplementarnym rRNA

zmetylowane rRNA odłącza się

Pseudourydylacja pre-rRNA

ACA snoRNA

snoRNA tworzy tu pętle

Introny

gen bakteryjny na dwuniciowym DNA składa się z promotorwa i rejonu kodującgo - są ciągłe

5'->3'

3'->5'

gen eukariotyczny na dwuniciowym DNA jest nieciągły - zawiera promotor i rejony kodujące (eksony) naprzemiennie z rejonami niekodującymi (intronami)

5'->3'

3' → 5'

Typ intronu Miejsce występowania

Introny GU-AG Jądrowy eukariotyczny pre-rRNA

Introny AU-AC Jądrowy eukariotyczny pre-mRNA

Grupa I Jądrowy eukariotyczny pre-rRNA, RNA organellarny

Grupa II Jądrowy eukariotyczny pre-rRNA, RNA organellarny

Splicing pre-rRNA

Zachodzi autokatalitycznie - nie uczestniczy żaden inny enzym białkowy

Bierze udział guanozyna z GTP, GDP, GMP

pre-rRNA 5'-ekson-intron-ekson-3'

guanozyna przyłacza się do kńca 5' intronu i atakuje wiązanie fosfodiestrowe pomiędzy eksonem poprzedzającem a intronem, w wyniku tego ataku wiązanie zostaje przecięte → wolny ekson z grupą OH, intron z dołączoną guanozyną i drugi dołączony ekson

grupa OH eksonu 1 atakuje fiązanie fosfodiestrowe między intronem a eksonem 2, przecięcie tego wiązania, eksony łączą się, intron z guanozyną zostaje wywalony. Intron ostatecznie ulega degradacji.

Ważna jest natywna struktura drugorzędowa i trzeciorzędowa intronu - jest ona bardzo ważna, jeżeli się ją rozplecie za pomocą czynników denaturujących, splicing nie zajdzie.

Splicing pre-rRNA zachodzi w trzech transferach.

Promotor podstawowy dla polimerazy RNA II

Do promotora podstawowego przyłączają się podstawowe (ogólne) czynniki transkrypcyjne (GTFs - ang. general transcription factors) i polimeraza RNA II tworząc kompleks preinicjacyjny.

BRE - Miejsce rozpoznania TFIIB (-37 do -32) - Sekwencja TATA (-31 do-26) - Sekwencja Inr - inicjatora (-25 do +2) - MTE - Miejce Motywu 10 - Rdzenne Miejsce Promotora w dół od sekwencji inicjatora DPE

Elementy regulatorowe

Moduły promotora podstawowego, elementy regulacyjne i enchancery u Eukariota

enhancer elementy regulacyjne BRE-Sekwencja TATA-INR

-1000...-500 -500... -70 +1

Elementry regulacyjne:

Moduły konstytucyjne → Aktywatory konstytutywne

(jeżeli znajdują się przed genem ulegającym przed genem ekspresji konstytutywnie [zawsze])

Moduły odpowiedzi →

Moduły komórkowo specyficzne → aktywatory regulacyjne

Moduły wiążące regulatory rozwoju →

Jeden enhancer - wzmocnienie wielu genów naraz, elementy regulacyjne tylko w odniesieniu do jednego genu

Sekwencja wzmacniająca może aktywować gen działając:

- z dużej odległości

enhancer działa na promotor mimo ze jest od niego oddalony i powoduje wzmocnienie ekspresji jednostki transkrypcyjnej

- niezależnie od orientacji

- poniżej, powyżej genu który aktywuje.

Sekwencje wzmacniające Sekwencje wyciszające

(enhancery) (silencery)

aktywatory represory

koaktywatory korepresory

S. wzmacniająca lub element regulacyjny → aktywator → koaktywator

S. wyciszająca lub element regulacyjny → represor → korepresor

Do enchancera przyłącza się białko aktywatora - wygięcie nici DNA, dołącza się cząsteczka mediatora (koaktywatora) - nić się ugina, kompeks ten oddziaływuje z polimerazą II lub komplekesem promotora TATA-GTFy- pol II

Białka aktywatorowe:

- wspomagają składanie komp;eksu gólnych czynników transkrypcyjnych i polimerazy RNA

- zmieniają strukturę chromatyny

Mediator - most molekularny

- Powszechny u eukariontów - występuje zarówno w drożdżach, jak i u ssaków

- Kompleks 25-30 białek (u ssaków co najmniej siedem różnych kompleksów Mediatora);

- wymagany do transkrypcji większości genów transkrybowanych przez polimerazę II

- bierze udział zarówno w regulacji pozytywnej jak i negatywnej, chociaż powszechnie nazywany koaktywatorem, to jest również korepresorem jak i podstawowym czynnikiem transkrypcyjnym.

Mdiator, oddziaływuje z RNAPII, TFIIF

Modułowa struktura promotora genu ludzkiej insuliny

GC-A5-OCT-E2-A3-CRE-A2

Niektóre czynniki transkrypcyjne mogą uczestniczyć zarówno w aktywacji jaki i represji tranksrypcji

T - hormon tarczycy (ang. thyroid hormone)

TR - receptor hormonu tarczycy (ang. thyroid hormone receptor)

TRE - element odpowiedzi na hormon tarczycy (ang. thyroid hormone response element)

jeżeli TR bez dołączonego T wiąże się z TRE → hamuje transkrypcję

jeżeli TR z dołączonym T wiąże się z TRE (zmiana konfiguracji, mogą się dołączyć cząsteczki koaktywatorów)→ aktywuje transkrypcję

Czynniki transkrypcyjne zbudowane są z kilku domen

Główne domeny czynników transkrypcyjnych to:

- domena wiążąca DNA

- domena transkatywacyjna

Dodatkowe domeny

- dimeryzacyjna

- regulatorowa (wiązania hormony, fosforylacji)

- sygnał importu/eksportu jądrowego

Klasyfikacja białek wiążących (specyficznie) DNA

- we względu na domeny wiążące DNA

HTH (ang. helix-turn-helix, helisa-skręt-helisa)

palec cynkowy (ZF, an.g ZN finger)

domena zasadowa

domena TBP

- ze względu na domeny dimeryzacji

HLH (ang. helix-loop-helix, helisa-pętla-helisa)

zamek leucynowy (LZ, ang. leucine zipper)

- wielu nie daje się sklasyfikować

Domena typu helisa-skręt-helisa (HTH)

- pierwsza zidentyfikowana struktura wiążąca DNA

- dwie alfa helisy połączone ostrym srkętem, pierwsza helisa kontaktuje się ze szkieletem fosforanowym, druga dokładnie pasuje do rowka większego DNA w miejscu występowania specyficznej sekwencji,

- wysoce konserwatywny motyw wiążący DNA występujący w wielu prokariotycznych i eukariotycznych białkach wiążących DNA (represor laktozowy, regulatory

