Ćwiczenie 1

Temat: Klasyfikacja i morfologia bakterii

1. Ogólne zasady klasyfikacji i nazewnictwa drobnoustrojów - pojęcia: rodzina, rodzaj, gatunek, szczep, typ(biotyp, serotyp)

Klasyfikacja drobnoustrojów jest ciągle modyfikowana.

Rodzina = jednostka skupiająca rodzaje

rodzaj
rodzaj = jednostka obejmująca pewną liczbę gatunków o

niektórych cechach wspólnych

gatunek gatunek = obejmuje osobniki mające podobną

postać budowę komórek i in. właściwości

Np.

• Rodzina - Streptococca C

• Rodzaj - Streptococus

• Gatunek - Streptococcus pneumoniae

• Szczep

• Typ

• Serotyp

• Biotyp

• Cechy biochemiczne, serologiczne

• Lekooporność

• Wrażliwość na bakteriofagi

2. Morfologia bakterii - kształty komórek bakteryjnych i ich układ przestrzenny w preparacie mikroskopowym, wielkość bakterii w porównaniu z innymi mikroorganizmami, pojęcie kolonii bakteryjnej, cechy kolonii bakteryjnej (np. wielkość struktura)

Morfologia bakterii

1. komórki bakteryjnej

2. kolonii bakteryjnej

Ad. A)

Morfologię bada się pod mikroskopem, oglądając preparaty bakterii barwione różnymi metodami.

Większość bakterii chorobotwórczych ma wymiary w granicach od kilku dziesiątych do kilku µm. U cylindrycznych stały jest wymiar poprzeczny.

Kształty komórek bakteryjnych

kulisty cylindryczny spiralny

= ziarenkowce pałeczki przecinkowce (p. cholery)

dwoinki głównie G (-) śrubowce

paciorkowce nie wytwarzają krętki (np. krętek blady)

gronkowce przetrwalników

laseczki

głównie G(+)

wytwarzają przetrwalniki

maczugowce G(+)

Gronkowce - G(+)

• wielkość 1-3 nm

• kształt - okrągły

• brzeg kolonii: gładki

• powierzchnia kolonii - wypukła, mleczny/żółty kolor

• układ - skupiskowy

Paciorkowce - G(+)

• kształt - kulisty, owalny

• układ - łańcuszkowy

Pałeczki - G(-) brak przetrwalników

• wielkość - 2-3 nm, krótkie

• kształt - cylindryczne, zaokrąglone końce, grubsze

• brzeg kolonii- gładki

• powierzchnia kolonii - gładka, błyszcząca, wypukła

Laseczki - G(+), wytwarzają przetrwalniki

• wielkość - 3-4 nm, dłuższe

• kształt - cylindryczne, ścięte końce, cieńsze

• brzeg kolonii - nierówny, poszarpany

• powierzchnia kolonii - gładka, matowa

Laseczki

• Bacilius (tlenowce)

• 
  Clostridium (beztlenowce)

Maczugowce - G(+)

1. Kształt cylindryczny, zaokrąglone końce

2. Maczugowato zgrubiałe

3. Układ - litery V, Y, L, X

DDwoinki

a) ułożone w pary

Opis preparatu:

1. Kształt - okrągły, nieregularny

2. Barwliwość - G(+), G(-)

3. Układ - skupiskowy, chaotyczny

4. Wielkość - małe, duże

5. Inne - leukocyty, nabłonki, przetrwalniki, otoczki!

Ad. B)

Kolonia - skupisko bakterii wywodzące się z jednej komórki macierzystej, tj. klon

gdyż materiał genetyczny jest taki sam

Opis:

1. Wielkość kolonii (średnica)

2. Brzegi (równy, falisty), wał brzeżny

3. Wyniosłość, ponad powierzchnię podłoża (płaskie, wypukłe, zapadnięte)

4. Powierzchnia (gładka, szorstka, ziarnista)

5. Wytw. Hemolizyny (α-paciorkowce, β-paciorkowce hemolizują), zapach (jaśmin - P. aeruginose)

Opis kolonii wykonujemy po 24h od nasiewu w warunkach optymalnych. Do badań powinno się wykorzystać hodowlę na pożywkach zwykłych /wzbogaconych a unikać wybiórczych.

3. Budowa komórki bakteryjnej - ściana komórkowa, różnice w budowie ściany komórkowej bakterii Gram(+) i Gram(-), protoplasty, sferoplasty i formy „L” bakterii, błona cytoplazmatyczna, nukleoid, plazmidy, otoczki (glikokaliks), rzęski, fimbrie, przetrwalniki, materiały zapasowe (ziarna wolutyny), rola poszczególnych elementów budowy komórki bakteryjnej w życiu bakterii oraz w ich chorobotwórczości.

Budowa komórki bakteryjnej:

Procaryota - brak jądra, w zastępstwie występuje 2-niciowe DNA w postaci nukleoidu.

Elementy stałe: ściana komórkowa, błona cytoplazmatyczna, nukleonom

Elementy niestałe: plazmidy, transpozony, otoczki, rzęski, fimbrie, przetrwalniki materiały zapasowe

Ściana komórkowa

• Zapewnia ochronę i nadaje kształt bakterii, nie występuje u mycoplasm.

• Główny składnik strukturalny ściany komórkowej bakterii G(+) i G(-) to mureina(peptydoglikan). Występuje tylko u bakterii

• Bakterie barwiące się Gram(+) wypłukują barwnik, składniki ściany komórkowej tworzą z fioletem krystalicznym i płynem lugola związek trudno rozpuszczalny w alkoholu i nie ulegają odbarwieniu. Mają prostszą, ale grubszą ścianę która składa się z mureiny i kwasu techojowego i tejchouronowego

• Bakterie barwiące się Gram(-) mają cieńszą ścianę komórkową z 2-cząsteczkową warstwą peptydoglikanu i nie zawierają kwasów tejchojowych. Mają dodatkową błonę zewnętrzną oraz LPS(lipopolisacharyd) który składa się z części polisacharydowej(właściwości antygenowe=antygen 0) oraz lipidowej(ciepłotrwała, odpowiedzialna za działanie endotoksyny) - warunkuje wstrzas.

Na skutek innej budowy ściany bakterie odbarwiają się (tracą kompleks) po czym ulegają zabarwieniu fuksyną.

• Usunięcie ściany komórkowej która ochrania błonę cytoplazmatyczną oraz utrzymuje wysokie stężenie wewnątrz komórkowych metabolitów prowadzi do lizy bakterii

• Bakterie Gram(+) - całkowite usunięcie ściany komórkowej prowadzi do wytworzenie protoplastów składających się z błony cytoplazmatycznej i zawartości komórki

• Bakterie Gram(-) - komórki z uszkodzoną ścianą stają się sferoplastami.

• Organizmy nie mające ściany komórkowej = formy „L” mogą powstać w czasie antybiotykoterapii. Te nieprawidłowe formy mogą wywołać utrzymujące się zakażenie, opierając się wpływowi takich antybiotyków, których mechanizm działania polega na zaburzaniu tworzenia się ściany komórkowej. Po zaprzestaniu działania antybiotyku bakteria odbudowuje ścianę.

Błona cytoplazmatyczna

Fizyczna i metaboliczna bariera między wnętrzem komórki bakteryjnej a środowiskiem zewnętrznym. Charakteryzuje się selektywną przepuszczalności, znajduje się tam bakteryjny system transportu elektronów (energetyczny).

Nukleoid

DNA zagęszczony w cytoplazmie, składa się z jednej dwuniciowej kolistej cząsteczki DNA

Plazmid

Pozachromosomalne(pozanukleoidowe) koliste DNA często odpowiada za procesy zjadliwości. Może dzielić się samoistnie lub łącznie z chromosomem. W procesie płciowym bakterii traci cechy genetyczne

Plazmid R,Cdl -warunkuje produkcję fimbrii płciowych

Otoczka - glikokaliks

• Większość zbudowana z wielocukrów, np. S. pneumonia

• Element zjadliwości:

Niektóre zjadliwe bakterie (B. anthracis) mają polipeptydową (d-aminokwasy

są oporne na działanie enzymów proteolitycznych tym samym otoczka taka

zabezpiecza przed fagocytozą)

• Widoczne w łączonym barwieniu negatywnym-pozytywnym(hodowle). Widoczne w barwieniu metodą Grama - Gdy materiał biologiczny to metoda Grama podbarwia również tło.

Rzęski

• Odpowiadają za ruchliwość bakterii

• Zbudowane z: flageliny i ciałka podstawowego(białka)

Fimbrie = pile

• Pojedyncze wypustki zbudowane z białka mające właściwości antygenowe, pokrywają powierzchnię bakterii

• Zwykłe - są antygenem kolonizacyjnym, odgrywają rolę w przyleganiu bakterii do powierzchni błon śluzowych, które jest I etapem kolonizacji i zakażenia gospodarza

• Płciowe - u bakterii Gram(-) biorą udział w zjawiskach płciowych (koniugacji)

Przetrwalniki=spory

• Powstają u laseczek w wyniku sporulacji jako następstwo środków odżywczych i toksycznych

• Są odporne na gotowanie, wysychanie, działanie enzymów. Niszczone przez autoklawowanie

• Ich przetrwanie warunkuje kwas aminopikolinowy i Catt

• W metodzie Grama NIE BARWIĄ się ale są widoczne w postaci niewybarwionych miejsc

• Są wytwarzane w normalnym cyklu oraz umożliwiają przeżycie szczepu w niekorzystnych warunkach (pH, temperatury, wilgotności)

Materiały zapasowe

• Zgromadzone w wodniczkach

• Znaczenie rozpoznawcze, np. ziarna wolutyny u C. diphteriae

• Np. ziarna wolutyny, glikogen, tłuszcz

• Wykrycie w barwieniu Niessnera potwierdza ich obecność (podanie anatoksyny)

4. Sposoby obserwacji drobnoustrojów:

- rodzaje mikroskopów i ich zastosowanie w mikrobiologii:

• Mikroskop świetlny

• Mikroskop z ciemnym polem widzenia

• Mikroskop fluorescencyjny

• Mikroskop kontrastowo-fazowy

• Mikroskop ultrafioletowy

• Mikroskop elektronowy

• Mikroskop skaningowy

- preparaty mikroskopowe i rodzaj barwienia (pozytywne, negatywne, proste,

złożone - metoda Grama)

Barwienie bakterii:

1. Pozytywne - same bakterie ulegają zabarwieniu.

2. negatywne - barwi się jedynie tło, a komórki są niezmienione, używa się barwników nie przechodzących do wnętrza komórki, np. nigrozyna, tusz chiński(barwienia grubodyspersyjne). Ma zastosowanie kliniczne dla Cryptococcus neoformans.

Metody barwienia pozytywnego:

1. proste - użycie jednego barwnika, np. błękit metylowy

2. złożone - użycie kilku barwników, np. metoda Grama

Metoda Grama

G(+) G(-)

Fioletowe Czerwone, różowe

Składniki ściany tworzą z inna budowa ściany powoduje

Fioletem krystalicznym odbarwienie, po czym ulega

i płynem Lugola związek zabarwieniu fuksyną na

trudno rozpuszczalny w czerwono

alkoholu i nie ulegają

odbarwieniu

Wykonanie preparatu barwionego metodą Grama:

1. Wymieszać materiał w probówce za pomocą wirówki lub energicznie pocierając probówkę w dłoniach

2. Opalić ezę. Pobrać materiał

3. Rozprowadzić w jednym miejscu na szkiełku, rozetrzeć ezą.

4. Odłożyć szkiełko, poczekać aż wyschnie

5. Utrwalić - przesuwając szkiełko 3x w płomieniu

6. Barwienie

1. Fiolet krystaliczny 3-4 minuty

2. Płukanie H₂O

3. Płyn Lugola 1-2 minuty

4. Płukanie H₂O

5. Alkohol x3 spłukać

6. Płukanie H₂O

7. Fuksyna 0,5-1 minuty

8. Płukanie H₂O

Ćwiczenie 2

Temat: Fizjologia Bakterii

1. Odżywianie

• Związki chemiczne służące drobnoustrojom jako źródło energii lub materiał budulcowy

• Autotrofy, heterotrofy

• Sposób pobierania i trawienia pokarmu przez drobnoustroje

• Metody hodowli drobnoustrojów:

1. Hodowle tkankowe/komórkowe

2. Hodowle bezkomórkowe(podłoża bakteriologiczne)

• Podział podłóż bakteriologicznych, cechy dobrego podłoża bakteriologicznego

• Warunki hodowli drobnoustrojów

• Wymagania bakterii w stosunku do temperatury (bakterie mezofile, termofilne, psychrofilne)

Metody hodowli drobnoustrojów:

1. Hodowle tkankowe=komórkowe - w nich zachodzi 1 etap życiowy wewnątrz komórki

- wirusy, riketsje

- niektóre bakterie, np. Chlamydia, mycoplasmy

2. Hodowle bezkomórkowe = podłoża bakteriologiczne - hodowla na podłożu sztucznym, np. :

- bakterie

- grzyby

Warunki hodowli - głównie w cieplarkach w 37ºC

Cechy dobrego podłoża bakteriologicznego:

1. Dostarcza substancji odżywczych

2. Zapewnia prawidłowe ciśnienie osmotyczne

3. Zapewnia prawidłowe pH

4. Dostarcza łatwoprzystępnych związków chemicznych (azotany, aminokwasy, jony wapnia i fosforu)

Podział podłóż bakteriologicznych - zależy od % stężenia agaru

• Głównie w przemyśle i zautomatyzowanych metodach diagnostycznych

• Min %

• Do namnożenia szybkiego drobnoustrojów w diagnostyce

• Stosowane w celu namnażania

• Sprzyja wytwarzaniu fimbrii

• Wykorzystywana do badania małej ilości bakterii

• Do uzyskania pojedynczych kolonii (izolacja i różnicowanie) w diagnostyce mikrobiologicznej

