Seminarium dr Kowalska

Badanie cytogenetyczne

Orientacyjnymi wskazaniami do badania cytogenetycznego są:

• kliniczne objawy aneuploidii

• zaburzenia różnicowania płci

• translokacje i aneuploidia w rodzinie pacjenta

• niezdefiniowane zespoły wad rozwojowych

• progeria z nadwrażliwością na mutageny

• niektóre typy nowotworów

• trwałe zaburzenia płodności i wczesne poronienia samoistne powtarzające się po wykluczeniu innych przyczyn

• odstępstwa od typowego rodowodu chorób jednogenowych

Choroby genowe (tzw. mendlowskie) o typowym rodowodzie nie są wskazaniem do badania cytogenetycznego!

Inne przypadki będą badane po indywidualnym uzgodnieniu.

Przygotowanie i wykonanie badania:

• Badanie należy wykonać możliwie przed diagnostyką rtg i farmakoterapią.

• Nie należy wykonywać badania w trakcie i bezpośrednio po infekcjach.

• Należy pobrać 5 ml (0,5 ml noworodki) krwi na przygotowany przez pracownię podkład, dostarczyć możliwie szybko. W ostateczności przechowywać do 12 godz. w temp. 0-4°C. Nie zamrażać!

• Krew pobierać w zamkniętym układzie do strzykawki. Przed wstrzyknięciem do pojemnika wyjałowić korek. Wprowadzić do pojemnika nową igłą.

Zakażenie hodowli uniemożliwia uzyskanie wyniku!

Aktualnie stosowana i uprzednia terapia, diagnostyka (kiedy?, jaka?) - zwróc uwagę na rtg, cytostatyki, immunosupresanty, inne potencjalne czynniki mutagenne Czynniki ryzyka genetycznego w środowisku życia pacjenta Pochodzi z ciąży…powikłanej/ niepowikłanej. Rodzice pacjenta zdrowi/chorzy Dzieci pacjenta zdrowe/ chore Zaburzenia prokreacyjne u pacjenta Wady rozwojowe i niedorozwój umysłowy w rodzinie Inne uwagi Podpis lekarza kierującego

Materiał … pobrany dn. … godz. … przez … Skierowanie do badania cytogenetycznego Pacjent (imię, nazwisko) Rozpoznanie kliniczne Główne objawy Cel badania Oddział i lekarz kierujący Nr hist. choroby … data …

Hodowla materiału in vitro trwa 3-4 dni, obróbka fotograficzna 14 dni

• wyniku należy oczekiwać po ok. 3 tyg.

• w sporadycznych przypadkach nie można w sposób powtarzalny uzyskać od pacjenta nadających się do oceny płytek metafazalnych

• w indywidualnych przypadkach możliwe jest po uzgodnieniu badanie innego materiału (fibroblasty, łożysko, płód, itp.)

Uzyskiwane tkanki do badań prenatalnych w zależności od zastosowanej techniki diagnostycznej

Technika	Uzyskiwany materiał
Fetoskopia Amniopunkcja Biopsja kosmówki	Krew, skóra Płyn owodniowy, komórki płynu owodniowego Komórki trofoblastu

Pierwsza litera oznacza typ prążkowania, druga ogólną technikę, trzecia - barwienie

Q	Q-Bands
QF	Q-Bands by fluorescence
QFQ	Q-Bands by fluorescence using quinacrine
QFH	Q-Bands by fluorescence using Hoechst 33258
G	G-Bands
GT	G-Bands by trypsin
GTG	G-Bands by trypsin using Giemsa
GAG	G-Bands by acetic saline using Giemsa

C	C-Bands
CB	C-Bands by barium hydroxide
CBG	C-Bands by barium hydroxide using Giemsa
R	R-bands
RF	R-bands by fluoresence
RFA	R-bands by fluoresence using acridine orange
RH	R-bands by heating
RHG	R-bands by heating using Giemsa
RB	R-bands by BrdU
RBG	R-bands by BrdU using Giemsa
RBA	R-bands by BrdU using acridine orange