Domena typu palec cynkowy

- palec cynkowy - najpowszechniejsza domena wiązania DNA u Eukariota

- składa się z beta-kartki, za którą następuje ostry skręt i alfa-helisa, atom cynku utrzymują 2 Cys i 2 His (Cys2His2) lub 4-6 Cys (Cys 4-6)

(TFIIIA - dziewięc klasycznych palców cynkowych [Cys2His2]

receptory homonów steroidowych [Cys4-6])

Białko TBP (ang. TATA-binding protein)

- Wiąże sekwencje TATA w promotorach, jest też niezbędne do inicjacji transkrypcji z promotorów pozbawionych TATA;

- wchodzi w skład TFIID, ale także ogólnych czynników dla pol I i pol III RNA;

- pojedynczy peptyd z częścią środkową w formie zgiętej beta-kartki, obejmującej DNA niczym siodło, z dwiema helisami po bokach 'siodła' i na końcach;

- lekko rozkręca helisę DNA i silnie ją zagina

Domena typu zamek leucynowy

- zamek leucynowy - złozony z alfa-helis dwu oddzielnych monomerów, które dimeryzują dzięki leucynom regularnie rozmieszczonym na obu helisach, zawierają też reszty argininy, które przytrzymują szkielet fosforanowy po obu stronach rowka większego

- rozpoznają i wiążą palindromowe sekwencje DNA w rowki większym

- zamykają się na DNA jak para nożyczek prostopadłych do podwójnej helisy

- np. AP1, drożdżowy czynnik transkrypcyjny GCN4, C/EBP (ang. CCAAT enhancer-binding protein)

Regulacja aktywacji czynników transkrypcyjnych

a) brak czynnika: w tkance jeden gen jest niekatywny, bo nie ma czynnika, w tkance drugiej czynnik obecny, migruje do jądra, wiąże się z DNA i aktywuje gen, gen ulega ekspresji

b)czynnik nieaktywny - syntetyzowany jest cały czas w formie nieaktywnej, pod wpływem pewnych bodźcow jest aktywowany, migruje do jądra, wiąże się z DNA, gen staje się aktywny, gen ulega ekspresji

Regulacja aktywności czynników transkrypcyjnych

aktywacja czynnika w wyniku:

związania liganda - niektywny czynnik, nieaktywny gen - wiąże się ligand, czynnik z ligandem zmienia komfornację, wiąże się z genem, gen staje się aktywny.

oddysocjowania od inhibitora - czynnik nieaktywny związany z inhibitorem, po oddyscocjowaniu zmienia konformację, wiąże się z genem, gen staje się aktywny

modyfikacji chemicznej - czynnik nieaktywny,

cięcia prekursora

Inicjacja transkrypcji przez polimerazę RNA II

promotor podstawowy z sekwencją TATA - jednostka transkrypcyjna → start transkrypcji

dołącza się TFIID

TFIID = TBP + TAFs

TBP łączy się z TATA,

TAFsy, białka towarzyszące TBP, dodatkowe białka o masach cząsteczkowych: 250, 150 - wiążą się do sekwencji inicjatorowej, 60, 40 - wiążą się do sekwencji DPE, 110, 80, 24, 30

Kompleks ten łączy się do sekwencji promotorowej, co umożliwia przyłączenie kolejnyczh cyznników, TFIIA i TFIIB, po ich dołączeniu mogą się dołączyć: TFIIF z dołączoną polimerazą RNA II i inne czynniki, także TFIIE i TFIIH

polimeraza RNA II zawiera ogon CTD - największa podjesnotksa polimerazy II mający reszty seryn mogące ulec fosforylacji,

do ogona CTD dołączają się reszty fosforanowe z UTP, ATP, CTP, GTP - przejście ze stadium inicjacji do elongacji, ma on właściwości helikazy - rozplatania DNA → zaczyna powstawac RNA, transkrypcja

Elongacja transkrypcji przez polimerazę II

- podstawowe zasady elongacji transkryptów - takie same dla bakterii i eukariiontów, istotna różnica dotyczy długości transkryptów

- u bakterii transkrypty długości do kilku kpz - czas transkrypcji do kilku minut

- u ekariontów transkrypty do 2400 kpz (liczne introny) - czas transkrypcji do 20 godzin co wymaga dużej stabilności kompleksu transkrypcyjnego

- w jądrze komórkowym przerywaniu i zatrzymywaniu polimeryzacji przeciwdzialają czynniki elongacyjne (np. P-TEFb, Elongina A, ELL, TFIIS).

Dojrzewanie pre-mRNA (hnRNA ang. heterogenous nuclear RNA)

- Tworzenie czapeczki na końcu 5' transkryptu (ang. capping)

- Splicing (składanie pre-mRNA)

- Poliadenylacja końca 3' transkryptu

- Redagowanie (ang. editing)

Budowa „czapeczki”

Gppp + pppN → (transferaza guanylilowa) → GpppN → metylotransferaza guaninowa → 7MeGpppN - czapeczka typu 0 - guanozyna z grupą metylową przy pozycji siódmej guaniny, połączona jest ona wiązaniem 5'-5' trójfosforanowym z kwasem nukleinowym, mRNA

Rola:

- zabezpiecza przed działaniem egzonukleaz

- ułatwia asocjacje miejsca 5' splicingowego z U1 snRNA

- stanowi sygnał transportu do cytoplazmy

- stymuluje inicjację translacji.

Introny w genach człowieka

Gen Długość (kb) Liczba intronów Część genu, którą stanowią introny

Insulina 1,4 2 67

Albumina surowicy 18 13 89

Kolagen typu VII 31 117 71

Dystrofina 2400 48 >99

Budowa intronów GU-AG

Intron

Końcowka 3' eksonu (A/C A G)- intron: 5'GU PuAGU (...) miejsce rozgałęzienia CUPuAPy (...)trakt polipirymidynowy Py rich (…) akceptorowe miejsce składania: NC AG3' koniec 5' eksonu: (G)

Ogólny schemat splicingu pre-mRNA

Pre-mRNA 5'-ekson-intron GU—A—AG- ekson-3'

etap I: adenozyna atakuje GU

tworzy się struktura lassa - wiązanie pomiędzy guanozyną a adenozyną,

wolna grupa OH eksonu poprzedzającego atakuje miejsce splicingowe 3'

dochodzi do połączenia eksonów, lasso zostaje uwalnianie → likwidania rozgałęzienia, degradacja.