• Hamuje powstawanie fimbrii

• Max%

Rodzaje podłóż bakteriologicznych:

1. Podstawowe = zwykłe → GRONKOWCE

1. Płynne - bulion z mięsa

2. Stałe - agar - mięsna płytka

2. Wzbogacone - dla drobnoustrojów wymagających więcej związków odżywczych →paciorkowce

1. Płynne - bulion + Glc /+krew/+surowica

2. Stałe - agar +krew /+Glc/+surowica

3. Wzbogacone - specjalne

1. Agar czekoladowy - zawiera łatwo przyswajalny czynnik V i X dla wzrostu H. influenzae

2. Wrzoska - dla beztlenowców

3. Loefflera - dla maczugowca błonicy

4. Löwensteina - dla prątków gruźlicy

4. Wybiórcze - ulegają zahamowaniu wzrost niepożądanych bakterii podczas gdy poszukiwane mogą się rozwijać wykorzystywane w diagnostyce bakteriologicznej

1. Sabourauda - dla grzybów - niskie pH

5. Różnicujące - rozpoznanie na podstawie różnic we właściwościach biochemicznych bakterii np. zdolność do fermentacji cukrów

6. Wybiórczo-różnicujące - stosowane w diagnostyce mikrobiologicznej zawierają

1. Substancje stymulujące wzrost drobnoustrojów

2. Rozdziela na 2 grupy bakterie

• Podłoże Chapmana

- właściwości wybiórcze - wysokie stężenie NaCl

- właściwości różnicujące - mannitol

- gronkowce

• Podłoże McConkey'a

- właściwości wybiórcze - dezoksycholan sodu

- właściwości różnicujące laktoza

- pałeczki

• Kolonie mannitolo(-) - mają ceglasty kolor (nie odbarwiają podłoża) a mannitolo(+) odbarwiają podłoze

• Kolonie laktozo(-) rosną w kolorze podłoża, a laktozo(+) są koloru różowego

7. Dla bakterii beztlenowych - podłoże zawierające związki obniżające potencjał OX/red czyli zawartość O₂

1. Podłoże płynne - troklikolan sodu

2. Podłoże Tarozziego-Wrzoska

8. Transportowe

1. Tlenowce i względnie beztlenowe

• Podłoże zestaw nr 1

• Podłoże Stuarda

1. Bezwzględnie beztlenowe - np. dla Clostridium powodującego zakażenie rany

• Podłoże Portagem

9. Transportowo-namnażające - posiadają substancje odżywcze potrzebne do wzrostu

1. Gonomedium - dla gronkowców

2. Hemomedium - podłoże płynne dla krwi

3. Meningomedium - dla N.meninigitidis w płynie mózgowo rdzeniowym

4. Uromedium - dla moczu - transportowe








Powyżej 0ºC

20-40 ºC

Głównie chorobotwórcze (przedział temperatur odpowiadający temperaturze organizmu)

>50 ºC




2. Oddychanie

• Modele oddychania w zależności od akceptorów wodoru (oddychanie tlenowe, beztlenowe, fermentacja)

• Wymagania tlenowe bakterii (bezwzględne beztlenowce, względnie beztlenowce, bezwzględne tlenowce, mikroaerofile)

Wymagania tlenowe bakterii




Tlenowe

• Bezwzględne - zahamowany wzrost przy niskiej dostępności tlenu

• Względne - rosną lepiej przy obniżonej zawartości tlenu, ale on sam ich nie zabija

• Mikroaerofile - wymagają tlenu w stężeniu niższym niż atmosferyczne. W związku z tym, w hodowlach płynnych rozwijają się w postaci pierścienia w nieznacznym oddaleniu od powierzchni pożywki (wzrost podpowierzchniowy)

Beztlenowe

• Bezwzględne - w dostępie O₂ wytwarzają toksyczne metabolity, np. H₂O₂ o w wuniku tego giną. Niskie ciśnienie parcjalne O₂ - bo bakterie nie zawierają enzymów niszczących O₂(clostridium)

• Względne - wykorzystują O₂ / związki organiczne




3. Rozmnażanie

• Wzrost populacji bakteryjnej (krzywa wzrostu bakterii)




Krzywa wzrostu:

1. Faza zahamowania początkowego - adaptacji - bakterie przygotowują się do podziałów (indukcja enzymów, łączenie podjednostek rybosomów)

2. Faza wzrostu logarytmicznego - ilość komórek nowopowstałych jest większa niż obumierających. Komórki silnie się namnażają. Najsilniejsze działanie β-laktamów gdyż działają na tworzenie się ściany bakterii dzielących się.

3. faza równowagi - stacjonarna - ilość komórek nowopowstałych = obumierających. Gromadzą się substancje przemiany materii a wyczerpują substancje odżywcze - rozpoczyna się wtedy sporulacja = tworzenie przetrwalników

4. Faza wymierania - stopniowe wymieranie bakterii, toksyczne produkty przemiany materii się gromadzą, brak substancji odżywczych.

4. Zmienność bakterii

• Mutacje (substytucje, insercje, delecje) i właściwości bakterii związane z mutacjami

• Rekombinacja, transformacja, transdukcja, koniugacja

• Rola procesów genetycznych w życiu bakterii

Zbiór genów - genotyp

Cały materiał = genom

Zespół cech = fenotyp

DNA - chromosom, plazmidy, traspozony, bakteriofagi

Mutacje - zmiana DNA powodująca pojawienie się nowej cechy

1. substytucje - zamiana nukleotydu

2. insercje

3. delecje - prowadzą do powstania kodonów stop UAA UAG UGA

4. supresorowe - zmiany kompensujące mutację (zmiany wcześniejsze

5. tylko u bakterii i bakteriofagów - mutacja warunkowo letalna - letalna mutacja występuje tylko w określonych warunkach (np. ograniczony zakres temperatur w której mogą żyć - mutanty wrażliwe na temperaturę żyją w 30ºC a giną w 42ºC

Rekombinacje

1. transformacje - bakteria staje się kompetentna(zdolna do pobrania DNA), pobiera DNA wyizolowany (laboratoryjnie) lub od dawcy (naturalnie), namnaża się

2. transdukcja - przeniesienie materiału genetycznego pryz udziale faga łagodnego, najczęściej odnosi się do bakterii G(+). Odmianą transdukcji jest konwersja lizogenna - C.diphteriae, E.coli, Streptococcus pyogenes.

3. Koniugacja - przeniesienie informacji genetycznej zawartej w plazmidzie, fimbriach płciowych. Najczęściej odnosi się do pałeczek G(-). Nabycie nowej cechy bakterii pozwala przeżyć w makroorganizmie:

1. Warunkuje zdolność wytwarzania czynników toksycznych

2. Nabywa lekooporność

Najczęściej spotykana jest transdukcja i koniugacja.

5. Sposoby przechowywania drobnoustrojów:

• Skosy i słupki agarowe (+4ºC)

• Podłoża z glicerolem (-70 ºC, ciekły azot)

• Liofilizaty (liofilizacja)

Liofilizacja - sztuczne odciąganie H₂O, do przechowywania szczepów wzorcowych

- suszenie materiału biologicznego w warunkach obniżonego ciśnienia i

temperatury niższej od temperatury krzepnięcia wody, dochodzi do

sublimacji wody.

Ćwiczenie 3

Temat: Epidemiologia i zakażenia szpitalne

1. Mechanizmy powstawania zakażenia, toksykoinfekcji, intoksykacji(zatrucia pokarmowego), rodzaje zakażeń(objawowe, bezobjawowe)

Toksykoinfekcje - zatrucie bakteriami, które namnażają się w organizmie gospodarza a następnie obumierają z wydzieleniem endotoksyn. „?” namnożone bakterie których spodziewamy się u chorego, z dłuższym okresie inkubacji. Na przykład: Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae/

Intoksykacje - toksemia, zmiana chorobowa w wyniku działania toksycznych metabolitów drobnoustrojów i/lub pirogennych (np. IL). Obecność jadów (toksyn) w krwioobiegu zwana też toksemią. Zjadanie pokarmu(np. konserwy) w którym namnożone są toksyny bakteryjne. Objawy występują szybko - gorączka, wymioty, biegunka - znikają po 48h. Zatrucie egzotoksyną z krótkim okresem inkubacji. Na przykład: S.. aureus, Cl. Botulinum, Cl. Perfringens

Rodzaje zakażeń:

• Bezobjawowe

• Skąpo objawowe

• Posiadamy krzyżową odporność

• Bierzemy środki zapalne

• Pełnoobjawowe

• Wszystkie objawy kliniczne.

2. Wzajemne relacje między pojęciami.

• Choroba zakaźna - zaburzenie funkcji lub budowy w organizmie gospodarza spowodowane przez namnażające się drobnoustroje które znalazły się w organizmie poprzez zakażenie. Choroba wywołana przez jakikolwiek drobnoustrój chorobotwórczy

• Choroba zaraźliwa - choroba zakaźna, która może się przenosić bezpośrednio lub pośrednio z osoby zakażonej na zdrową

• Zakażenie - wniknięcie i namnażanie się drobnoustrojów chorobotwórczych w organizmie gospodarza. Termin odnosi Się do bakterii, wirusów, grzybów

• Kontaminacja - termin „zakażenie” odniesiony do środowiska(woda, powietrze, gleba), a także do przedmiotów i pożywienia

• Skażenie - obecność bakterii w środowisku(wodzie pitnej)

3. Definicje:

• Epidemia - występowanie większej niż zwykle liczby zachorowań na ograniczonym terenie i w określonym czasie. W większości przypadków zjawia się nagle i mają naturalną tendencję do wygasania - epidemia ma koniec..

• Punktowa - gdy zakażenie pochodzi z jednego źródła

• Postępująca - gdy zakażenie pochodzi z różnych źródeł

Dotyczy tylko drobnoustrojów chorobotwórczych

• Endemia (ognisko endemiczne) - stałe występowania choroby na określonym terenie, przy czym liczba zachorowań utrzymuje się na podobnym poziomie, na terenie endemicznym choroba trwa z mniejszym lub większym nasileniem, nigdy jednak nie wygasa i ma tendencję do łagodniejszego przebiegu wśród miejscowej ludności. Nie ma końca

• Pandemia - wielka epidemia, która obejmuje cały kraj, a niekiedy kilka krajów lub nawet kontynentów(AIDS, cholera, dżuma)

• Ognisko epidemiczne - jest to miejsce w którym znajduje się rezerwuar drobnoustroju chorobotwórczego z całym otoczeniem z którego zakażenie może być przeniesione na ludzi wrażliwych

• Epizoocja - termin analogiczny do epidemii występujący w świecie zwierząt

I Kolejne ogniwa łańcucha epidemiologicznego

1. Rezerwuar zarazka - to środowisko naturalnego pobytu i namnażania się zarazka. Dla zarazków chorobotwórczych jest to głównie człowiek lub zwierzę

Źródło zakażenia - człowiek lub zwierzę (chory lub nosiciel) od którego pochodzi nowy przypadek tej samej choroby. Jest nim zawsze organizm żywy, w którym zarazek rozwija się i ulega namnożeniu

Nosicielstwo - stan równowagi immunologicznej między drobnoustrojem a zakażonym organizmem - drobnoustrój chorobotwórczy namnaża się w organizmie ale nie działa patogennie(takie nosicielstwo jest najniebezpieczniejsze)

- jest to związek zachodzący między drobnoustrojami chorobotwórczymi a organizmem człowieka, o charakterze komensalizmu z jednej strony i zakażenia bezobjawowego z drugiej. Polega na bytowaniu drobnoustrojów - bez objawów chorobowych - w miejscach gdzie mogą być wykrywane i skąd mogą się rozprzestrzeniać

• Stałe - występowanie określonych patogennych drobnoustrojów przez wiele lat/miesięcy na skórze lub błonach śluzowych

• Przejściowe = intermitujące - występowanie nosicielstwa określonych gatunków drobnoustrojów chorobotwórczych z przerwami.

• Pochorobowe = zdrowienia = okresu wylęgania - ozdrowieńcy, którzy chorowali, a w okresie rekonwalescencji wydzielają drobnoustroje(zakażenie objawowe przechodzi w bezobjawowe) np. dur brzuszny

• Utajone - nosiciel zdrowy, nie chorował, bez objawów chorobowych, ale obecne u nich zarazki chorobotwórcze i podwyższone przeciwciała, np. WZW typ A

Kolonizacja - zasiedlenie, zajęcie niszy ekologicznej przez bakterie w żywym organizmie bez objawów choroby. Podobne do nosicielstwa utajonego ale robi to flora naturalna i osiedla się w miejscach gdzie normalnie nie bytuje, np. kolonizacja gardła noworodka przez E. coli

Kontrola nosicielstwa w środowiskach zawodowych.

1. nosicielstwo salmonelli - personel medyczny, rzeźników, sprzedawców, kucharzy

2. nosicielstwo gronkowców - personel medyczny

2. Drogi zakażenia (rodzaje) - jest to sposób w jaki zarazek chorobotwórczy zostaje przeniesiony ze źródła zakażenia na osobnika wrażliwego

• Bezpośrednia

• Kontaktowa - zetknięcie sicze źródłem zakażenia, wszelki dotyk, pocałunki, stosunki płciowe(nawet 5s) ukąszenia, zadrapania, drogi rodne przy porodzie

• Łożyskowa - zarazek zostaje przeniesiony poprzez łożysko od matki do płodu. Znaczenie dla zakażeń wirusowych, kiły, toksoplazmozy

• Pośrednia

• Kontaktowa - poprzez przedmioty i materiały z którymi styka się chory, a następnie osoby ulegające zakażeniu, np. droga pokarmowa, ręcznik

• Powietrzna - zarazki wydalane w trakcie kaszlu, kichania, mówienia, itp., utrzymują się w powietrzu w kropelkach śluzu w postaci tzw. Aerozoli zakaźnych, które są wdychane i powodują zakażenie

Przenosiciele (rodzaje) - organizmy przenoszące zarazki

• Czynni - w których zarazek rozmnaża się (np. wesz w durze plamistym) lub przechodzi cykl rozwojowy (np. komar z malarią)

• Bierni - zarazek jest przenoszony mechanicznie na łapkach, tułowiu (np. mucha przenosi czerwonkę)

• Czynno - bierni ?