Symbols used for karyotype description

p	Short arm
q	Long arm
pter	tip of the short arm
qter	tip of the long arm
cen	Centromere
h	Heteromorphism
del	deletion
der	derivative of a chromosome rearrangement
dic	dicentric
dup	duplication
i	isochromosome
ins	insertion
inv	inversion
mat	maternal origin
pat	paternal origin
r	ring chromosome
t	translocation
::	Breakage with reunion
/	mosaicism
+/-	Before a chromosome number indicates gain or loss of that whole chromosome
+/-	Before a chromosome number indicates gain or loss of par of that chromosome

G-Banding

R-Banding

Q-Banding

C-Banding

Silver NOR stain

Healthy Female

Healthy Male

Przykłady aberracji liczbowych chromosomów

Kariotyp	Omówienie
92, XXYY 69, XXY 47, XX, +21 47, XY, +18 47, XX, +13 47, XX, +16 47, XXY 47, XXX 45, X 49, XXXXY	Tetraploidia Triploidia Trisomia 21 Trisomia 18 Trisomia 13 Trisomia 16 Zespół Klinefeltera Trisomia X Zespół Turnera Wariant zespołu Klinefeltera

Down syndrome: the most frequent chromosomal abnormality
Frequency: 1 of 680 born infants

Wiek matki	Zespół Downa
20 30 35 40 45	1:1420 1:1140 1:360 1:100 1:30

Typy aberracji chromosomalnych w zespole Downa

47, +21 47, +21 / 46 mozaicyzm Translokacje Robertsonowska 46, -14, +rb (14;21) 46, -21, +rb (21;21) 46, -15, +rb (15;21) 46, -13, +rb (13;21) 46, -22, +rb (21;22)

90% 3% 2% 1.5% 0.5% 0.5% 0.2%

Note flat facial features, epicanthal fold and broad depressed nasal bridge

Objawy kliniczne:

• Hipotonia 100%

• Niedorozwój umysłowy 100%

• Wrodzone wady serca (ubytki międzyprzedsionkowe, międzykomorowe 40%

• Częste infekcje

• Atrezja dwunastnicy, choroba Hirschsprunga 5%

• Choroba Alzheimera po 3 dekadzie życia 100%

• 20-krotny wzrost zachorowania na białaczkę (gł. AML)

• Niepłodność u mężczyzn, zmniejszenie płodności u kobiety (ryzyko urodzenia chorego potomstwa 50%

• Długość życia: 50-60 lat

• Częste odczyny białaczkowe

Badania prenatalne:

• Amniocenteza

• Biopsja kosmówki (CVS)

• Poziom AFP w surowicy matki

• Ultrasonografia

Wskazania

• Wystąpienie zespołu Downa lub innych zaburzeń chromosomowych w poprzedniej ciąży

• Stwierdzenie nosicielstwa translokacji chromosomalnej u 1 z rodziców

• Zaawansowany wiek matki

47 XX+18

47 XY+18

(zespół Edwardsa)

Częstość 1/5000

rzadko translokacyjny

rzadko mozaika

Objawy:

okres prenatalny:

• w większości przypadków dochodzi do poronienia w I trymestrze

• II trymestr USG: IUGR - opóźnienie rozwoju wewnątrzmacicznego, wady serca, przepuklina pępowinowa

noworodek:

• wydatna potylica

• mała bródka

• małe i nisko osadzone uszy

• wady serca

• głębokie upośledzenie

• wady nerek i innych narządów wewnętrznych

• zaciśniete piastki z zachodzącymi palcami 2 i 5

• wydatne pięty

• 90% umiera do 1 roku

Trisomia 18

• Częstość występowania

• Występuje 1 na 3000 żywych urodzeń

• Związek z wiekiem matki

• Cechy kliniczne

• Masa ciała niska

Dysmorfii:

• Charakterystyczny kształt czaszki z małą bródka wypukłą potylicą

• Nisko osadzone i zniekształcone małżowiny uszne

• Zaciśnięte w pięści dłonie

47 XX+13

47 XY+13

(Zespół Patau)

Częstość 1/5000

20% translokacyjny

5% mozaika

Objawy:

okres prenatalny:

• w większości przypadków dochodzi do poronienia w I trymestrze

• II trymestr USG: IUGR - opóźnienie rozwoju wewnątrzmacicznego, wady serca, nieprawidłowa linia środkowa mózgu, przepuklina pępowinowa, wady twarzoczaszki

noworodek:

• ubytki skóry na czaszce

• hipoteloryzm (niedokonany podział mózgu)

• dodatkowe palce (zaciśnięte piąstki)

• letalne wady serca

• głębokie upośledzenie

• mikroftalmia

• rozszczep wargi i podniebienia

• nieprawidłowy kształt i osadzenie uszu

• wydatne pięty

• wnętrostwo

• nadmiar skóry na karku

• 90% umiera do 1 roku

Trisomia 13

• Częstość występowania

• Występuje 1 na 5000 żywych urodzeń

• Zależy od wieku matki

• Cechy kliniczne dysmorfii:

• Hipoteloryzm będący odzwierciedleniem ukrytej holoprosencefalii

• Małoocze, rozszczep wargi I podniebienia

• Nieprawidłowe małżowiny uszne

47 XXY

(zespół Klinefeltera)

Częstość 1/800-1000

15% mozaika

Objawy:

• trudny do rozpoznania

• małe miękkie jadra u starszych chłopców (upośledzone wytwarzanie testosteronu)

• słaby rozwój wtórnych cech płciowych (hipogonadyzm)

• ginekomastia

• wydłużone kończyny

• skolioza

• rozedma płuc

• cukrzyca

• osteoporoza

• wzrost ryzyka raka sutka

• łagodne opóźnienie rozwoju u dzieci

• bezpłodność ( w przypadkach mozaikowych może być zachowana)

Trisomia 47, XXY (zespół Klinefeltera)

• Częstość występowania

• Występuje 1 na 1000 urodzeń chłopców

• Zależy od wieku matki

• Cechy kliniczne

• Najczęstsza przyczyna hipogonadyzmu i bezpłodności u mężczyzn

• Dysmorfii:

• Jądra są małe

• Testosteron poniżej poziomu

Trisomia 47, XXX

• Częstość występowania

• Występuje 1 na 1000 urodzeń dziewczynek

• Ma wpływ wiek matki

• Cechy kliniczne

• Prawidłowe

• 15-20% ma cechy upośledzenia umysłowego w stopniu lekkim

Monosomia 45, X0 (zespół Turnera)

• Częstość występowania

• Występuje średnio 1 na 5000 urodzeń dziewczynek

• Cechy kliniczne

• Stwierdza się u niego nadmiar skóry w okolicy karku oraz obecnostść obwodowych obrzęków limfatycznych

• Niskiego wzrostu lub pierwotnego braku miesiączki

• Klatka piersiowa jest szeroka

• Szyja może być płetwiasta

Triploidia

• Częstość występowania

• Występuje w 2% wszystkich poczęć

• Prowadzi do wczesnych poronień samoistnych

• Donoszenie ciąży jest wyjątkiem

• Cechy kliniczne

• Noworodek ma niską urodzeniową masę ciała

• Niepropocjonalnie mały tułów w stosunku do rozmiarów głowy

• Liczne wady wrodzone

Mozaicyzm

25 % komórek 47, XY + 20

75% komórek 46, XY

Karyotype	Comment
46, XY, t(5:10) (p13:q25) 46, XX, t(13:14) (p11:q11) 46, XY, del(5)(p25) 46, X, i(Xq) 46, XX, dup(2) (p13p22) 46, XY, r (3) (p26q29) 46, XY, inv (11)(p15q14)	Balanced reciprocal translocation involving chromosomes 5 and 10 (break pionts indicated) Centric fusion transloaction of chromosomes 13 and 14 Short arm deletion of 5, cri du chat syndrome Isochromosome of Xq Partial duplication of the short arm of chromosome 2 (p13p22) Ring chromosome 3 (p26q29) Pericentric inversion of chromosome 11