Synteza ludzkiego snoRNA U16

Gen dla białka rybosomalnego L1

DNA Egzon - Intron 3' - Egzon

Część intronu przy końcu 3' to sekwencja U16 snoRNA

Transkrypcja

Powstaje pre-mRNA Egzon - Intron 3' - Egzon

Splicing

Powstaje mRNA i lasso intronu

przetwarzanie intronu

powstaje snoRNA - U16 i jakieś nieprzydatne skrawki

Błędy w splicingu

Pominięcie egzonu

Egzon 1 - Intron - Egzon 2 - Intron - Egzon 3

Egzon 2 został wycięty razem z intronami: zostaje Egzon 1 połączony z Egzonem 3

Egzon 1 - Egzon 3

Wybór kryptycznego miejsca splicingu → miejsce w egzonie przypomina koniec intronu, może zostać błędnie rozpoznane

Egzon 1- Intron - Egzon 2(w środku kryptyczne miejsce splicingu)

Lasso tworzy się w miejscu kryptycznego miejsca splicingu i część egzonu od intronu do niego zostaje wycięta wraz z intronem. Powstaje RNA: Zawierajace Egzon 1 połączony z drugą cześcią Egzonu 2

Egzon 1-część Egzonu 2

Rola snRNP w splicingu pre-RNA

snRNP = snRNA (small nuclear RNA) + białka (proteins) - kompleksy

Kompleks angażujący:

5'-Egzon-Intron z przyłączonym U1-snRNP na końcu 5', dalej w miejscu rozgałęzienia (tam gdzie adenozyna) przyłącza się białko, SF1, U2AF dalej gdzie szlak polipirymidynowy, koniec 5'-Egzon-3

Następnie U2-snRNP przyłącza się tam gdzie SF1, do miejsca rozgałęzienia → dochodzi do oddziaływań między U1-snRNP i U2-snRNP → dołączenie się kolejnych kompleksów: U4/U6-snRNP i U5-snRNP → kompleksy te przyciągają się, dochodzi do zbliżenia końca 5' i 3' i miejsca rozgałęzienia → powstaje spliceosom

Rola białek SR w splicingu w pre-mRNA

5'-intron z dołączonymi białkami - eksonow wzmacniacz splicingu (ESE)

Do ESE przyłączają się biała SR → umożliwia to rozpoznanie SF1 i U2AF-om końca 3' intronu: traktu polipirymidynowego, miejsca rozgałęzienia.

Introny AU-AC

- Znalezione jak dotąd w ok. 20 genach u człowieka, roślin i Drosophila

- Ich wycinanie przebiega identycznie z intronami GU-AG

- Odmienny zestaw (?)

Alternatywny splicing

DNA → Exon 1-Intron-Exon 2-Intron-Exon 3-Intron-Exon 4-Intron-Exon 5

pre-mRNA → Exon 1-Intron-Exon 2-Intron-Exon 3-Intron-Exon 4-Intron-Exon 5

Alternatywny splicing: mogą powstać cząsterczki mRNA o kolejności eksonów:

12345 → po translacji powstaje białko A

1245 → po translacji powstaje białko B

1235 → po translacji powstaje białko C

Różne warianty białka to izoformy

Możliwości alternatywnego splicingu RNA:

- wycięcie lub pozostawienie intronu - jeden intron zostaje i staje się eksonem

- wycięcie lub pozostawienie eksonu - jest wyjebywany z przylegającym intronem

- wzajemne zastępowanie eksonów - wycina się eksony z intronami i zamienia eksony miejscami

- alternatywne miejsce splicingu - wycinane jest np. pół intronu - działa jak kryptyczne miejsce splicingu, tyle że nie jest to proces patologiczny.

- trans-splicing - łączone są ze sobą eksony pochodze pierwotnie z 2 różnych cząsteczek RNA.

Poliadenylacja końca 3' mRNA eukariotycznego

Pre-mRNA: 5'-(...) - AAUAAA - CA - GU - 3'

Składanie kompleksu poliadenylującego:

Do miejsca AAUAAA dołącza się CPSF, do CA-polimeraza poli(A), na nią siadają białka: PABP, CstF siada na dinukleotyd GU, koniec 3' jest zbędny i zostaje odcięty - wszystko za nukleotydem CA

Poliadenylacja:

poliadenylowane mRNA: 5'- (…) - AUAAAA - CAAAAAAAAAAAA, polimeraza poli(A) dołącza kolejne adenozyny, na niej siedzi białko PAPB

Tworzenie końca 3' mRNA histonów

Sygnały cięcia:

trzon o długości 6 pz - 4-nukleotydowa pętla - ok. 12 nukleotydów - CAAGAAAGA - 3'

Cięcie z udziałem U7-snRNA

U7-snRNA ma sekwencję CUUUCU, która dołącza się do GAAAGA - (? dalej jest coś czego nie rozczytałam przy przepisywaniu, sorry ?) - reszty adenylowe nie są dodawane

Redagowanie mRNA

procesy powodujące zmianę informacji kodowanej w cząsteczce mRNA

Funkcje redagowania

- tworzenie nowych kodonów start lub stop

- usuwanie kodonów stop

- tworzenie ramek odczytu

- zmiany w kodowanych aminokwasach

1. Mechanizm konwersji zasad

deaminacja:

cytozyna + H₂O → urydyna + NH₃

adenozyna + H₂O → inozyna + NH₃

bądź aminacja_;

Redagowanie transkryptu apolipoproteiny B

kodon #1...gen apolipotroteiny B...kodon #4564

Edycja zachodzi w kodonie #2153 CAA

Transkrypcja zachodzi tak samo w wątrobie i jelicie, następnie:

a) w wątrobie - mRNA nie ulega edycji → po translacji powstaje apolipoproteina B-100; 4562 aminokwasy

funkcja: transport cholesterolu w krwi

b) w jelicie - niezedytowane mRNA ulega edycji RNA - na skutek tego kodon #2153 CAA (=Gln) ulega wymianie na UAA (=STOP) → pod wpływem translacji powstaje apolipoproteina B-48, 2152 aminokwasy, funkcja: absorpcja lipidów z jelita.

Mechanizm redagowania poprzez insercję/delecję nukleotydów

Pan-editing - readagowanie na wielką skalę (mitochondria pierwotniaków)

Dodawanie lub usuwanie U - bierze w tym udział guideRNA, gRNA, które wiąże się z pre-mRNA, naznacza on miejsce w pre-mRNA gdzie ma dojść do zmiany, tam działa endonukleaza, następnie działa

- egzonukleaza - wycina U

- UTP + TUT-aza (transferaza) → dodaje U

Następnie następuje sklejenie porozczinanych kawałków.

Od DNA do mRNA - struktura eukariotycznego mRNA

DNA: promotor->ekson1-intron1-ekson2-intron2-ekson3 (sekwencja ulegająca transkrypcji - gen podzielony intronami: od eksonu1 do eksonu2)

Transkrypcja

pierwotny transkrypt:

ekson1( zawiera kodon aug - start dla translacji)-intron1-ekson2-intron2-ekson3(zawiera kodon uga, uag lub uaa - stop translacji)

Dojrzewanie mRNA

Dojrzały mRNA: Czapeczka(m⁷G)-5'UTR(region 5' nie ulegający translacji)-część eksonu1od kodonu start (aug)-ekson2-część eksonu3 od kodonu stop (uga, uag, uaa)-3'UTR(region 3' nie ulegający translacji)-AAA-AAA(ogon poli[A])

Struktura bakteryjnego mRNA:

5'UTR-Białko1-Białko2-Białko3-UTR3'

Przed genem kodującym każde białko oddzielne miejsc startu translacji.