3. Osobnik wrażliwy - osobnik którego odporność jest obniżona i może ulec zakażeniu drobnoustrojami, które u normalnych ludzi zdrowych nie wywołują choroby, a u niego rozwinie się proces chorobowy

- osobnik o osłabionym układzie odporności nie sczepiony, np. osoby starsze, dzieci, noworodki, niemowlęta

Warunki zaistnienia oraz przebieg choroby zakaźnej

• Wrota zakażenia - miejsce wniknięcia drobnoustroju do organizmu, na przykład błony śluzowe układu oddechowego, pokarmowego, moczowego, płciowego, spojówki, uszkodzona skóra

• Okres wylęgania - inkubacja - czas od momentu wniknięcia drobnoustroju do organizmu do momentu wystąpienia objawów choroby. Wiele tych objawów to efekt obronny organizmu przed drobnoustrojem a nie działania drobnoustroju. Okresy inkubacji rózne i nie zawsze ściśle określone, na przykład:

• Kiła - 24-30 dni

• Cholera - 1-5 dni

• Czerwonka 2-7 dni

Warunki do zaistnienia choroby:

• Przenieść się na organizm gospodarza

• Pozbawić/osłabić jego zdolności obronne

• Zaatakować i namnożyć się w tkankach, a następnie wytworzyć toksyny lub inne czynniki warunkujące zjadliwość

• Być zdolnym do przeżycia mimo działania mechanizmów odpornościowych

Choroba zakaźna może się szerzyć tylko gdy istnieją 3 ogniwa:

Źródło zakażenia -> droga zakażenia -> osobnik wrażliwy

Zapadalność - zachorowalność - liczba nowych przypadków zachorowań na daną chorobę w danym roku na określoną liczbę osób, np. w 2003 roku zachorowało na salmonellozę odzwierzęcą 40000 na 10 mln osób

Chorobowość - liczba chorych w danym roku na daną chorobę na liczbę osób, np. w 2003 roku zachorowało na gruźlicę 1000 osób, a w poprzednich latach 1 mln osób, to chorobowość wynosi 1000 plus 1 mln. Zachorowalnośc wynosi 1000.

Antroponoza - choroba zakaźna człowieka

Antropozoonoza - choroba odzwierzęca - choroba zakaźna człowieka i zwierząt. U ludzi rozwój choroby następuje zazwyczaj w wyniku bezpośredniego kontaktu ze zwierzęciem chorym lub nosicielem albo produktami pochodzenia zwierzęcego (np. bruceloza, nosacizna)

Zoozy - choroby zakaźne zwierząt, na przykład wirus nosówki psów, wirus pomoru świń

Materiał zakaźny - przedmiot, który miał kontakt ze źródłem zakażenia, np. strzykawka, igła, narzędzia operacyjne bądź pochodzący ze źródła np. ślina w drodze kropelkowej

Zakażenia endogenne - zakażenia wywoływane przez drobnoustrój należący do flory naturalnej pacjenta. Gdy komensal lub symbiotyk na skutek niefizjologicznego umiejscowienia staje drobnoustrojem patogennym. Często występuje po szybkiej bakterioterapii, gdy organizm jest osłabiony, wyniszczony. Na przykład przeniesienie E. coli do układu moczowego.

Zakażenie egzogenne - zakażenie wywołane przez drobnoustrój pochodzący z zewnątrz. Drobnoustrój może być bodźcem do wytwarzania przeciwciał humoralnych lub związanych z tkankami

Zakażenie mieszane - wielobakteryjne = wielodrobnoustrojowe - zakażenie wywołane przez 2 gatunki lub więcej, albo ten sam patogen ale różne typy antygenowe, bakteriofagowe (1 gatunek a różne serotypy, lizotypy, fagotypy)/ Bakterie działają synergistycznie, pomagają sobie.

4. Dochodzenie epidemiologiczne - identyfikacja zarazka(metody)

Postępowanie diagnostyczne powinno uwzględnić następujące etapy:

1. Ustalenie źródła i drogi przenoszenia, np. gronkowiec złocisty powoduje chorobę Rittera u noworodków(produkcja toksyn - wzrost temperatury, naskórne bąble)

2. Izolacja osobnika zarażonego (wrażliwego)

3. wykonanie antybiogramu po wcześniejszym pobraniu wymazów z przedsionka nosa pracowników oddziału który jest zamknięty dla odwiedzających.

Identyfikacja zarazka:

1. badanie bezpośrednie (preparat bezpośredni barwiony lub nie, oglądany pod mikroskopem)

2. metody hodowlane: podłoża stałe, zestaw rutynowy (agar z krwią, podłoże Chapmana, podłoże McConkeya, inne bardziej selektywne oraz odpowiedznie warunki hodowlane (tlenowe, beztlenowe, mikroaerofilne)

3. identyfikacja wyosobnionych bakterii - morfologia komórki - preparat barwiony metodą Grama, morfologia kolonii, oraz określenie cech metabolicznych?

4. oznaczenie wrażliwości wyosobnionych bakterii na chemioterapeutyki

5. stosowanie innych technik, np. z sondami znakowanymi chemiluminescencyjnie, lub identyfikacja zarazka drogą:

1. typowanie bakteriofagowe - używamy zestaw fagów na szczepy. Badanie wrażliwości na bakteriofagi(wirusy bakteryjne). Zaleca się w laboratorium przy podejrzeniu epidemii gronkowcami, np. przy szerzącej się pęcherzycy noworodków(ch. Rittera), pobiera się wymazy skóry dzieci i rąk personelu by ustalić czy jest to gronkowiec złocisty. Może określić przynależność danego szczepu drobnoustroju. Bierzemy odpowiedni dla danego drobnoustroju zestaw fagów. Na płytkę agarową wysiewamy badany szczep. Po wsiąknięciu płynu dajemy po jednej kropli każdego faga. Inkubacja w 90ºC. Jeśli w miejscu kropli są łysinki (więcej niż 50) lub zahamowanie wzrostu - to mam próbę dodatnią - szczep wrażliwy na danego faga. Tak uzyskamy wzór fagowy szczepu, który umożliwia później jego identyfikację

2. typowanie bakteriocynowe - badanie wrażliwości szczepu na bakteriocyny, czyli substancje antybiotyczne wytwarzane przez bakterie - dyfundujące do podłoża toksyny niektórych bakterii hamują wzrost innych

3. typowanie serologiczne - stosowane w celu ustalenia czy to ten sam szczep (garnitur antygenowy). Reakcja antygenu bakteryjnego ze swoistym przeciwciałem. Np. aglutynacja płytkowa, probówkowa, odczyn antyglobulinowy Coombsa, hemaglutynacja, precypitacja pierścieniowa w żelu agarozowym, IF, DIF

4. typowanie biochemiczne - określenie metabolizmu bakterii na podstawie aktywności enzymatycznej katabolizującej dane substancje chemiczne z wykorzystaniem barwnych wskaźników, np. fermentacja cukrów, proteoliza, produkcja H₂S, indolu, mocznika, itd. Określenie biotypu

5. antybiogram - określenie wrażliwości na antybiotyki rutynowo metodą dyfuzyjno-krążkową na podłożu Millera-Hintona agarowe o pH=7,4 trafia 1ml 18-24h hodowli bulionowej bakterii o odpowiedniej gęstości nakładane są krążki nasycone(penicyliną streptomycyną, ampicyliną itd.) antybiotyki dyfundują do podłoża i hamują wzrost określonych bakterii wrażliwych na nie.

Ocena sanitarna środowisk specjalnych (powietrze, woda, mleko, żywność, gleba)

• powietrze - głównie w pomieszczeniach zamkniętych obok bakterii saprofitycznych(mikrokoki, gronkowce koagulozo(-) ) mogą znajdować się bakterie chorobotwórcze

Metody

1. wychwytywanie elektrostatyczne - płytki na katodzie w elektrofiltrze

2. filtrowania - przepuszczenie znanej ilości powietrza przez filtr

3. aspirometryczna - przepuszczenie znanej ilości powietrza przez różne aparaty

4. sedymentacyjna - swobodne osadzanie drobnoustrojów. Odkrycie płytki z podłożem stałym na 30 minut. Po inkubacji liczy się wyrosłe kolonie - miernik cząstek kurzu z drobnoustrojami

Normy:

• sala operacyjna - do 750 CFU ilość bakterii/m²

• sala zabiegowa - 1000 - 1500 CFU

• sala chorych - do 10000 CFU

Bez bakterii chorobotwórczych!

• Woda

Analiza ilościowa - wysiew na płytki. W H₂O jest 10⁵ bakterii na 1 ml. Określona objętość wody jest seryjnie rozcieńczana, później po 1 ml z każdego rozcieńczenie wysiewane jest na płytki

Analiza jakościowa - metoda wzbogaconych hodowli przefiltrowujemy H₂O przez selektywne filtry zahamowujące bakterie, przenosimy na powierzchnie agarowego podłoża Enda, gdzie są korzystne warunki dla wzrostu E. coli

Metody zapobiegania i zwalczania epidemii:

• Kordon sanitarny - całkowite, przymusowe przerwanie łączności z obszarem objętym epidemią. Na obszarze takim pozostają chorzy, nosiciele i zdrowi ludzie. Konieczne kontakt utrzymują się szczególne środki ostrożności. Kordonem można otoczyć miasto, region, kraj, na terenie na którym panuje epidemie niebezpiecznej choroby

• Kwarantanna - przymusowa obserwacja lekarska ludzi, którzy mieli kontakt z chorymi, względnie przyjeżdżają z obszarów endemicznych na których panują choroby względnie niebezpieczne .w taki sposób wykrywa się ludzi zakażonych, których izoluje się i leczy. Czas trwania zależy od okresu wylęgania choroby.

Metody zapobiegania epidemii:

• Nieswoiste - profilaktyka, przerywanie łańcucha epidemiologicznego

• Izolacja źródła zakażenia

• Kwarantanna

• Kordon sanitarny

• Ochrona wrót zakażenia - okulary, maski

• Eliminacja dróg szerzenia się zakażeń

• Swoiste - prognostyka

• Czynna - szczepionka

• Bierna - surowica

• Czynno-bierna - np. we wściekliźnie

Postępowanie lekarza po stwierdzeniu choroby zakaźnej:

• Opanować szerzenie się choroby(przerwać drogę zakażenia) przez leczenie szpitalne. Dodatkowo stosować profilaktykę swoistą i nieswoistą.

• Pobrać materiał, wysłać do badań bakteriologicznych. Selekcja antybiotyku, podanie leku, przerwanie łańcucha epidemiologicznego

• Przy zatruciu pokarmowym

• Ustalić źródło zakażenia przez wywiad, pobranie materiału na posiew - osoby mające kontakt z pożywieniem

• Sprecyzować czy jest to intoksykacja czy toksykoinfekcja

• 5 metod dochodzenia epidemiologicznego

II Ekologia drobnoustrojów

1. Flora naturalna i jej znaczenie dla organizmu

2. Flora bakteryjna środowisk specjalnych (woda, mleko, żywność, powietrze, gleba)

Ad. 1

• Drobnoustroje które z drobnymi przerwami towarzyszą człowiekowi przez całe życie - stali rezydenci

• Drobnoustroje należące do flory przejściowej które mogą pochodzić od innego organizmu - przejściowi rezydenci

• Każde środowisko zasiedla stałą flora wytwarzająca stan „gotowości kolonizacyjnej”, która chroni przed zasiedleniem przez inne drobnoustroje

Ad. 2

• Środowiska specjalne zawierają duże ilości bakterii pospolitych, występuje przewaga poszczególnych typów w zależności od temperatury, pH, stopnia wilgotności i innych warunków stworzonych w danym środowisku.

LAKCID - zawiesina liofilizowanych żywych pałeczek kwasu mlekowego opornych na działanie antybiotyków, rutynowo stosowana w leczeniu. Stosuje sięw przypadkach zmiany flory bakteryjnej jelit pod wpływem antybiotykoterapii. Zapobiegają: awitaminozie, nadmiernemu rozmnażaniu drożdży i grzybów w skutek antybiotykoterapii.

III Zakażenia szpitalne - wprowadzenie

1. Szczep szpitalny - lekooporność w warunkach szpitalnych

Zakażenie szpitalne - zakażenie, które wystąpiło w szpitalu i ujawniło się w okresie pobytu w szpitalu lub 48h po jego opuszczeniu i zostało spowodowane przez udokumentowany epidemiologicznie czynnik chorobotwórczy pochodzący od innego chorego lub pracowników szpitala, albo przez endogenny czynnik mikrobiologiczny.

Szczep szpitalny - szczep bakteryjny szczególnie często i obficie występujący w szpitalu, wykazuje wysoką lekooporność, oporne na chemioterapeutyki i środki dezynfekujące stosowane w szpitalu. Mają charakterystyczne typy bakteriofagowe, serologiczne. Giną po wyjściu ze szpitala, bo:

• Nie ma osobników wrażliwych

• Nie są poddawane antybiotykoterapii

Na przykład: MRSA, HLAR, ESBL, VRE, VISA, PESP(PRSP?)