A Ring chromosomes

Dicentrics and acentric fragments following exposure to irradiation

B Double ring chromosome 13

Ring chromosome

Wyniki analizy chromosomów w limfocytach krwi obwodowej i fibroblastach skóry

Badana tkanka	Liczba analizowanych komórek	Odsetek komórek
				46, XX	46, XX r (2)	z różnymi aberracjami chromosomu 2
Krew	100	5	78	17
Skóra	50	12	66	22

46, XY t(9;22) (q 34; q 11)

Reciprocal translocation of chromosomes 5 and 10

Reciprocal translocation of chromosomes 10 and 11

Karyotype 46 XX + rcp (1:3) (1 q 32 : 3 p 21-22)

46, XX, t(10,12) (p12:q21)

45, XX, -13, -14, +t rob (13:14)

46, XY, del 5p

46, XX, del 5p

(zespół cri du chat)

region krytyczny - 5p15

w większości przypadków powstają de novo

Objawy:

• okrągła twarz u niemowląt

• płacz przypominający miauczenie kota (z czasem zanika)

• wady serca

• upośledzenie umysłowe

46, XX del (X) (q26::qter)

Isochromosome X

Dicentric isochromosomes for the long arm of the X

Paracentric inversions of chromosome 12

Disorder	Birth Frequency
Balanced translocation Unbalanced translocation Pericentric inversion Trisomy 21 Trisomy 18 Trisomy 13 47, XXY 47, XYY 47, XXX 45, X0	1/500 1/2000 1/100 1/700 1/3000 1/5000 1/1000 males 1/1000 males 1/1000 females 1/10000 females

Częstość anomalii chromosomowych

Ciałko Barra

Ciałko Y

Schematyczne porównanie wyników testów chromatyny X (CHP-X) i chromatyny Y (CHP-Y) z wynikami badań kariotypu.

test CHP-X test CHP-Y

	45 X
	46, XY
	47, XXY
	46, XX
	47, XXY
	48, XXYY
	47, XXX
	48, XXY

Non-disjuction

Mozaicyzm

Cytogenetyka interfazalna (CGH)
FISH do DNA w jądrach interfazalnych

Zalety metody

• Możliwość oceny genomu nic tylko w komórkach metafazalnych

• Ocena genomu komórek niczdolnych do podziału

• Dokładna morfologiczna identyfikacja ocenianych komórek

• Skrócenie czasu badania

• Szerokie zastosowanie w ocenie materiału diagnostycznego w tym archiwalnego

Wady metody

• Rutynowo stosowane utrwalanie tkanek często uniemożliwia wykonanie badania

• Brak możliwości weryfikacji specyficzności sygnału na podstawie lokalizacji w chromosmach

• Możliwośc oceny tylko wybranych fragmentów genomu dla których istnieje sonda

Comparative Genomic Hybridization (CGH)

Porównawcza Hybrydyzacja Genomów

Application

• Study of neoplastic tumors

Material:

• Fresh tissue

• Paraffin blocks

• Needle aspirates

• Microcissected samples

Advantages of the metod

• Possible studies of the archival material from paraffin blocks

• When DOP-PCR- only a few cells are necessary

Limitations of the method

• Heterochromatic regions should be excluded from evaluation

• Ploidy level is undetectable

• False positive detection of losses within 1 p32-pter, 16p, 19 and 22 with DNA indirect labeled

• Evaluation of telomeric regions should be performed with particular caution

Application

• Detection of constitutional unbalance chromosomal abberations

Limitations of the method

• Only unbalance abnormalities are detectable

• Sensitivity (2-10MBp)

• Abnormality detectable if present in at least 35% of the cell population

• Chromosomal structure of abnormality is undetectable

23

---