Promotor polimerazy III

- geny dla 5S rRNA wewnątrz sekwencji kodującej - Box A, Box C

- geny dla tRNA wewnątrz sekwencji kodującej - Box A, Box D

- gen dla U6-snRNA - PSE i TATA, pod sekwencją kodującą

Inicjacja transkrypcji przez polimerazę RNA III

Gen dla tRNA

A-Box, B-Box → dołączają się czynniki TFIIIC → dolącza się TFIIIB: kompleks z 3ech białek: TBP, BRF, B^cośtam → dołącza się on przed A-Boxem, dołącza się polimeraza III

Dojrzewanie pre-tRNA

Modyfikacja chemiczna nukleotydów

Urydyna → rybotymidyna (T)

Splicing pre-tRNA

Splicing tRNA oddzielnych aktywności nukleazy i ligazy. Wiązania ekson-intron są wycinane przez nukleazę, tworząc 2', 5'-cykliczny fosforan i koniec 5'-OH.

Terminacja transkrypcji genów eukariotycznych

- terminacja transkrypcji genów grupy I

(?znowu nie mogę doczytać?) dołączenie się PTRF powoduje oddysocjowanie polimerazy i transkryptu od matrycy DNA

- terminacja transkrypcji genów grupy II - związana z poliadenylacją końca 3' transkryptu

- terminacja trankrypcji genów grupy III - transkrypt odcinany przez polimerazę

Inhibitory transkrypcji w komórkach eukariotycznych:

a-amanityna - wiąże się do RNAPII w pobliżu centrum katalitycznego, jest nieodwracalnym inhibitorem, gdyż uruchamia degradację największej podjednostki RNAPII do której się wiąże (inhibitor bardzo selektywny ale powoli działający)

aktynomycyna-D - interkalator, wiąże się się do DNA w regionach bogatych w geny G-C uniemożliwiają wykorzystanie takiego DNA jako matrycy w syntezie RNA (inhibitor szybko działający, malo selektywny)

DRP-(5,6-dichloro-1-beta-Ribo-furanosyl-Benzimidazole) - hamuje elongację transkrypcji katalizowaną przez RNAPII, ponadto upośledza dojrzewanie rRNA (inhibitor szybko działający lecz mało selektywny)

Flavopiridol - jw.

Tryptolid - izolowany z rośliny Trypterygium wilfordii (?polskiej nazwy nie doczytam?) stosowanego w tradycyjnej medycynie chińskiej hamuje inicjację transkrypcji prowadzoną przez RNAPI i RNAPII.

Model kompleksu poru jądrowego (NPC ang. nuclear pore complex)

- cytoplazmatyczne filamenty - dołączone do cytoplazmatycznego pierścienia

- cytoplazmatyczny pierścień w zewnętrznej błonie

- spoke-ring assembly (?) - kompleks poru jądrowego, w błonie jądra (transbłonowy)

- na środku pierścień środkowy - łączy poszczególne elementy

- w środku pierścienia środkowego centralny transporter - transbłonowy, centralny kanał (? dalej nie mogę rozczytać?)

- do wewnętrznej błony jądrowej zakotwiczony pierścień jądrowy

- do tego doczepiony jądrowy koszyk (kosz)

NPC kręgowców zbudowane są z około 30 różnych białek z nukleoporynami, które występują w 8 lub 16 (czasem nawet 32) kopiach na NPC

Nukleoporyny (nups) podzielono na trzy klasy

FG - zawierają domeny bogate w powtórzenia Phe-Gly zaangażowane w translokację receptorow transportu

nukleoporyny pozbawione domen FG; stanowią elementy strukturalne NPC

nukleoporyny należące do białek błonowych, zakotwiczają NPC w blonie jądrowej.

Transport przez kompleks poru jądrowego

Transport aktywny:

RNA/białko rozpoznawane i wiązane z receptorami transportu → wiązanie kompleksu transportu z NPC i translokacja przez kanał centralny → uwolnienie RNA/białka z kompleksu transportu

Przejście przez poryny wiąże się z dostarczeniem energii (rozkładem GTP)

Karioferyny - pojedyncza rodzina receptorów transportu

- importyny

- eksportyny

Rozpoznają bezpośrednio lub pośrednio z udziałem cząsteczek adaptorowych (?) krótki peptyd sygnalny na transportowanym białku tj. sygnał lokalizacji jądrowej (NLS - ang. nuclear localization signal) lub sygnał eksportu jądrowego (NES - ang. nuclear export signal)

Jądro: Ran-GDP → ^{RanGEF (Ran-GDP-exchange factor)} → Ran-GTP

Cytoplazma: Ran-GTP → ^{RanGAP (Ran-GTPase-deactivating protein)} → Ran-GDP

Karioferyny - specyficzne receptory transportu przez błony jądrowe: eksportyny i importyny, wymagają białka Ran z GDP/GTP, w jądrze przewaga Ran-GTP, w cytoplaznie przega Ran-GDP

Import

Białka które są transportowane do jądra posiadają sekwencję NLS, czyli miejsce lokalizacji jądrowej, sekwencja ta wiąże się z importyną, powstaje taki kompleks transportu, przechodzi on przez kompleks poru jądrowego do jądra

Do kompleksu bialko-importyna w jądrze przyłącza się Ran-GTP - oddyscjowanie białka, importyna połączona z Ran-GTP powraca poryną do cytoplazmy

W białku działa Ran GAP (hydrolaza GTP związanego z Ran) daje energię do rozdysocjowanie kompleksu

Eskport

Białka ma sekwencję NES (sygnał eksportu jądrowego) - sekwencja ta łączy się z eksportyna i z bialkiem Ran-GTP, tworzy się potrójny kompleks, przechodzi przez porynę w cytoplazmie białko Ran GAP, rozdysocjowanie eksportyny, białka, Ran-GDP + Pi. Eskportyna przechodzi z powrotem przez por jądrowy.