2. Łańcuch epidemiologiczny zakażeń szpitalnych

-wymogi czasowe wystąpienia objawów klinicznych

Łańcuch epidemiologiczny zakażeń szpitalnych jest taki sam jak w przypadku innych chorób zakaźnych. Aby stwierdzić czy mamy do czynienia z zakażeniem szpitalnym musimy odpowiedzieć na pytanie „czy konieczność podania antybiotyku zaistniała dopiero po 72h pobytu pacjenta w szpitalu?”. Odpowiedź twierdząca - duże prawdopodobieństwo zakażenia szpitalnego

3. Zapobieganie i zwalczanie zakażeń szpitalnych (metody)

• Zespoły do zwalczania zakażeń szpitalnych

• Monitorowanie środowisk szpitalnych (personel, pomieszczenia)

• Ochrona personelu medycznego przed zakażeniami

Zadania lekarza epidemiologa:

1. Ustalenie procedur medycznych

• Dezynfekcja pomieszczeń, podług

• Mycie rąk i użycie środków dezynfekujących

• Używanie do ochrony rękawiczek, fartuchów, maseczek, butów

1. Kontrola sanitarna oddziału szpitalnego

• Pobranie wymazów od personelu, pacjentów, urządzeń medycznych, podłóg

• Dezynfekcja i sterylizacja - kontrola

• Kontrola autoblawowania(?) ilość pdretna(?) - metoda sedymentacyjna

1. Wykonanie receptariusza (wytyczne dla oddziałów jakich antybiotyków używać)

2. Metody zapobiegania zakażeniu (izolacja chorych wywołanych przez MRSA, ESBL od innych pacjentów)

3. Dochodzenie epidemiologiczne

• Określenie źródła i dróg zakażenia

• Określenie zgodności szczepów od źródła (np. pielęgniarki) i chorego (np. noworodka)

• Rząd biochem

• Typowanie bakteriofagowe

• Metody genetyczne

Ćwiczenie 4

Temat: Immunologia infekcyjna i diagnostyka serologiczna

1. Antygeny

• Definicja antygenu - substancja która łączy się poprzez swoiste miejsce wiążące oraz powoduje powstawanie przeciwciał przeciwko nim

• Budowa chemiczna antygenu - białko, glikoproteina, lipid, bakteria

• Determinanta antygenowa - epitop - decyduje o swoistości antygenu, najczęściej zbudowana z grupy niebiałkowej -SH, -OH, -COOH

• Immunogenność antygenu - odpowiada za wywoływanie reakcji czyli produkcji przeciwciał, gł. Białkowy

• Swoistość antygenu

• Rodzaje antygenu:

• Pełnowartościowe - wywołują reakcję immunologiczną

• Niepełnowartościowe - nie są zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej

• Hapteny

• Proste

• Nie wywołują produkcji przeciwciał

• Nie reagują z przeciwciałami w sposób widzialny

• Blokują odpowiadające im przeciwciała

• Z białkami tworzą kompleksy

• Wprowadzone do organizmu mogą związać się z jego białkami - tworzą obce białka złożone

• Złożone - resztkowe

• Nie wywołują produkcji przeciwciał, ale reagują z surowicami uzyskanymi przez uodpornienie antygenem którego składową stanowił dany hapten

• Uzyskuje się przez usunięcie białka z antygenu pełnowartościowego

• Wielocukry i lipidy

• Budowa antygenowa komórki bakteryjnej

• Antygeny somatyczne

• W ścianie komórki bakteryjnej

• U pałek jelitowych są identyczne z endotoksyną, zbudowane z białko+lipidy+wielocukry

• Antygeny rzęskowe

• U urzęsionych bakterii

• Ciepłochwiejne

• Białkowe

• Usuwanie: 2h ogrzewanie w 100ºC lub działanie silnym alkoholem

• Antygeny otoczkowe

• Wielocukry

• Chronią bakterie przed fagocytozą

• Sąpodstawą podziału na typy serologiczne

• Maskujące

• Mogą uniemożliwić dostęp przeciwciał do głębszych antygenów somatycznych które można wykryć po zniszczeniu antygenów otoczkowych

• Właściwości Endo- i egzotoksyn

• Antygeny pozakomórkowe = toksyny

• Endotoksyny

• U bakterii Gram(-), paciorkowców, pneumokoków

• Są identyczne z antygenem somatycznym

• 3 składniki: wielocukier+lipid+białko

• Występują w ścianie komórkowej

• Część lipidowa odpowiada za toksyczność, wielocukier - swoistość serologiczną, białko - antygenowość

• Nie udaje się otrzymać z nich anatoksyny

• Okres inkubacji: krótki, kilka godzin

• Ciepłostabilne

• Brak swoistości farmakologicznych

• Są słabymi jadami, zabójcze w dużych dawkach

• Uwalniane po śmierci komórki na skutek autolizy

• Mogą wywołać wstrząs endotoksyczny - septyczny - zespół zaburzeń w układzie krążenia związany z zakażeniem, biegunką, wymiotami i temperaturą

• Egzotoksyny

• Białkowe i dlatego są ciepłochwiejne(toksyna tężcowa ulega zniszczeniu w 60ºC w ciągu 20 minut, toksyna błonicza po 1 godzinie)

• Są wydalane na zewnątrz drobnoustroju

• Łatwo oddzielają się od bakterii drogą filtracji

• Są silnymi jadami(działają w małych dawkach)

• Wykazują swoistość farmakologiczną

• Toksyna tężcowa poraża komórki rogów przednich rdzenia

• Toksyna błonicza uszkadza serce

• Toksyna erytrogenna uszkadza nabłonek naczyń

• Działają na ustrój po upływie pewnego okresu inkubacji 12-15 godzin

• Łatwo dają się pozbawić toksyczności pod wpływem formaliny przechodzą w anatoksynę (toksoid)

• Wytwarzane przez bakterie Gram(+)

• Uwalniane z komórki bakterii w sposób:

• Nie dyfundują do podłoża w fazie logarytmicznego wzrostu, ale powoli w czasie autolizy; ilość proporcjonalna do masy bakteryjnej

• Dyfunduje do podłoża w fazie logarytmicznego wzrostu stężenie wewnątrz komórki toksyny mniejsze niż w podłożu; na przykład toksyna błonicza, gronkowcowa, alfa toksyna Cl. Welchi.

• Dyfunduje do podłoża w fazie logarytmicznego wzrostu; stężenie wewnątrz komórki jest duże, dodatkowo uwalniana jest w procesie autolizy

• Adiuwanty - związki które podane z antygenem wzmagają przeciwko niemu odpowiedz immunologiczną bądź też indukują odpowiedz immunologiczną przeciwko antygenowi który podany bez adiutantów jest nieimmunogenny.

• Działa poprzez wydłużenie czasu ekspozycji

• Działa podrażniająco

• Wzmaga proliferację komórek immunologicznie kompetentnych

• Np. endotoksyny, zw. Al., emulsje olejowe wchodzące w skład szczepionek

2. Przeciwciała

• Budowa przeciwciał

• Przeciwciała - specyficzne immunoglobuliny powstające w ustroju jako odpowiedź określonego antygenu w celu zobojętnienia jego działania

• Zbudowane z 4 łańcuchów: 2H(ciężkie) i 2L(lekkie)

• Swoistość działania jest uwarunkowana sekwencją aminokwasów w końcowym odcinku łańcucha - antydeterminanty.

• Wytwarzane są w komórkach plazmatycznych; pojawią się też 4-5 dni po wprowadzeniu antygenu, maksymalnie po 16-20 dniach

• Rewakcynacja - powtórne podanie tego samego antygenu osobnikowi uodpornionemu sprawi bardzo szybkie pojawienie się przeciwciał o wysokim mianie

• Przeciwciała odpornościowe - powstałe po chorobie / szczepieniu

• Obecne we krwi u osób nieuodpornionych = naturalne

• Kontakt organizmu z antygenami bakteryjnymi

• Utajone zakażenie

• Reakcja krzyżowa między bakteryjnymi antygenami

• Charakterystyka klasy przeciwciał

• IgG - przechodzą przez łożysko, ochraniają płód, drugie reagują, ich obecność w surowicy świadczy o odporności przeciw zakażeniu przechodzącego w stan zapalny o charakterze przewlekłym. Jeśli miano IgG spada - proces znika

• IgA - przeciwciała ochronne na błonach śluzowych i w wydzielinach, stanowią linię ochrony przeciwwirusowej

• IgM - nie przechodzą przez łożysko, pierwsze reagują, ich obecność w surowicy świadczy o ostrym stanie zapalnym

• IgE - wysoki poziom w zakażeniach pasożytami, alergicznym, nowotworach

• IgD - tylko w surowicy, ?? na limfocytach B przy ich różnicowaniu

3. Mechanizmy odporności nieswoistej = naturalnej

• Bariery tkankowe i mechanizmy utrudniające wnikanie bakterii

• Śluzówki

• Skóra

• Niskie pH treści żołądkowej

• Lizozym we łzach

• Inhibitory tkankowe

• O₂ w tkankach nie dopuszcza do rozwoju bakterii beztlenowych

• Dopełniacz

• C₁-C₁₀ , bakteriolityczny

• Ciepłochwiejny - 56ºC, zniszczenie po 30 minutach

• Najwięcej w surowicy świnki morskiej - wykorzystywana do odczynu wiązania dopełniacza

• Properdyna

• Białko w surowicy

• Wymaga układu dopełniacza, Mg⁺⁺

• Właściwości bakteriobójcze, zabija wirusy i pierwotniaki

• Fagocytoza

• Wchłanianie przez komórki obcych cząsteczek

• Niektóre bakterie są odporne na działanie enzymów fagocyta i namnażają się w nim chronione przed antybiotykiem - wznowa choroby

• Lizozym

• Występuje w wydzielinach, Kwi, tkankach

• Wrażliwe na niego: bakterie Gram(+), mikrokoki, laseczki

• Większość bakterii Gram(-) jest odpornych

• Rozkłada ścianę komórkową

4. Mechanizmy odporności swoistej

• Budowa układu odpornościowego

• Polega na produkcji przeciwciał po uprzednim kontakcie z antygenem

• Układ limfatyczny - podłoże komórkowo-narządowe układu immunologicznego

• Układ odpornościowy - komórki plazmatyczne, przeciwciała, leukocyty

• Narządy limfatyczne (centralne)

• Centralne: szpik, grasica

• Obwodowe: węzły chłonne, śledziona, migdałki, grudki chłonne

• Komórki układu odpornościowego

• Odporność nieswoista

• Komórki NK

• Eozynofile

• Odporność swoista

• Limfocyty B

• Limfocyty T

• Limfocyty B i T

• Limfocyty B

• Składniki odpowiedzi humoralnej

• Żyją kilka dni

• Pod wpływem stymulacji antygenami komórki plazmatyczne wytwarzają Ig

• Limfocyty T

• Składnik odpowiedzi humoralnej i komórkowej

• Współpracują z limfocytami B

• Żyją kilka lat (komórki pamięci)

• 80% limfocytów

• Produkują limfokiny

• Układ dopełniacza

• 30 białek osocza i płynów tkankowych

• Działają w określonej sekwencji

• Cytokiny

• Produkowane przez: makrofagi, fibroblasty, limfocyty T, komórki tuczne, komórki zrębu szpiku, monocyty, leukocyty, płytki krwi, łożysko, nerki, kości, komórki nowotworowe

• Na przykład Il-1, Il-10,. TNF α, β, INF α, β, γ, TGF-β

• Etapy odpowiedzi immunologicznej po wniknięciu antygenu

• faza indukcyjna

• rozpoznanie antygenu przez immunokompetentny limfocyt

• antygen prezentowany przez komórki APC makrofagi

• pod wpływem limfocytu T_h transformacja blastyczna

• proliferacja i różnicowanie komórek eżektorowych i pamięci

2. faza efektorowa

• produkcja i wydzielanie przeciwciał

• atak komórek przez limfocyty T_c

5. Rodzaje odporności nabytej

• czynna

• gdy organizm wytworzył przeciwciała sam w wyniku zakażenia - czynna naturalna

• gdy są przeciwciała bo było szczepienie - czynna sztuczna

• bierna

• gdy organizm dostaje gotowe przeciwciała, np. od matki przez łożysko, z mlekiem - bierna naturalna

• gdy organizm dostaje gotowe przeciwciała w postaci surowicy odpornościowej - bierna sztuczna

6. Szczepionki i surowice

• rodzaje szczepionek bakteryjnych i wirusowych

• szczepionka - są to sztuczne wprowadzanie antygenu sporządzane z drobnoustrojów i ich toksyn, głównie drogą pozajelitową wywołują odpowiedź immunologiczną - organizm produkuje przeciwciała.

• Rodzaje szczepionek

• Monowalentne - z 1 antygenem

• Poliwalentne - z kilkoma antygenami a czasem i anatoksyną

• Ze względu na zawartość szczepionki

• drobne, żywe, zjadliwe - rzadko podawane, u niektórych osobników mogą powodować objawy choroby, na przykład podskórnie przecinkowiec cholery

• żywe odzjaliwione (atenuowane) - składają się z bakterii, wirusów które utraciły zdolność do wywoływania choroby zachowując właściwości antygenowe, np.:

1. wirusowe:

• ospa

• odra

• wścieklizna

• grypa

• różyczka

• polio

1. bakteryjne

• gruźlica

• bruceloza

• dżuma

• tularemia

3. zabite - pełnowartościowe pełnokomórkowe - inaktywowane ciepłem, chemicznie, a wirusy UV bądź odwodnione acetonem, np.

• dur brzuszny, rzekomy, plamisty

• czerwonka

• cholera

• krztusiec

• choroba Heinego - Medina

• autoszczepionki

4. z oczyszczonymi frakcjami antygenowymi po autolizie, na przykład

1. durz brzuszny i rzekomy

2. Haemophilus influenzae B

5. anatoksyny - inaktywowane - pozbawione zjadliwości egzotoksyny - uzyskuję się z egzotoksyn przez dodanie 0,5% formaliny i inkubację w 37ºC około 1 miesiąca, są pozbawione właściwości toksycznych, ale mają cechy antygenowe, na przykład Di - Per - The (błonica, tężec, krztusiec)

6. rekombinowane - rekombinowane wirusy krowianki, atenuowane bakterie, wirusy owadów, np. WZW typu B

• szczepienia obowiązkowe i zalecane w Polsce

• szczepienia obowiązujące

• hepatitis B

• BCG (Gruźlica)

• Di-Per-The

• OPV

• Przeciw odrze

• Błonic, tężcowi

• Różyczce

• Zalecane

• Hepatitis B

• Di - Per - The (Błonica, tężec, krztusiec)

• OPV (polio)

• Haemophilius Influenzae B

• MMR (odra, świnka, różyczka)

• Wirus, ospa wietrzna/półpasiec

• Toksoid tężcowy

• Autoszczepionka, wskazania do stosowania i sposób uzyskiwania, wady i zalety stosowania autoszczepionki

Autoszczepionka - rodzaj szczepionki z drobnoustrojów zabitych

• Sporządza się ją z drobnoustroju wyhodowanego od chorego i temu samemu choremu podaje. Daje to gwarancję iż drobnoustrój znajdujący się w szczepionce jest identyczny antygenowo z odpowiedzialnym za proces chorobowy, jest on natomiast pozbawiony toksyczności (inaktywowany). Dopuszcza się stosowanie oczyszczonych frakcji antygenowych zarazków zabitych

• Stosuje się głównie w leczeniu opornych na antybiotyki zakażeń gronkowcowych (czyraki)

• Stosuje się je jako pomoc przy antybiotykoterapii i eliminacji chorób nawrotnych

• Nie można stosować jej u bakterii, które mają krzyżowo podobne antygeny do ludzkich antygenów gdyż może powodować autoagresję. Antygeny podobne posiadają paciorkowce

• Pobieramy 3krotnie materiał od pacjenta, wykonujemy

• Typowanie bakteriofagowe

• Typowanie biochemiczne

• Antybiogram (lekooporność)

• Surowice odpornościowe, sposoby otrzymywania, wady i zalety

Surowice odpornościowe - preparaty lecznicze otrzymywane z krwi zwierząt (koni, bydła, owiec) uodpornionych za pomocą antygenów, rzadziej otrzymuje się z krwi ludzkiej. Dają odporność bierną krótkotrwałą(2-3 tyg)

Stosowane w:

Błonica, różyczka, tężec, zatrucie jadem kiełbasianym, zgorzel gazowa, wąglik, zatruciu jadem żmii.

	Surowica	Szczepionka
Czas działania	Krótkotrwałą	Długotrwałą
Czas odpowiedzi	Szybka odpowiedź	Długa odp w czasie

• Poszukiwanie antygenów drobnoustrojów chorobotwórczych bezpośrednio w materiale diagnostycznym

Diagnostyka mikrobiologiczna - wykrycie drobnoustrojów

1. preparat mikroskopowy

2. badania hodowlane

3. test immunofluorescencji bezpośredniej

4. test Elisa

5. Badania genetyczne

• Sonda kw. Nukleinowych

• PCR

7. Zastosowanie odczynów serologicznych w ocenie odpowiedzi humoralnej pacjenta (diagnostyka pośrednia)

• Definicja miana przeciwciał - najmniejsza ilość przeciwciał w największym rozcieńczeniu surowicy w którym zachodzi jeszcze pełna reakcja immunologiczna

• Interpretacja wyników badań serologicznych

Po oznaczeniu 1 miana przeciwciał nie możemy ustalić rozpoznania. Oznaczenie kolejnych umożliwia określenie rozpoznania

• Miano chorobowe - najniższe miano które przemawia za istnieniem choroby - miano patognomiczne

Interpretacja rozstrzygającym o chorobie jest stwierdzenie narastania miano przeciwciał, które świadczy o rozwijającej się chorobie.

• Dynamika narastania miana:

• Odpowiedź pierwotna - po 14-16 dniach osiąga próg wykrywalności.

• Odpowiedź wtórna - po 2 dobach osiąga przekroczenie progu wykrywalności

Należy pobrać 2 próby. Jeśli poziom jest stały to nie świadczy o chorobie, a 2-4 krotny wzrost o niej świadczy. Próby pobieramy na początku i po 2 tygodniach

• Klasy przeciwciał:

IgM, IgA, IgG, IgD, IgE

8. Odczyny serologiczne - zastosowanie, zasady wykonania, interpretacja

• Odczyn aglutynacji(probówkowa, szkiełkowa, lateksowa, hemaglutynacja czynna, bierna, koaglutynacja) - miedzy upostaciowanym antygenem a przeciwciałem

• Aglutynacja probówkowa - pozwala określić miano i klasę przeciwciał w probówce

• Aglutynacja „0” - osad z grudek / błonki wyściełającej dnol przylega dość mocno. Zlepianie biegunowe

• Aglutynacja „H” - na dnie osad przypominający kłaczkowaty, przy wstrząsaniu rozbija się. Zlepianie obłoczkowe

• Aglutynacja „Vi” - zbite skupiska pozlepianych bakterii

Odczyn aglutynacji probówkowej - Widala, Wella-Felixa, Wrighta - wykorzystywany w diagnostyce chorób zakaźnych - sporządza się kolejne rozcieńczenia badanej surowicy poszukując przeciwciał. Miano aglutynin sprawdzamy po tygodniu - czy nie rośnie/spada - rekonwalescencja, dodaje antygen w soli fizjologicznej, ogrzewa, ustala miano przeciwciał, na podstawie osadu i stopnia przejrzystości płynu nad osadem

• Aglutynacja szkiełkowa - stosowana w szybkiej identyfikacji drobnoustrojów, w diagnostyce chorób zakaźnych. Wynik (+) jeśli obserwujemy w kropli z surowicą aglutynację - natychmiast lub po upływie kilku minut

• Aglutynacja lateksowa - wykrycie małych antygenów lub nieupostaciowanych w płynach ustrojowych(krew, ropa, CSF) przy pomocy cząstek lateksu opłaszczonych przeciwciałami.

Cząsteczka lateksu składa się z rdzenia polistyrenowego, otoczone polimerami wiążącymi białko.

• Hemaglutynacja

• Czynna = bezpośrednia = HA - zlepianie erytrocytów wywołane przez drobnoustroje. Zjawisko to Mozę być zahamowane działaniem surowicy zawierającej swoiste przeciwciała skierowane przeciwko drobnoustrojom zlepiającym krwinki. Oznaczenie grup krwi A,B,0

Komórki zakażone wirusem posiadającym hemaglutyniny na powierzchni do pożywki hodowlanej, uwalnianie się wirusa do pożywki, zmieszanie pożywki z zawiesiną erytrocytów, , aglutynacja erytrocytów. Wirusy z hemaglutyninami: wirus paragrypy, świnki, odry.

• Bierna = pośrednia = IHA - gdy na erytrocyty opłaszczone jakimś antygenem (przeciwciałem) zadziałamy surowicą odpornościową zawierającą przeciwciała (antygeny) swoiste dla antygenu (przeciwciała) zaadsorbowanego na powierzchni komórki. Adsorpcja antygenu (przeciwciała) zahamuje reakcję.

• Koaglutynacja - charakterystyczna dla paciorkowców. Niektóre szczepy S. aureus mają duże ilości białka A powierzchniowego, któe wykazuje duże powinowactwo do części F_c cząstki Ig, wolny fragment F_ab może wiązać antygen powodując widoczną aglutynację komórek gronkowca (stanowi oznakę wiązania przeciwciała z antygenem)

• Odczyn precypitacji - między bezpostaciowym antygenem białko, toksyny a przeciwciałem

• Probówkowa - w środowisku płynnym = pierścieniowa

• Nie można stwierdzić czy w reakcji bierze udział 1 czy kilka układów antygen - przeciwciało

• Antygen nawarstwia się w probówce na surowicę bo jest lżejszy od surowicy

• Na granicy zetknięcia obu roztworów powstaje warstwa precypitatu.




• Immunodysfuzja - w żelu agarowym

• Prosta - gdy dyfunduje 1 składnik, a 2 dodamy do żelu

• Podwójna - gdy dyfundują 2 składniki (antygen i przeciwciało) można identyfikować nieznany antygen/przeciwciało

• Reakcja identyczności - polega na tym, że linie precypitacyjne utworzone przez 2 sąsiadujące antygeny zlewają się, antygeny są serologicznie identyczne

• Reakcja nieidentyczności - linie precypitacyjne 2 sąsiadujących antygenów krzyżują się - nie są one spokrewnione lub surowica odpornościowa użyta w precypitacji nie ma przeciwciał dla wspólnych im determinant antygenowych

• Reakcja częściowej identyczności - gdy antygeny mają część wspólnych a część różnych determinant - linie precypitacyjne łączą się częściowo tzw. Ostroga. Na przykład reakcja zahamowania - gdy 1 z linii kończy się tam gdzie zaczyna się2.

• Immunoelektroforeza

• Uczulenie białka przeciwciałem

• Przeprowadzenie elektroforezy

• Sprawdzenie rozkładu białek (antygenów)




• Odczyn neutralizacji (ASO) - oznaczenie miana antystreptolizyny

Norma we krwi: 200 jednostek

Antystreptolizyna - przeciwciało z rodziny γ-globulin, które hamuje działanie streptolizyny O, wytwarzanej przez paciorkowce β-hemolizujące

Streptolizyna - toksyna wydzielana przez Streptococus pyogenes, mają zdolność do hemolizy ludzkich erytrocytów.

Im wyższy poziom przeciwciał tym wyższy poziom streptolizyny O. Odczyn wykonujemy przy podejrzeniu choroby reumatycznej po zakażeniu Streptococcus pyogenes (paciorkowiec ropny).

Wykonując odczyn ASO szukamy w surowicy pacjenta Antystreptolizyny. Musimy oznaczyć miano przeciwciał czyli rozcieńczyć surowicę badaną, która została inaktywowana w 56ºC przez 30 minut. Do probówki I dodajemy 2,4 ml NaCl, do II - VI po 0,5 ml, a do VII 0,25 ml NaCl. Wykonać rozcieńczenia przenosząc po 0,5 ml z I do następnej. Do rozcieńczeń surowicy dodać po 0,25 ml streptolizyny O pomijając probówkę kontrolną. Inkubujemy przez 15 minut. Dodajemy 0,5 ml 5% krwinek ludzkich do wszystkich probówek. Inkubujemy w 37ºC 45 minut. Po tym okresie w temperaturze pokojowej poczekać 30 minut. Określić miano ASO w surowicy badanej biorąc pod uwagę rozcieńczenia surowicy w której nie ma hemolizy (taką liczbę przeciwciał jaka jest potrzebna do całkowitego zobojętnienia)




• Odczyn wiązania dopełniacza (OWD) - test ilościowy (określenie miana przeciwciał reagujących z antygenem)

Przebieg reakcji wiązania dopełniacza




OWD

• Umożliwia jedynie wykrycie przeciwciał wiążących dopełniacz IgG, IgM (ale nie odróżnia ich od siebie); określa miano przeciwciał i ich wykrycie

• Stosowany w: durze brzusznym, rzeżączce, brucelozie, wirusach




• W przypadku połączenia się antygenu ze swoistym przeciwciałem obecnym w surowicy badanej, dopełniacz zostaje wyabsorbowany przez kompleks antygen - przeciwciało swoiste. Z powodu braku dopełniacza nie dojdzie do połączenia z systemem hemolitycznym zatem nie dojdzie do hemolizy

• Przy braku swoistych przeciwciał nie dojdzie do połączenia dopełniacza z kompleksem antygen-przeciwciało, wtedy dopełniacz połączony zostaje z systemem hemolitycznym co spowoduje hemolizę krwi.

• Odczyn immunofluorescencji (IF) - polega na połączeniu antygenu ze swoistym przeciwciałem znakowanym fluorescencją co powoduje widoczne świecenie pod mikroskopem

• Bezpośrednia (DIF) - dysponujesz zakażoną tkanką czyli antygenem i znakowanymi przeciwciałami. Inkubujesz razem. Płuczesz czyli usuwasz niezwiązane przeciwciała z antygenem. Reszta stanowi kompleks barwny antygen - przeciwciało znakowane. Odczyn wykonany w środowisku stałym, tzn w materiale klinicznym w którym jest antygen.




• Pośrednia (IIF) - używa się znakowanych fluoresceiną antyludzkich przeciwciał do wykrywania ludzkich przeciwciał związanych ze znanym drobnoustrojem.

Etap I Etap II




Przeciwciała swoiste nie połączone z barwnikiem z I etapu stanowią antygen

swoisty dla przeciwciał znakowanych z II etapu

• Odczyn immunoenzymatyczny (ELISA), EJA

• Stosowany do wykrywania antygenów i przeciwciał i określenie ich miana zastosowanie w wirusowych zapaleniach wątroby

Określenie poziomu przeciwciał:




Określenie antygenu:




• Odczyn radioimmunologiczny (RIA)

• Wykorzystujemy znaczone antygen przeciwciała radioizotopem

• Zasada jak w immunofluorescencji (konkurencyjność wiązań)

• Immunoblotting

• Westernblotting - próby białkowe poddaje się rozdziałowi metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym. Rozdzielone białka przenosi się na arkusz nitrocelulozy lub nylonu. Arkusz ten inkubie się w obecności przeciwciała swoistego względem antygenu, po czym nie związane przeciwciała wymywa się. Białka które związały przeciwciała wykrywa się metodą autoradiografii lub stosując znakowanie przeciwciała drugorzędowe wiążące przeciwciała pierwszorzędowe. Jest testem potwierdzającym zakażenie wirusem HIV (gdy ELISA (+))

• Southern blotting - pozwala na wykrywanie specyficznych sekwencji DNA. Dlatego jest stosowany do analizy struktury genów. DNA poddaje się trawieniu enzymami restrykcyjnymi a otrzymane fragmenty rozdziela się według wielkości na żelu agarowym. Fragmenty DNA są przenoszone siłami kapilarnymi z żelu na filtr celulozowy i poddawane hybrydyzacji z radioaktywną sondą. Filtr przemywa się w celu usunięcia resztek niezwiązanej sondy. Przykładając kliszę rentgenowską do przemytej nitrocelulozy uzyskuje się autoradiogram z prążkami odpowiadającymi hybrydyzującym fragmentom DNA, których długość można określić na podstawie zajmowanej pozycji na filtrze. Geny są charakteryzowane przez liczbę i wielkość prążków. Metodą tą można wykryć nieprawidłowości w strukturze genów.