Szlaki eksportu RNA

tRNA → przetwarzanie, dojrzewanie i wiązanie z czynnikami transportowymi → wiązanie z exp-t i Ran-GTP, przez pory przechodzą do cytoplazmy

mRNA → przetwarzanie, dojrzewanie i wiązaniez czynnikami transportowymi → wiązanie z exp-5 i Ran-GTP → transport przez por do cytoplazmy

snRNA → przetwarzanie, dojrzewanie i wiązanie zczynnikami transportowymi → wiązanie z białkami CBC, PHAX, CRM1, Ran-GTP - transport przez por do cytoplazmy.

mRNA - nie wymaga białka Ran-GTP → przetwarzanie, dojrzewanie i wiązanie z czynnikami transportowymi → mRNA przechodzi przez por jako kompleks białkowy, do tego dowiązują się inne białka

Mechanizmy transkrypcyjnej i potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów przy udziale RNA

Regulacja ekspresji genów przy udziale ryboprzełączników (ang. riboswitch)

Ryboprzelącznik- ustrukturyzowany fragment mRNA, znajdujący się na końcu 5' w częscie nie ulegającej translacji (nie zawierającej sekwencji kodującej białko. Ma on dwa fragmenty: aptamer, mogący wiązać specyficzny ligand i platformę ekspresyjną. Wiązanie ligandu w aptamerze powoduje zmianę w platformie ekspresyjnej tak, że transkrypcja nie zachodzi.

A - hamowanie tranksprypcji - jeżeli aptamer nie ma związanego ligandu, platforma ekspresyjna tworzy struktura zwaną anty-terminatorem - spinka do włosów w dół, nie przeszkadza to w transkrypcji

jeżeli aptamer zwiąże ligand, anty-terminator przekształca się w terminator, spinka do włosów w górę, transkrypcja nie zachodzi

B - hamowanie translacji - w platformie ekspresyjnej siedzi RBS - białko wiążace rybosom, tak dowiązuje się rubosom i rozpoczyna translację

jeżeli ligand wiąże się z aptamerem zmiana konformacji RNA tak że RBS staje się niedostępne dla rybosomu - translacja nie zachodzi.

Regulacja przy udziale ryboprzełączników wiążących TPP (pirofosforan tiaminy) - niezbedna substancja dla metabolizmu cukrowego

mRNA - białka wiążące TPP (receptory) są wiązane przez mRNA związane z syntezą i transportem TPP, jeżeli TPP jest obficie w po|zywce wtedy synteza własnego bylaby stratą energii, dlatego mamy mechanizm hamujący wtedy transkrypcje.

Jeżeli stężenie TPP jest małe - komórka musi dosyntetyzować → mRNA 5'-ryboprzełącznik z aptamerem i miejscem wiązanie rybosomu, dołącza się rybosom, translacja regionu kodującego, wtedy gen działa → zwiększa się poziom TPP, dolącza do ryboprzełącznika (aptameru) - miejsce wiążące rybosom niedostępne - translacja nie zachodzi, gen wyłączony.

Mechanizmy potranslacyjnej represji genów przez ncRNA w komórkach bakteryjnych.

Mamy mRNA z miejscami wiązania rybosomu, przyłączają się rybosomu, jeżeli jest tam snRNA wiąże się z sekwencją RBS - 'przykrywają ją' - uniemożliwiając wiązenie rybosomów, jeżeli takie snRNA się dowiąże to zaraz wpada Rnasa (E, III) i tnie mRNA powodując jego degradację.

Interferencja RNA - mechanizm kontroli ekspresji genów u Eukariota

Interferencja RNA (RNAi) to zachowawczy ewolucyjnie mechanizm wyciszenia ekspresji genów przez małe cząsteczki RNAo długości ~ 20-30 nukleotydów

Funkcją maszynerii RNAi jest m.in. ochrona genomu przed wirusami, hamowanie przemieszczania się do transpozonow wewnątrz genomu, regulacja aktywności genów.

Historia odkrycia interferencji RNA

Pierwszych dowodów na wyciszanie RNA dostarczyły w 1990 roku badania zespołu R. Jorgensena nad modyfikacją koloru kwiatów petunii

Wprowadzenie transgenu - dodatkowej kopii genu syntazy chalkonowej - syntaza chalkonowa odpowiedzialna za produkcję antyocyjanów - myslał, że więcej genów będzie powodowało nadekspresję i ściemnienie kwiatów - wynik nietypowy, czesci kwaitów pstrokata purpurowo- biała a część w ogóle biała.

Sytuację, w której wyciszeszniu ulega zarówno własny gen jak iw prowadzony nazywamy kosupresją.

S. Guo i K. Kemphues użyli antysensownego RNA aby specyficznie inaktywować gen zwany par-1 u Caenorhabditis elegans (1995 r)

Dna → na jego matrycy mRNA -> do niego dołącza się komplementarny antysensowny framgent RNA → rybosom nie może się po tym fragmencie przesuwać → translacja nie zachodzi.

Caenorhabditis elegans

Pierwszy podzial zygoty w trakcie embriogenezy jest asymetryczny → odpowiada za to gen PAR-1.

Wprowadzenie antysensownego RNA kinazy PAR-1 spowodowało zanik aktywności tego białka. Pierwszy podział był symetryczny.

Ku zaskoczeniu badaczy ten sam efekt obserwowano po wprowadzeniu sensownego RNA! - a miala to być próba kontrolna.

Przełom w wyjaśnieniu teg zjawiska - badania Andrew Fire'a i Craiga Mello opublikowane w Nature w 1998 r.

C. elegans typu dzikiewgo→ mutageneza delecyjna genu unc-22 → fenotyp twitcher (kurczenia ciała_ spowodowany unieczynnieniem genu unc-22 (delecja unc-22), co powoduje utrate kontroli nad mięśniami, stąd nazwa unc od ang. uncoordinated

po wprowadzeniu sensownego RNA - brak efektu

po wprowadzeniu antysensownego RNA → brak efektu

po otrzymaniu dwuniciowego (ds) RNA → fenotyp twitcher.

Analiza ilościowa mRNA genu unc-22

Tam gdzie nie było efektu fenotypu ilośc mRNA była stabilna i zbliżona do typu dzikiego

Tam gdzie był twitcher mRNA było na bardzo niskim poziomie lub niewykrywalne

Wniosek: dsRNA powoduje wyciszenie endogennego genu - nazwano do zjawisko interferencją.

Wnioski płynące z badań nad C. elegans.

- Mechanizm RNAi jest bardzo specyficzny (wprowadzony do komórki dsRNA) o sekwencji odpowiadającej fragmentowi endogennego genu, wycisza tylko ten mRNA);

- dsRNA musi zawierać sekwencje odpowiadające dojrzałemu mRNA aby wywołaś efekt RNAi (dsRNA zawierający sekwencje intronowe lub promotorowe nie wywołuje odpowiedzi);

- wyciszenie przebiega postranskrypcyjnie, prawdopodobnie na terenie cytoplazmy;

- do wywołania RNAi wystarczy obecność zaledwie kilku cząsteczek dsRNA, co gueruje działanie mechanizmu amplifikujacego cząsteczki dsRNA i/lub katalitycznego

- RNAi może być przydatnym narzędziem w genomice funkcjonalnej organizmów eukariotycznych.