• Northern blotting - dla RNA

9. Metody genetyczne - wykrywanie drobnoustrojów w materiale diagnostycznym.

• Metoda amplifikacji - PCR (polimerase chain reaction)





Miesza się 2 krótkie startery DNA swoiste dla regionów poszukiwanego DNA, DNA od mikroorganizmu, ciepłotrwałą polimerazę, nukleotydy. Startery i nukleotydy w nadmiarze





Reagująca mieszanina idzie do termocyklera który obniża/podwyższa temperaturę umożliwiającą 3-stopniową reakcję PCR





Denaturacja Dna z badanych mikroorganizmów do pojedynczych nici podczas gorącej fazy cyklu w temperaturze 90-95ºC





Ochładzanie do 50ºC, startery przyłączają się do DNA (duża ich liczba gwarantuje, że zhybrydyzują ze starterami). Hybrydyzacja z homologicznymi nićmi DNA





Podniesienie temperatury do 72ºC, polimaraza Tag przyłącza egzogenne nukleotydy do starterów, które zostały zhybrydyzowane z pojedynczymi nićmi DNA, wydłużanie nici przez przyłączenie nukleotydów do końców 5' i 3' - 2razy poszukiwane sekwencje w każdym chromosomie





Powtórka 30x

Zastosowania: test dla Chlamydia trachomatis.

• Sonda genetyczna

Wyizolowany DNA kodujący sekwencję genów rybosomalnych poddajemy denaturacji do pojedynczych nici. Są podstawą do konstrukcji komplementarnych DNA (cDNA), która jest wykorzystywana jako sonda do wykrywania rRNA w próbkach. Urządzenie, które mierzy chemoluminescencję emitowaną przez cząsteczki związane z DNA jest używane do wykrywania sonda-cel hybrydy

Wskazania: szybka identyfikacja, trudna izolacja drobnoustroju, np. N. gonnorhoeae i Ch. Trachomatis

10. Zastosowanie odczynów serologicznych w diagnostyce mikrobiologicznej (diagnostyka bezpośrednia)

• Diagnostyka bezpośrednia:

• Odczyn aglutynacji

• OWD

• DIF - immunofluorescencja bezpośrednia

• Immunoenzymatyczny odczyn ELISA

• Metody genetyczne (pcr, sonda genetyczna)

• Antytoksyna - przeciwciało przeciwko toksynom/anatoksynom neutralizujące lub kłaczkujące antygen. Stosowana w surowicach odpornościowych z fenolem jako środkiem konserwującym(tężcowa, błonicza, jady żmij, zgorzel gazowa)

• Anatoksyna - toksoid, toksyna pozbawiona właściwości chorobotwórczych a zachowująca antygenowość stosowana w szczepionkach (tężcowa, błonicza). Pozbawiona jest toksyczności.

Ćwiczenie 5

Temat: Wpływ czynników fizycznych i chemicznych na bakterie

1. Rodzaje czynników zewnętrznych wpływających na rozwój drobnoustrojów i sposoby ich wykorzystania:

1. Temperatura

2. Wysuszenie

3. Związki chemiczne (konserwacja, solenie, słodzenie produktów spożywczych)

2. Wyjaśnienie pojęć:

• Dezynfekcja - odkażenie, sposób walki z drobnoustrojami za pomocą środków chemicznych i mechaniczne usuwanie zarazków. Podczas tych zabiegów ginie większość bakterii. Środki dezynfekcyjne działają na formy wegetatywne bakterii i inne mikroorganizmy, natomiast zarodniki są najczęściej oporne na ich działanie. Cel: przerwanie drogi szerzenia się zarazków ze źródła zakażenia na osobniki zdrowe; dążenie do zabicia jak największej liczby drobnoustrojów na skórze, ranach, jamach ciała

• Sterylizacja = wyjaławianie - niszczenie lub usuwanie wszystkich drobnoustrojów znajdujących się na lub w przedmiotach i płynach. Przeprowadzana za pomocą czynników fizycznych lub mechanicznych. Cel: przerwanie drogi przedostawania się zarazków ze źródeł zakażenia i z otoczenia do wrażliwych organizmów poprzez przedmioty płyny stosowane do zabiegów operacyjnych i leczenia chorych.

• Aseptyka - polega na nie zakażaniu drobnoustrojami przedmiotów wyjałowionych. Zespół czynności mających na celu ochronę jałowości ran pooperacyjnych, środków opatrunkowych, narzędzi operacyjnych, leków.

• Antyseptyka - niszczenie bakterii znajdujących się na skórze, ranach, jamach ciała za pomocą środków chemicznych u organizmów żywych.

• Sanityzacja - działania i czynności mające na celu zmniejszenie liczby drobnoustrojów w określonym miejscu do tzw. Bezpiecznego poziomu, działania mające na celu utrzymanie i polepszanie warunków zdrowotnych organizmu i ludzkiej populacji (mycie, malowanie, pranie)

3. Metody dezynfekcji

1. Dezynfekcja chemiczna:

• Czynniki wpływające na skuteczność dezynfekcji:

1. Stężenie środka

2. pH środowiska

3. temperatura środka i środowiska

4. czas ekspozycji materiału na działanie środka (minimalnie 10 minut)

5. obecność dodatkowych substancji organicznych (wpływ ujemny - ropa, krew)

6. inokulum bakteryjne (gęstość bakteryjna /m²)

7. od podatności bakterii i ich rodzaju.

• Przyczyny niskiej skuteczności:

1. Zbyt krótki czas działania

2. Niskie stężenie środka

3. Długie przechowywanie roztworów roboczych

4. Niewłaściwe przechowywanie roztworów macierzystych

5. Obecność substancji organicznych (krew, ropa)

6. Nieodpowiednia temperatura, pH środowiska, środka

7. Duże inokulum

• Cechy idealnego środka dezynfekcyjnego:

1. Szerokie spektrum działania na drobnoustroje

2. Nieszkodliwość dla ludzi i zwierząt

3. Działanie w niskich stężeniach

4. Trwałość w stężeniach wyższych i w używanych

5. Dobra rozpuszczalność - łatwy do przygotowania

6. Skuteczność działania w różnych środowiskach

7. Łatwa przenikalność przez błony biologiczne, śluz, ropę, krew

8. Nie niszczy materiałów użytkowych, powierzchni

9. Nie traci aktywności w obecności substancji organicznych

10. Łatwo dostępny

11. Bezwolny

12. Tani

13. Działać szybko (w różnych środowiskach)

14. Ulegać biodegradacji (nie zanieczyszczać)

• Grupy chemiczne środków dezynfekcyjnych i ogólne zasady mechanizmów ich działania na drobnoustroje:

Dezynfekcje
Metody termiczne	Filtracja	Środki chemiczne	Promieniowanie UV
Pasteryzacja Gotowanie Są nieszkodliwe dla człowieka i środowiska		Aldehyd (mrówkowy) - unieczynniają enzymy komórkowe Pochodne fenolu - zdolność przenikania przez błonę lipidową Etanol - denaturacja białka Chloroheksydyna IV rzędowe związki amoniowe Pochodne Cl, I2 Związki fenolowe Detergenty Barwniki (fiolet krystaliczny)	Redukcja drobnoustrojów poprzez uszkodzenie białek Ma małą zdolność penetracji, dlatego zaliczamy tylko do środków dezynfekcyjnych Działanie spada w obecności kurzu

Środki chemiczne:

• H₂O - działanie osmotyczne

• Roztwory soli - NaCl, cukry, gliceryna, sole metali ciężkich np. Hg (sublimat, meriolat) lub Ag (azotan Ag, białczan Ag), Mn (nadmanganian), bizmutu (kseroform, dermatol)

• Kwasy i zasady: kwas borowy, siarkowy, węglowy, azotowy, mlekowy, salicylowy, benzoesowy, soda kaustyczna - NaOH, KOH

• Środki utleniające: ozon, woda utleniona, nadmanganian potasu, jodyna, chlor gazowy, wapno chlorowane, chloramina

• Związki organiczne:

• Alkohole - etanol, propanol, metanol (nie może być 100% gdyż wytwarza się otoczka ochronna ze denaturowanych białek, które chronią dostęp do bakterii)

• Kwas karbolowy - karbol, fenol, lizol

• Aldehydy - formalina

• Fitoncydy - roślinne

• Inne - tymol, rezorcyna, mentol

• Pochodne fumaranu: nitrofuran, furandidon, furadantyna

• Barwniki: fiolet krystaliczny, błękit metylenowy, zieleń brylantynowa i malachitowa, etakrydyna, trypaflawina

• Detergenty - zefirom, phenerol, diaphoren, tweed, teepol, desogen

• Mydła: ichtiolowe, siarkowe

• Gazy: HCN, HCOH (formaldehyd)

2. Fizyczne metody dezynfekcji:

• Działanie temperatury do 100ºC - gotowanie, pasteryzacja, tyndalizacja

1. Dekoktacja - polega na kilku minutowym działaniu na drobnoustroje wrzącą H₂O lub nasyconą parą wodną w normalnym ciśnieniu atmosferycznym. Giną tylko postacie wegetatywne

2. Gotowanie - 100ºC przez 15 minut. Niszczy postacie wegetatywne, forma dekoktacji, np. dezynfekcja narzędzi medycznych we wrzącej wodzie. W warunkach normatywnych w tzw. Dekokterach wodnych

3. Pasteryzacja - polega na jednorazowym podgrzaniu płynu (mleka, soków, wina) do temperatury 62ºC przez 30 minut. W przetwórstwie mleka - temperatura 72ºC przez 16 sekund. UHT 330ºC przez 1-2 sekundy (nie ginie pałeczka wąglika)

4. Tyndalizacja - pasteryzacja przeprowadzana raz dziennie przez 3 kolejne dni. Zastępuje sterylizację płynów i produktów wrażliwych na wyższe temperatury, niszczy formy wegetatywne i zarodniki, które podczas obniżenia temperatury do poziomu dla nich optymalnego kiełkują. Po wykiełkowaniu jako postacie wegetatywne bakterii lub grzybów są niszczone podczas ponownego podwyższenia temperatury, np. dla konserw, pożywek bakteryjnych i płynów leczniczych. Czas trwania: 30 minut, czynnik wyjaławiający: unosząca się z gotowanej wody para

• Promieniowanie UV - wady i zalety, czynniki od których zależy skuteczność metody

Skuteczność zależy od:

• Promienie mają zakres działania - najlepsza długość fali 230-290 nm(pochłania bakterie)

• Stopnia zanieczyszczenia powietrza cząsteczkami mechanicznymi

• Obecności materii organicznej

• Wilgotności powietrza

• Ruchu powietrza

• Czasu napromieniowania(minimalnie 30 minut)

• Odległość lampy - im dalej tym słabiej

• Kąta padania promieni

Wady:

• Słaba przenikalność

• Tylko do dezynfekcji powietrza i wody

• Nie niszczy wszystkich drobnoustrojów w pomieszczeniu - działa słabo na grzyby i przetrwalniki

• Optymalna temperatura 27º - 40ºC, przy wilgotności 65%

• 90-95% fal musi mieć długość λ=2537A

Zalety:

• W miarę tania metoda

• Nieskomplikowana obsługa

• Filtracja za pomocą filtrów membranowych z estrów celulozy

1. Przeznaczony dla małych objętości płynów (surowica, pożywki, leki, preparat krwiopochodny)

2. Przeprowadzana dezynfekcja i sterylizacja w zależności od średnicy porów (pory 10-20 nm - nie przechodzą wirusy)

3. Nie absorbują substancji będących składnikiem częściowym, więc nie zmieniają charakteru płynu(termowrażliwych substancji)

4. Metody sterylizacji

1. termiczne:

• sterylizacja za pomocą gorącej, nasyconej pary wodnej, w autoklawie (parametry) - autoklaw

• kocioł częściowo wypełniony wodą i zamykany hermetycznie. Ma termometr, manometr, zawór odprowadzający i bezpieczeństwa

• ciśnienie wewnętrzne autoklawu rośnie proporcjonalnie do temperatury

• parametry: 121ºC - 1 atm - 20 minut

134ºC - 2 atm - 3-4 minuty

• stosowany do: waty, narzędzi, leków, przedmioty gumowe, szkło, pożywki

• sterylizacja suchym, gorącym powietrzem w suszarce (parametry)

• metalowy pojemnik wyglądem przypomina szafkę. Ma termometr, termoregulator, urządzenie podgrzewające

• parametry: 170ºC - 2h

180ºC - 1h

• denaturacja białek bakteryjnych i ich śmierć w wyniku wysokiej temperatury

• do sterylizacji na przykład szkła laboratoryjnego

• sterylizacja chemiczna:

• gazowa:

• formaldehyd

• tlenek etylenu

• za pomocą roztworów:

• aldehyd glutamowy

• formalina

• kwas nadoctowy

• chlorheksydyna (na gorąco) - 70ºC

środki dezynfekujące które mogą działać sterylizująco (większe stężenie, czas działania i temperatura)

• promieniowanie jonizujące (β i γ)

• promieniowanie przenikliwe

• stosowanie: na skalę przemysłową (strzykawki jałowe) przemysł farmaceutyczny, spalanie, opalanie ezy

• sterylizacja plazmowa

najnowsza metoda. Wykorzystuje się H₂O₂ jako źródło plazmy lub inne silne utleniacze, np. wolne rodniki. Potrzebujemy urządzenie, w którym można osiągnąć próżnię, dodać H₂O₂ i włączyć pole elektromagnetyczne. Plazma czyli IV stan skupienia materii powstaje z H₂O₂/wolnych rodników w warunkach głębokiej próżni pod wpływem wysokoenergetycznego promieniowania - powstaje aktywna plazma tlenowa - niszczy błony komórkowe i DNA. Fazy sterylizacji:

1. próżni w komorze sterylizacyjnej

2. iniekcji - wprowadzenie wodnego roztworu H₂O₂ do komory

3. dyfuzji - H₂O₂ przechodzi i pokrywa powierzchnię przedmiotów (40-50 minut)

4. plazmy - włączenie źródła energii o wysokiej częstotliwości (10-15 minut), temperatura 40º- 60ºC

5. wentylacji - przepłukiwania H₂O₂

Nie stosowana na co dzień. Stosowana do sterylizacji aparatury i sprzętu chirurgicznego, endoskopów, rozruszników, sprzęt termolabilny, optyczny, systemy elektronowe, respiratorów, o wąskim świetle przewodu.

Nie sterylizuje materiałów porowatych o wysokiej absorpcji, płynów, materiałów łatwo utleniających się, z celulozy.

Zalety:

• niska toksyczność

• krótki czas sterylizacji

Wady:

• słaba przenikalność w głąb materiałów

• uszkodzenie powierzchni niektórych przedmiotów

• wysoki koszt urządzenia

5. Dezynfekcja skóry:

Powierzchnia skóry dzięki zawartości składników tłuszczowych i białkowych stwarza warunki bytowania dla drobnoustrojów i nigdy nie bywa jałowa. Na skórze są:

• flora stała - wysępują bakterie zawsze (gronkowce koagulo(-), maczugowce). Nie da się usunąć pod wpływem zabiegów higienicznych

• flora przejściowa - sporadycznie występujące bakterie.

• Chirurgiczne mycie rąk - polega na kilkuminutowym myciu rąk mydłem i szczotką w ciepłej wodzie i 3 minutowym nacieraniu skóry 70% etanolem. Alkohol oprócz działania dezynfekującego działa garbująco, zatyka pory i gruczoły, co zapobiega wydostawaniu się drobnoustrojów z głębszych warstw skóry.

• Pole operacyjne - zmycie tłuszczu, po wyschnięciu dodajemy środek dezynfekcyjny:

• Alkohol 70%

• Jodyna

Potem pobieramy np. krew

• Pobranie krwi:

1. pobranie przed antybiotykoterapią

2. ustalić położenie żyły głównej, żył przedramienia aby zminimalizować manipulację igłą po wprowadzeniu

3. zdezynfekowanie miejsca - jodyną, potem alkoholem, po każdym przetarciu poczekać aż miejsce wyschnie - by zabić bakterie i zamknąć pory

4. pobranie jałową igłą i strzykawką krwi w rękawiczkach

5. przetrzeć przed wstrzyknięciem korek hemomedium (podłoże transportowo-namnażające) podłoże musi być ogrzane (minimalna temperatura pokojowa, maksymalnie 37ºC), wstrzyknąć ilość krwi podaną przez producenta (5ml, 15ml)

6. przesłanie w termosie do laboratorium

6. Środki antyseptyczne i ich zastosowanie

Środek antyseptyczny - środek używany do dezynfekcji zewnętrznych powłok organizmu żywego (skóry, śluzówek, ran), które nie powodują uszkodzenia tkanek

Na skórę uszkodzoną: barwniki (rivanol, zieleń malachitowa), pochodne furanu, chloramina 0,5%, kwas borowy, H₂O₂, nadmanganian potasu

Na skórę nieuszkodzoną: 50-70% etanol, chloramina 1-2%, sublimat, jodyna, H₂O₂, detergenty

7. Kontrola urządzeń sterylizujących - metody:

1. fizyczna - wskaźnik stanu technicznego, rejestracja podstawowych parametrów w postaci wykazów - odczyt z termometru(autoklaw, suszarka), manometru(autoklaw)

2. chemiczna - sprawna sterylizacja w postaci taśmy samoprzylepnej(nasączonej związkami chemicznymi które po przekroczeniu danej temperatury topi się i zmienia kolor, wskaźnik sterylizacji -fiolki

3. biologiczna (sporale) - sporotesty - bibułki z przetrwalnikami, najczęściej stosuje się:

1. Bacillus stearotharmophilus - autoklaw = sporal A

2. Bacillus subtilis - suszarki = sporal S

Najlepsza metoda. Każdy sporal posiada bibułkę nasączoną przetrwalnikami danej laseczki. Stosuje się 2 rodzaje bakterie gdyż jedne mogą być bardziej odporne od drugich. Sporale wkładamy do autoklawu w 3 miejscach. Podobnie kontrolujemy suszarkę. Po okresie sterylizacji wyjmujemy bibułkę, wkładamy ją do podłoża płynnego. Inkubujemy w 37ºC. jeśli powstaje zmętnienie - wynik (+) - od razu coś rośnie, tzn. zła sterylizacja. By wydać wynik (-) czekamy 1 tydzień. Metoda stosowana raz w miesiącu.

Przyspieszona metoda - polega na zastosowaniu przetrwalników i podłoża. Do autoklawu dajemy 3 fiolki, po sterylizacji zgniatamy fiolki, inkubacja w 56ºC przez 2 dni. Jeśli kolor zostaje taki sam to znaczy wynik (-) = przetrwalniki zinaktywowane, a jeśli kolor staje się żółty to wynik jest dodatni - są formy wegetatywne

8. Wykorzystanie metod dezynfekcji i sterylizacji w środowisku szpitalnym i laboratoryjnym, krytyka wyboru metody

1. Aparatura i sprzęt chirurgiczny - metoda plazmowa, gotowanie, autoklaw, formalina, chloramina, chlorheksydyna

2. Sprzęt jednorazowego użytku (skala przemysłowa) - spalanie, strzykawka jałowa - promieniowanie β i γ

3. Odzież ochronna - gotowanie, komory formalinowe

4. Szkło laboratoryjne - metoda plazmowa, suszarka, autoklaw

5. Płyny infuzyjne i roztwory leków - tyndalizacja, filtracja, autoklaw

6. Pożywki - tyndalizacja, filtracja, autoklaw

7. Chirurgiczna dezynfekcja rąk - chlorheksydyna, alkohol, mydło, chloramina

8. Przygotowanie pola operacyjnego - alkohol, sublimat, chlorheksydyna

9. Inaktywacja materiałów biologicznych i zużytych materiałów opatrunkowych - fenol

10. Dezynfekcja pomieszczeń sanitarnych - promienie UV, detergenty, lizol, chlorheksydyna

11. Przetrwalniki - formaldehyd, aldehyd glutanowy, podchloryn Na⁺, kwas nadoctowy, natomiast alkohole nie działają

Wirus WZW B - metody i środki:

1. Sterylizacja w autoklawie

2. Działanie tlenku etylenu - sterylizacja sucha i zimna

3. 2% aldehyd glutarowy

4. 20% HCHO

5. Etanol o maksymalnym stężeniu

6. Promienie UV

Wirus HIV - metody i środki

1. 10% roztwór wybielacza (wapno chlorowane)

2. 50% roztwór etanolu

3. 35% roztwór propanolu

4. 0,5% roztwór lizolu

5. 0,5% roztwór paraformaldehydu

6. 0,3% roztwór H₂O₂

Ginie w temperaturze ciała ludzkiego, po 10 minutach działania tych środków.

7. Środki o skrajnych wartościach pH

8. Temperatura 56ºC inaktywuje go po 10 minutach

Ćwiczenie 6

Temat: Lekooporność bakterii

1. Rys historyczny

2. Metody otrzymywania antybiotyków

3. Ogólny podział antybiotyków

1. przeciwbakteryjne

2. przeciwgrzybicze

3. przeciwnowotworowe

4. przeciwpierwotniakowe

Pochodzenie antybiotyku

1. naturalne

2. półsyntetyczne - naturalne zmodyfikowane np.: poszerzenie spektrum

3. syntetyczne

	Chemioterapeutyk	Antybiotyk
Działanie bakteriobójcze i bakteriostatyczne	+	+
Synteza „In vitro”	+	+
Odpowiednik w naturze	-	+

Chemioterapeutyk - preparat o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, syntetyzowany, nie posiadający odpowiednika w naturze, np. sulfonamidy

Antybiotyk - substancja chemiczna wytworzona przez żywe drobnoustroje lub wytworzona syntetycznie lub pół syntetycznie mająca zdolność hamowania wzrostu lub zabijania drobnoustrojów.

Cechy antybiotyku (idealnego):

1. nietoksyczny dla organizmu

2. nie może działać alergizująco i anafilaktycznie

3. dobrze rozpuszczalny w wodzie, roztworach soli soku żołądkowego i jelitowego

4. nie może ulegać zbyt szybko degradacji metabolicznej (być rozkładany do związków nieczynnych i toksycznych)

5. musi być chemicznie trwały (do przechowywania w powszechnie dostępnych warunkach)

6. nie powinien zbyt szybko wywoływać oporności bakterii

7. małą zdolność do wiązania się z białkami krwi

8. najtańsza produkcja

Wybór antybiotyku zależy od:

1. rozpoznania

• objawy kliniczne, dieta pacjenta

• próbki do bakteriologicznej identyfikacji czynnika wywołującego zakażenie

• miejsce zakażenia, wydolność narządowa chorego

• wiek chorego, zażywanie innych leków

• miejsce nabycia zakażenia

2. badania

• jeżeli wiadomo, że wyizolowane drobnoustroje są oporne na leki przeciwbakteryjne

• przy zakażeniach, które wymagają działania leków bakteriobójczych a nie bakteriostatycznych.

• określenia bakteriobójczej aktywności surowicy krwi podczas leczenia - w celu rozpoznania czy zostało zastosowane prawidłowe leczenie

Wybór antybiotyku - jeżeli bakteria jest wrażliwa na działanie dwóch antybiotyków należy wybrać ten lepiej znoszony i działający bójczo

Leki bakteriostatyczne - hamują tylko rozmnażanie bakterii, a ustrój własnymi siłami musi je ostatecznie wyeliminować

Leki bakteriobójcze - pożądane dlatego, że bakterie zostają usunięte bez angażowania sił obronnych organizmu.

4. Podstawowe mechanizmy działania chemioterapeutyków na bakterie

• hamowanie syntezy ściany komórkowej - antybiotyki β-laktamowe i polipeptydowe

• hamowanie, uszkodzenie błony protoplazmatycznej - antybiotyki polipeptydowe i aminoglikozydy

• zwiększenie przepuszczalności błony cytoplazmatycznej

• hamowanie syntezy niezbędnych metabolitów komórkowych - sulfonamidy

• hamowanie syntezy białek - aminoglikozydy, tetracykliny, makrolity, chloramfenikol, kwas fusydowy

• hamowanie syntezy DNA - chinolon, ,metronidazol (u bakterii bezwzględnie beztlenowych), acyklowir

5. Lekooporność bakterii

• genetyczne mechanizmy lekooporności

• oporność chromosomalna

• oporność determinowana chromosomalnie jako podstawa spektrum antybiotyku (tzw. Oporność wrodzona, naturalna)

• mutacyjna (gł. W nukleoidzie)

• oporność pozachromosomalna - determinowana przez plazmidy - nabycie obcego DNA

• mechanizmy ekspresji genotypowej

• produkcja enzymów indukcyjnych, inaktywujących antybiotyk

• modyfikacja receptorów wiążących antybiotyk

• nadprodukcja metabolitu, z którym konkuruje antybiotyk

• zmniejszenie przepuszczalności błony cytoplazmatycznej i ściany komórkowej dla preparatu

• uruchomienie zastępczych szlaków, których nie blokuje chemioterapeutyk, wytwarzanie dodatkowego białka

• sposoby przekazywania materiału genetycznego pomiędzy bakteriami w procesach koniugacji (Gram (-) ), transdukcji (Gram (+) ), transformacji

• transformacje - bakteria staje się kompetentna(zdolna do pobrania DNA), pobiera DNA wyizolowany (laboratoryjnie) lub od dawcy (naturalnie), namnaża się

• transdukcja - przeniesienie materiału genetycznego pryz udziale faga łagodnego, najczęściej odnosi się do bakterii G(+). Odmianą transdukcji jest konwersja lizogenna - C.diphteriae, E.coli, Streptococcus pyogenes.

• Koniugacja - przeniesienie informacji genetycznej zawartej w plazmidzie, fimbriach płciowych. Najczęściej odnosi się do pałeczek G(-). Nabycie nowej cechy bakterii pozwala przeżyć w makroorganizmie:

1. Warunkuje zdolność wytwarzania czynników toksycznych

2. Nabywa lekooporność

Najczęściej spotykana jest transdukcja i koniugacja.

Antybiotyki β-laktamowe

• Substancje hamujące syntezę ściany komórkowej bakterii. To głównie: penicyliny, cefalosporyny. Wszystkie leki β-laktamowe są bakteriobójcze. Niszczą one PBP=białko wiążące penicylinę(penicylin binding protein) powodując, że komórka bakterii nie namnaża się i ginie.

• Białko PBP = białko wiążące penicylinę (β-laktamowy)

• Głównie to transpeptydaza biorąca udział w wiązaniu krzyżowym peptydoglikanu. Penicyliny wiążą i unieczynniają transpeptydazę i krzyżowe wiązania peptydoglikanu

• Inne: karboksypeptydaza - wpływ na krzyżowe wiązania peptydoglikanu i enzymy autolityczne - udział w przetworzeniu materiału budulcowego błon i rozdzieleniu komórek po podziale.

Hamowanie wiązań krzyżowych w warstwie peptydoglikanu:

• Penicylina

• Cefalosporyna

Mechanizmy ekspresji fenotypowej:

Ad. 1.