W jaki sposób dwuniciowe cząsteczki RNA wywołują wyciszanie docelowego mRNA?

A. J. Hamilton i D.C Baulcombe, jako pierwsi (1999r.) pokazali, że w potranskrypcyjne wyciszanie genów u roślin (PTGS) są zaangażowane krótkie, 25-nukleotydowe dsRNA

Mechanizm interferencji RNA - badania nad Drosophila melanogaster

dsRNA - obcy dwuniciowy RNA bedący składnikiem RNA → muszki potrafią go zniszczyć.

Bierze w tym udział występująca u eukariotów rybonukleaza Dicer → dsRNA jest cięte na siRNA i inaktywowane

siRNA - małe, interferujące RNA, dwadzieścia kilka nukleotydów, specyficzne, dwa końce niezwiązanie na nici jednej z jednej strony, dwie z drugiej - lepkie końce

Dolączają się białka - argonauta i inne, tworzy się RISC (an.g RNA-induced silencing complex)

siRNA zostaje rozwinięte, jedna nić zostaje pocięta czyli zdegradowana,a druga wiąże się z komplementarnym RNA i powoduje jego degradację, tną nam to nukleazy gdzie jest zaznaczone siRNA.

Proces RNAi przebiega w szczegółach nieco inaczej u roślin, grzybów, bezkręgowców i kręgowców. Odpowiednio też u roślin proces ten często nazywa się potranskrypcyjnym wyciszaniem genów - PTGS (ang. postrtranscriptional gene silencing), tłumieniem genów u grzybów (ang. quelling) i RNAi u zwierząt.

Obecnie wiadomo, że małe RNA są kodowane przez genomy eukariotyczne. Ze względu na mechanizm biogenezy i typ białek Argonaute (Ago) z któryi są zasocjowane dzielimy je na trzy klasy:

- siRNA (~21 nt): endo-siRNA i exo-siRNA

→ oddziałuja z białkami Ago

- miRNA (microRNA, ~22nt)

- piRNA (~24-31 nt) - RNA oddziałujące z białkami Piwi

miRNA - regulatory ekspresji mRNA w komórkach zwierzęcych i roślinnych

- Regulują ekspresję genów poprzez hamowanie ekspresji mRNA (uważa się, że ekspresja ok. 10-30% genów kodujących białka w komórkach zwierzęcych jest regulowana przez miRNA)

- odkryte w 1993 roku (lin-4 u C.elegans)

Biogeneza miRNA

w jądrze mamy geny je kodujące, czasem są to introny, RNA pol II/II transkrypuje, mamy pri-mikroRNA → tniemy, powstaje pre-mikroRNA, eksportyna 5 i Ran-GTP dowiązuje sie, transportowane do cytoplazmy → cięcie Dicerem w kompleksie z TRBP

Zasady oddziaływania miRNA - mRNA

Sekwencja kodująca - koniec 3' UTR - koniec poliadenylowy,

Do fragmentu 3' UTR dołącza się miRNA w kompleksie białkowym na zasadzie komplementarności - komplementarność pełnia u roślin, u zwierząt tylko niektóre nukleotydy (od 2 do 8 nukleotydu i potem znowu)

Wyciszanie ekspresji genów

a) transkrypcyjne wyciszanie genów (ang. transcriptional gene silancing - TGS) → modyfikacja chromatyny ->brak transkryptu RNA

b) potranskrypcyjne wyciszanie genów (ang. post-transciptional gene silencig-PTGS)

- zahamowanie translacji

- degradacja mRNA

RNAi jako narzędzie badawcze

Jeżeli wprowadzimy dwuniciowe RNA i wyciszymy dany gen możemy po obserwacji fenotypu wnioskować o jego funkcji

gotowe wektory ekspresji RNAi → do jądra, tam powstaje RNAi, możemy tez od razu zsyntetyzować RNAi de novo w wyniku syntezy chemicznej i wprowadzić do komórki gotowe

Zastosowanie technologii malych RNA w rolnictwie

wyciszanie genów sluży do eliminacji elrgenów z orzeszków ziemnych

kontrola szkodników,

Zastosowanie technologii małych RNA w terapii chorób u człowieka

Schorzenie Etap

AMD (starcze zwyrodnienie plamki) II faza badań klinicznych

Cukrzycowy obrzęk plamki (DME) II faza badań klinicznych

RSV (wirus zapalenia oskrzeli) II faza badań klinicznych

Aktywacja RNA (ang. RNA activation, RNAa)

Pierwsze doniesienie o istnieniu mechanizmu RNAa - 2006r. → aktywacja ekspresji genów za pośrednictwem małych dsRNA zwanych saRNA (ang, small activating RNA) → saRNA są komplementarne do pewnych regionów promotorowych DNA i aktywują transkrypcję DNA ok. 10-krotnie

Biologia molekularna nowotworu

* onkos (z greckiego) - masa, guz; logos - nauka → ONKOLGIA

* nowotwór (łac. nieoplasma) - nieprawidłowy i nadmierny rozrost tkanki ustroju, nieskoordynowany z pozostałymi tkankami, trwający mimo ustapienia czynnika, który go wywołał.

Nowotwór łagodny - komórki rozrastające się tworzą pojedyczny guzek, otorbiony, który powiększa stopniowo swój rozmiar i rozpycha okoliczne tkanki, nie dając przrzutów. Takimi nowotworami są np. tłuszczaki, wywodzące się z tkanki tłuszczowej. Występują w tkance podskórnej pod postacią miękkich, ruchomych guzków.

Nowotwor złośliwy - nowotwór rozrastający się w sposób naciekający - wnika między komórki prawidłowej tkanki. Nie ma wyraźnej granicy między nowotworem złośliwym a łagodnym.

* rak - nowotwór złośliwy wywodzący się z tkanek nabłonkowych - skóry, płuc , piersi, trzustki, wątroby, innych narządów, jest najczęściej spotykanym nowotworem złośliwym; w literaturze anglosaskiej i popularnie synonim nowotworu złośliwego (ang. carcinoma)

* mięsak - rodzaj nowotworu złośliwego, który powstaje z tkanki mięśniowej, tłuszczowej i chrząstki

*chłoniak - nowotwór złośliwy powstający wukladzie limfatycznym

Nowotwór złośliwy miejscowo - mają niektóre cechy nowotworów złośliwych, ale nie dają przerzutów, lub mają histologiczne cechy nowotworu łagodnego a często dają nawroty. Należą do nich:

- rak podstawnokomórkowy skóry

- większość glejaków złoźlwych mózgu

- guz mieszany ślinanek

Nowotwór jest chorobą o podłożu genetycznym rozwijający się w wyniku zmian w różnych genach o charakterze:

- mutacji - dotyczą następujących genów

* protoonkogeny (mutacja powoduje ich aktywację - onkogeny)

* geny supresorowe (mutacja powoduje ich inaktywację)

* geny naprawy DNA (mutacja powoduje niestabilność genetyczną)

* geny microRNA (mutacja powoduję zmianę ekspresji białek)

- zaburzeń epigenetycznych, np. hipermetylacji genów

Mutacje genowe zwiększające ryzyko rozwoju nowotworu

a) dziedziczne

b) nabyte

- spontaniczne

- działanie czynników środowiskowych

Pojedyncza mutacja nie powoduje transformacji nowotworowej

Zmiany Zwiększona ilość Wzrost polipa Wzrost złośliwego

komórkowe: podziałów komórkowych guza (carcinoma)

Zmiany Zaktywowany gen supresorowy drugi gen

DNA: onkogen guza supresorowy

zinaktywowany guza zinaktywowany

Nowotów nie jest chorobą dziedziczną, dziedziczą się predyspozycje do zachorowania.

Predyspozycje genetyczne można podzielić na

- predyspozycje silne - związane z dziedziczonymi od rodziców zmianami (najczęściej mutacjami) w genach supresorowych i genach naprawy DNA

Nazwa zespołu Gen Typ nowotworu

Zespół siatkówczaka RB1 siatkówczak, mięsaki

Polipowatość gruczolakowata jelit APC rak jelita grubego, kostniaki

Zespół Blooma BLM białaczki, chłoniaki

i gruczolakoraki układu

pokarmowego

Zespół Li-Fraumeni TP53 mięsaki, glejaki, rak piersi, rak

kory nadnerczy

Dziedziczny niepolipowaty rak jelita grubego, trzonu

rak jelita macicy, moczowodu

i miedniczki nerkowej

Etapy karcynogenezy

Przekształcanie się komórki prawidłowej w nowotworową nazywamy transformacją nowotworową. To złozony proces w którym można wyodrębnić cztery etapy

ETAP I

Preinicjacja

Ekspozycja na karcynogeny: chemiczne, fizyczne, biologiczne

Chemiczne: związki alkilujące, barwniki akrydynowe, wielkopierścieniowe węglowodory aromatyczne

Fizyczne: promieniowanie UV

Biologiczne: wirusy (HPV, Epstein Barr, HCV typu B, Herpesvirus)

bakterie (Helicobacter pylori)

Trwa całe życie

ETAP II

Inicjacja

Ngromadzenie zmian prowadzących do transformacji

Trwa od kilku do 20-30 lat

Tor mutacyjny

Predyspozycje genetyczne

ETAP III

Promocja

Selekcja klonalna

Nowotwór in situ

Trwa zwykle do kilku lat

Etap III nieleczony zawsze przechodzi w ETAP IV

Progresja

Dalsza selekcja mutacji

Nowotwór nabywa zdolność do przerzutowania

Trwa od kilku miesięcy do kilku lat

„Nowotwory złośliwe w Polsce w 2011 roku”

http://www.onkologia.org.pl/

Spośród 100 typów nowotworów rozpoznawanych każdego roku, zaladwie kilka stanowi aż 60 proc. wszystkich zachorowań.

U mężczyzn dominuje rak: pluca (20 proc.), gruczołu krokowego (14 proc.), jelita grubego (7 proc.), pęcherza moczowego (7 proc.) oraz żołądka (5 proc.)

U kobiet dominują rak: piersi (23 proc.), płuca (9 proc.) , trzonu macicy (7 proc.), jelita grubego (6 proc.), jajnika (5 proc.)

Rak zaczyna powstawać wówczas, gdy komórka wyłamuje się z mechanizmów regulujących jej podziały i degradację.

Cykl komórkowy a transformacja nowotworowa

M (profaza, metafaza anafaza, telofaza) → G0 - zatrzymanie podziałów i końcowe róznicowanie

Czas trwania cyklu komórkowego

Typ komórek Czas trwania cyklu komórkowego

Komórki embrionalne żaby 30 minut

Komórki drożdży piekarniczyc 1,5- 3 godziny

Komórki nabłonka jelit ~ 12 godzin

Ssacze fibroblasty

Układ kontroli cyklu komórkowego „włącza” replikację i mitozę oraz sprawdza, czy poprzedni etap cyklu został zakończony, czy komórka jest w pełni przygotowana do następnego etapu

Punkty kontrolne cyklu komórkowego - punkty kontrolne G1 i G2.

Programator cyklu komórkowego: M → G1 → S → M

wejście w fazę S - punkt kontroli G1:

czy środowisko jest sprzyjające?

czy DNA jest uszkodzony?

Kontrola cyklu komórkowego oparta jest na zmianach w aktywnościa kinaz zleżnych od cyklin Cdk (ang. cyclin - dependent kinase)

U ssaków poszczególne etapy cyklu komórkowego są regulowane przez cztery różne kinazy zależne od cyklin

Kompleks cyklina-Cdk Cyklina Partner Cdk

G1-Cdk cyklina D* Cdk 4, Cdk 6

G1/S-Cdk cyklina E Cdk 2

S-Cdk cyklina A Cdk 2

M-Cdk cyklina B Cdk 1

* U ssaków są 3 różne cykliny D

Cykliny są pozytywnymi regulatorami kinaz zależnych od cyklin, a ich poziom zmienia się w czasie cyklu komórkowego.

Do pełnej aktywności Cdk niezbędna jest fosforylacja aktywująca

Cdk + cyklina + CAK (kinaza aktywująca) →kompleks CAK-Cdk → aktywny kompleks Cdk-cyklina

Aktywność Cdk może być hamowana przez fosforylację oraz przyłączanie białek inhibitorowych.

Cdk ufosforylowana jedną resztą fosforanową - aktywna, tworzy kompleks z cykliną, może być jeszcze ufosforylowana fosfatazą Cdc25 i wtedy jej aktywność jest zahamowana - druga reszta fosforanu dziala hamująco. Podwójnie ufosforylowana Cdk może być zdefosforylowana do formy aktywnej przez kinazę Wee1

Aktywność Cdk jest regulowana przez degradację cyklin.

Połączenie różnych Cdk z cyklinami uruchamia kolejne zdarzenia w komórce

* Zaburzenia w transmisji sygnałów wzrostu - onkogeny

(pedał gazu w samochodzie się zaciął wciśnięty!)

* utrata zdolności do rozpoznawania sygnałów antywzrostowych - geny supresorowe

(hamulce przestaly działać)

* zaburzenia w systemach naprawy DNA - geny stabilizujące

(mechanik nic nie warty!)

Protoonkogeny - stymulują wzrost komórek → nadmierna aktywność → onkogeny → powstanie nowotworu

DNA protoonkogenu

a)mutacja w genie onkogenu → hiperaktywne białko w normalnej ilości

b) zwielokrotnienie kopii genu → normalne białko w nadmiarze

c) gen przenoszony do nowego locus na DNA pod innymi mechanizmami kontroli - nowy promotor → normalne białko w nadmiarze

Onkogen jest dominujący w stosunku do swojego prawidłowego allela.