• β-laktamazy - rozkładają antybiotyk β-laktamowy, który indukuje produkcję enzymu

• pałki G(+) ESBL(+) - to głównie interesuje lekarza w wyniku badania bakteriologicznego

β-laktamazy ESBL = β-laktamazy o rozszerzonym spektrum działania, któe warunkują szczepowi odporność na penicyliny, cefalosporyny, monobaktamy, tzn należy je wykluczyć z terapii orócz karbapenemów i cefamycyn.

Wykrywane testem dwóch krążków:




Na podłoże z posianym badanym szczepem układa się 2 krążki zawierające cefalosporynę/monobaktam. Krążki rozdziela się antybiotykiem zawierającym inhibitor, którego źródłem są ich kombinacje z ampicyliną, piperacyliną, amoksycykliną. Odległość między krążkami - 2 cm. Inkubować 16h w 35ºC.

Powiększenie lub powstanie strefy zahamowania wzrostu bakterii w pobliżu kążka z cefalosporyną lub monobaktamem od środkowego krążka z inhibitorem świadczy o ekspresji ESBL.

Szczep w którym stwierdza się aktywność ESBL należy uznać za oporny na wszystkie cefalosporyny I, II, III generacji mimo, że w badaniu In vitro wykazano na nie wrażliwość. Szczep oporny teżna penicyliny i monobaktamy, które należy wykluczyć z terapii. Można stosować karbapenemy, cefalosporyny IV generacji.

U pałeczek Gram (-) ESBL jest to cecha konstytutywna, to znaczy czy jest antybiotyk czy nie, enzym jest zawsze wytwarzany.

Szczepy ESPL (+) mogą być wrażliwe na antybiotyki β-laktamowe ale tylko jeśli są one połączone z inhibitorem β-laktamaz.

Ad. 5

Modyfikacja białka PBP w pozycji 2. Powstaje białko PBP2a, które zmniejsza powinowactwo komórki bakterii na metycylinę, także na antybiotyki β-laktamowe. Powstaje u gronkowców złocistych opornych na metycylinę = MRSA = Staphylococcus aureus metycyline resistance. Gronkowce te oporne są na antybiotyki β-laktamowe włącznie z połączonymi z inhibitorami β-laktamaz. Obecność tego białka jest determinowana przez gen mecA, dla jego potwierdzenia stosuje się metodę PCR. Drobnoustrój mający ten gen (mecA) jest metycylinooporny (oznaczone jako MRSA - gronkowiec złocisty, MRCNS - gronkowiec koauglozo(-)).

Wankomycyna, teikoplanina - ratują życie pacjentów, którzy są zakażeni MRSA

Streptograminy, ozazolidony - dla szczepów MRSA są które niewrażliwe lub mają obniżoną wrażliwość na wankomycynę.

• MSSA - Staphylococcus aureus metycyline sensitive - gronkowiec złocisty wrażliwy na metycylinę - drobnoustrój nie wytwarzający białka PBP2a. Należy zbadać czy wytwarza β-laktazy przy pomocy testu nitrocefinowego

Test nitrocefinowy




• MLS_B

E - erytromycyna

L - linkomycyna




Wbrew pozorom nie dajemy choremu erytromycyny najpierw, a linkomycynę bo erytromycyna wyhamowuje linkomycynę i później już nie możemy jej podać.

• Antybiotyki polienowe (np. amfoteryczna B produkowana przez rodzinę Streptomyces) działa na błony komórkowe grzybów, która ma sterol a bakterie jej nie mają w swojej błonie - dlatego stosuje się je w zakażeniu grzybami.

• Aminoglikozydy słabo działają na beztlenowce bo transport przez błony komórkowe kosztuje energetycznie i w konsekwencji wymaga dostarczenia tlenu. Na beztlenowce dobre sąklindamycyna, linkomycyna, metronidazol.

• Antybiotyki β-laktamowe - są najmniej toksyczne bo celem działania leku są tylko enzymy bakteryjne. Skutki uboczne to tylko indywidualne uczulenia.

• Test Goukla - wykrywanie antybiotyku w materiale diagnostycznym przysłanym do badania bakteriologicznego. Krążek nasączony moczem (przesłanym) kładziemy na szczep wzorcowy wysiany na płytkę. Gdy jest stosowana antybiotykoterapia to antybiotyk dyfunduje do podłoża i bakterie wyginą. Próbę tą stosuje gdy antybiotyki nie osiągają odpowiednik stężeń, np. w zespole złego wchłanianie.

6. Biokinetyka antybiotyku

• Drogi podania (per os, parenteralnie)

• Wiązanie z białkami surowicy (ustroju)

• Penetracja do komórek organizmu

• Dystrybucja antybiotyku w organizmie - penetracja do płynów ustrojowych, narządów i tkanek

• Wydalanie antybiotyku i kumulacja w organizmie.

7. Metody oznaczenia lekooporności

• Metoda dyfuzyjno-krążkowa

Płytka z podłożem MH (Millera - Hintona), która zawiera substancję najmniej wiążące antybiotyk .Podłoże ma odpowiednią wysokość. Nanosimy badany szczep, wcześniej robiąc zawiesinę z soli fizjologicznej. Po naniesieniu szczepu dajemy krążki z antybiotykami. Bakterie powinny być wcześniej zidentyfikowane by wiedzieć jaki dać antybiotyk. Potem inkubujemy w ciągu 24h. mierzymy średnicę zahamowania wzrostu i wynik odnosimy do tabeli. Np.

Średnica zahamowanego wzrostu = 25 mm

Z tabeli >17 mm szczep wrażliwy

(25>17 mm tzn szczep wrażliwy)

Szczep	Dawka leku
Wrażliwy	Normalna
Średniowrażliwy	Większa dawka
Oporny	Nie ma sensu

Na granicy strefy zahamowania wzrostu wokół krążka jest MIC.

• Oznaczenie MIC (metoda seryjnych rozcieńczeń, E-testy), MBC

MIC - minimal inhibitory concentration = najmniejsza dawka antybiotyku działająca bakteriostatycznie

Metoda seryjnych rozcieńczeń:

Seria probówek z bulionem i podwójnymi rozcieńczeniami danego antybiotyku. Inkubacja 24h. Jeżeli stężenie antybiotyku niższe niż stężenie hamujące - bakterie rosną i zawiesina mętnieje. Jeżeli stężenie równe lub wyższe od hamującego bulion przezroczysty.




Aby sprawdzić czy antybiotyk jest bójczy czy statyczny trzeba pobrać materiałw tym przypadku z probówek 1:1, 1:2, 1:4. Pobrać materiał i posiać bez antybiotyku. Jeśli bakterie wyrosną - bakteriostatyczne, jeśli wyrosną - bakteriobójczo.

E-testy

Badanie wartości MIC danego antybiotyku na drobnoustrój. Są to paski nasączone odpowiednio antybiotykiem. Na podłoże wysiewane są bakterie. Kładziemy pasek z antybiotykiem. Inkubujemy. Miejsce zetknięcia strefy zahamowania wzrostu przy pasku - to MIC.

MBC - najmniejsza dawka antybiotyki działająca bakteriobójczo.

• Znaczenie antybiogramu w terapii

Antybiogram - wynik badania mikrobiologicznego przedstawiony wrażliwość czynnika etiologicznego na różne antybiotyki

Cel antybiogramu:

1. Do wyboru antybiotyku do leczenia

2. metoda porównywania szczepów w dochodzeniu epidemiologicznym

3. udowadnianie reinfekcji czy nadważania innym szczepem.

Jeśli wynik antybiogramu przedstawia 5 antybiotyków na które wrażliwy jest drobnoustrój - który wybierzesz.

1. najmniej toksyczny (β-laktamy)

2. z niskim MIC, lek bakteriobójczy

3. nie wywoła odczynu uczuleniowego (np. penicylina powoduje wstrząs)

4. niska cena

5. o wąskim spektrum działania

6. forma podania , Ew. przeciwwskazania

7. penetracja do miejsc zakażenia

8. Synergizm i antagonizm antybiotyków.

Synergizm - działanie dwóch antybiotyków jednocześnie daje większy efekt niż zastosowanie ich osobno

Antagonizm - zastosowanie dwóch antybiotyków jednocześnie daje mniejszy efekt niż podanie ich osobno, np. podanie bakteriobójcze i bakteriostatyczne.

Warunki jakie antybiotyk spełnia by był efekt synergistyczny:

1. nie łączymy bakteriobójczych ze statycznymi

2. działanie na różne mechanizmy, np. na zahamowanie ściany a drugi na syntezę białek.

Wskazania do terapii skojarzonej

1. do zapobieżenia lub opóźnienia powstania mutantów opornych zwłaszcza w gruźlicy

2. dla uzyskania addycyjnego lub synergistycznego działania w stosunku do jednorodnej populacji bakterii opornych

3. w zakażeniach mieszanych, np. beztlenowcami i tlenowcami (beztlenowce - gantamycyna, tlenowce - cefalosporyny)

4. gdy zachodzi potrzeba natychmiastowego rozpoczęcia leczenia ciężkich zakażeń zanim uzyska się wyniki badań laboratoryjnych (posocznica bakteriami G(-)).

9. Bakteriobójczy i bakteriostatyczny efekt działania antybiotyku

• laboratoryjne metody rozpoznawania efektu bakteriobójczego i bakteriostatycznego na bakterie - patrz punkt 7 - metoda seryjnych rozcieńczeń

• zalety i wady bakteriobójczego i bakteriostatycznego efektu działania antybiotyku w terapii zakażeń.

Bakteriostatyczne	Bakteriobójcze
Hamowanie wzrostu bakterii	Zmniejszają liczbę żywych bakterii, zabijają jedynie formy rosnące
Działając długo może stać się bójczy	Usunięcie bakterii bez angażowania sił obronnych ustroju - ważne u osób starszych, noworodków, o obniżonej odporności
Organizm sam musi usunąć bakterie

10. Uboczne skutki antybiotykoterapii

• wpływ na florę fizjologiczną i związane z tym zagrożenia:

• zniszczenie floty fizjologicznej co prowadzi do dysbakteriozy, awitaminozy

• wyjałowienie organizmu powoduje podatność na kolonizację patogenem, np. zakażenie grzybem (Candida albicans)

• wpływ na powstawanie szczepów bakterii opornych:

• antybiotyk pełni rolę selektywną w stosunku do szczepów opornych. Działa na populację bakterii umożliwia jednocześnie powstawanie i namnażanie bakterii opornych na dany antybiotyk.

• Alergia - wstrząs anafilaktyczny, wysypki skórne

• Toksyczność

• Toksyczne uszkodzenia narządów (trwałe/przejściowe)

• Trwałe uszkodzenie skóry

• Biegunka poantybiotykowa (C. difficile), Ew. rzekomobłoniaste zapalenie jelit

11. Zasady i cel oznaczania poziomu antybiotyku w surowicy i płynach ustrojowych chorego.

• Test Goulda - patrz pkt. 5

• Pobranie krwi od pacjenta poddanego antybiotykoterapii:

1. pobrać próbkę krwi przed kolejną dawką leku lub dwie godziny po by stężenie leku było niskie

2. rozcieńczyć surowicę pacjenta i antybiotyk w bulionie

3. dodać szczep wzorcowy do surowicy i antybiotyku

4. inkubacja

5. odczytać rozcieńczenie z probówki w której zahamowany jest wzrost bakterii (MIC) - probówka z antybiotykiem

6. odczytać z drugiego rzędu odpowiadającą probówkę i znasz wartość MIC - surowica

7. odczytać poziom antybiotyku w surowicy

Cel:

1. sprawdzenie czy lek jest odpowiednio szybko metabolizowany, czy dawka nie jest za duża/mała

2. sprawdzenie czy lek osiągnął stężenie bakteriostatyczne/bójcze

3. Sprawdzenie czy hamuje rozwój innych drobnoustrojów w surowicy krwi

12. Przyczyny niepowodzeń antybiotykoterapii pomimo stosowania antybiotyku zgodnie z antybiogramem

1. uznanie za czynnik etiologiczny innego drobnoustroju niż ten który jest rzeczywiście odpowiedzialny

2. zła interpretacja wyników antybiogramu

3. źle wykonany antybiogram

4. lokalizacja bakterii w miejsce, gdzie antybiotyk źle przenika

5. złe dawkowanie leku (czas brania, dawka leku)

6. wtórne zakażenie drobnoustrojami opornymi na antybiotyk

7. zestaw antagonistycznej kombinacji leków, interakcja z innymi lekami

8. działanie osłonowe innych leków

9. zaburzenie wchłaniania

13. Oporność krzyżowa - pojawienie się oporności bakterii na jeden antybiotyk może być skojarzone z powstawaniem oporności dl całej grupy związków o podobnej budowie

Antybiotykozależność bakterii - bakterie podczas leczenia stają się zależne od obecności antybiotyku w środowisku, wykazują oporność, w zależności od stopnia przyzwyczajenia bakterii spostrzegano zupełny brak lub znaczne zwolnienie wzrostu, jeśli w pożywce nie było antybiotyku

Terapia skojarzona - dotyczy często pacjentów z zakażeniami szpitalnymi. Ma na celu poszerzenie spektrum potencjalnych czynników zakażenia. Uzyskanie efektów synergistycznych, opóźnienie rozwoju bakteryjnej oporności i zmniejszenie dawek leków o znacznych efektach niepożądanego działania

Chemioterapia empiryczna - wybór właściwego antybiotyku bez oczekiwania na wynik bakteriologicznego badania. Kierujemy się danymi epidemiologicznymi dla procesu chorobowego (określają jakie drobnoustroje odpowiedzialne są za te objawy chorobowe i określają lekooporność na określonym terenie)

Chemioterapia celowana - terapia po ustaleniu badań bakteriologicznych i antybiogramie

Chemioterapia etiotropowa - terapia obowiązująca na świecie - znamy czynnik etiologiczny, ale nie mamy antybiogramu.

Stałe

Półpłynne

Płynne

Podłoża

Psychrofilne

Bakterie

Mezofilne

Termofilne

---