Funkcje białek kodowanych przez protoonkogeny

- czynniki wzrostowe np. PDGF (ss)

- receptory czynników wzrostu

np. receptor EGF (erbB)

↓

Src(src) - Ras (ras)- Raf(raf)

- kinazy białkowe lub białka aktywujące kinazy białkowe, cdk

- cykliny - białka które kontrolują cykl komórkowy np. cyklina D

Geny supresorowe (anty-onkogeny) hamuja rozwój komórek → mutacje powodujące zmianę funkcji → powstawanie nowotworu

* do powstania nowotworu dochodzi, gdy dwie niezależne mutacje unieczynniają oba allele supresora

* o „predyspozycji genetycznej” do nowotworu mówimy, gdy jeden z dziedziczonych alleli jest już uszkodzony

* dwa najlepiej scharakteryzowane geny supresorowe nowotworów to geny kodujące białko p53

Białko p53 „strażnik genomu”

przed zmianą genomu → foton UV → po - dimery tymidynowe

→ aktywacja p53 w komórkach opalonej na czerwono skóry → dwa możliwe efekty:

* zahamowanie cyklu komórkowego

* naprawa DNA umożliwia wznowienie cyklu komórkowego

lub

* apoptoza

* komórka umiera

Mechanizm regulacji cyklu komórkowego przez p53 punkcie restrykcyjnym G1/S

promienie X → uszkodzenie DNA → aktywacja kinazy białkowej i fosforylacja p53:

Mdm² + p53' → Mdm² + aktywne, stabilne p53

(w przypadku, gdy do uszkodzenia DNA nie dochodzi, p53' nie jest fosforylowane i ulega degradacji w proteasomach)

Aktywne p53 wiąże się do regionu regulatorowego genu p21

Transkrypt genu p21 + aktywne p53 → translacja genu p21 → powstaje p21 (inhibitor białka Cdk)

Ufosforylowane,aktywne G1/S - Cdk i S-Cdk + p21 → nieaktywne, skompleksowane z p21 C1/S-Cdk i S-Cdk

Apoptoza - prgramowana śmierć komórki

Etapy apoptozy:

kondensacja chromatyny i kurczenie się komórki → fragmentacja DNA → rozpad jądra → tworzenie ciałek apoptotycznych

Infekcja a nowotworzenie

Bakterie:

- Helicobacter pylori (rak i chłoniak żołądka)

- Chlamydia (chłoniaki)

- Fusobacterium nucleatum (rak jelita grubego i odbytu)

Pasożyty:

- przywra krwi (rak pęcherza moczowego)

- motylica wątrobowa (rak przewodow żółciowych)

Wirusy:

-Epstein Barr Virus (chłoniak Burkitta, rak nosogardła)

- HPV 16, 18, 31, 33 (rak szyjki macicy, sromu, pochwy, jamy ustnej i gardla)

- HHV-8 (mięsak Kaposiego)

- Hepatitis B i C (rak wątrobowokomórkowy)

- HTLV-1, HIV

Wirus brodawczaka ludzkiego (HPV) a nowotwór

E7 → pRB/E2F - blokowanie zajścia w fazę S cyklu komórkowego

Jeżeli ten mechanizm zawiedzie mamy do czynienia z nieprawidłową proliferacją komórki → reaguje białko p53 - kontrola cyklu komórkowego, apoptoza

Jeżeli nie zadziała ono na E6 w kompleksie w E6-12 → wydłużona proliferacja komórki → wtedy E6 + C-Myc → HERT → powoduje skracanie telomerów - starzenie się komórki, jeżeli jednak telomery nie skracają się mamy do czynienia z immortalizmem komórki

Mürger K et al. J. Viral 2004

Cechy komórki nowotworowej

- samowystarczalność w zakresie sygnałów wzrostu (proliferacji)

- ignorowanie sygnałów hamowania proliferacji

- unikanie apoptozy - samobójstwa komórki

- angiogeneza

- inwazja (?) tkanek i przerzutowanie

- nieograniczony potencjał replikacyjny - nieśmiertelność

Przyczyny powstawania nowotworów

- obecnie nie można z całą pewnością określić przyczyny większości nowotworów

- epidemiolodzy uważają, że 31% (?) nowotworów u ludzi wywołują czynniki środowiskowe

- narażenie na czynniki rakotwórcze musi trwać przez wiele lat, aby postępująca dysplazja uległa przemianie nowotworowej

- niektóre wyjątki

a) białaczki indukowane promieniowaniem jonizującym - 2 lata

b) nowotwory wieku dziecięcego - uw. genetycznie

Diagnostyka molekularna

Poznanie mechanizmów molekularnych prowadzących do rozwoju nowotworu przyczyniło się do powstania testów umożliwiających:ocenę ryzyka zachorowania

ocenę przebiedu choroby i ustalenia prawdopodobieństwa nawrotu choroby po zabiegu

Testy mogą być wykonywane w próbkach materiału biologicznego: pobrnego pod pacjenta (fragment guza, próbka moczu czy krwi) w materiale archiwalnych (blok parafinowy)

* markery prognostyczne - wskazują na przewidywalny przebieg naturalny choroby i rokowania

* markery predykcyjne - markery, których obecność jest związana z prawdopodobieństwem uzyskania korzyści (najczęściej - obiektywna odpowiedź na leczenie)

* markery ryzyka - dają możliwość oszacowania ?

Markerem biochemicznym jest dowolna substancja wielkocząsteczkowa umożliwiająca odróżnienie komórki prawidłowej od nowotworowej (najczęściej białko adhezyjne lub empatyczne)

* specyficzne dla pewnych komórek ale w prawidłowych warunkach nieobecne w dorosłym organizmie (albo w danej tkance): AFP, CEA

* obecne w prawidłowych komórkach, ale w mniejszym stężeniu niż wykrywalne

Pożądane cechy idealnego markera

- wysoka czułość i wysoka swoistość - czułość testu - zdolność do wykrycia nowotworu (np. czułość rzędu 80% - badanie wykrywa chorobę u 8 na 10 chorych, 20% wyników - test fałszywie ujemny)

Markery biochemiczne - CEA, ang. carcinoembryonic antigen

Glikoproteina, produkowana w życiu płodowym przez przewód pokarmowy, wątrobę i trzustkę.

Podwyższony w:

- raku jelita grubego ( u 2/3 pacjentów wzrost CEA - pierwsza oznaka choroby)

- innych chorobach rozrostowych ( w 30-50%): raku piersi, torbielakogruczolakoraku jajnika, gruczolakoraku szyjki macicy

- także: u palaczy, w przebiegu POChP, w chorobach zapalnych jelita grubego, zapaleniu wątroby, marskości wątroby, niewydolności nerek

- także: u 3% zdrowej populacji

35

---