004

200 g zamrożonych pieczarek rozdrobnić nożem i dodać 250 ml acetonu ochłodzonego do -20^UC a następnie homogenizować w homogenizatorze nożowym (4 x po 20 sekund)

Przesączyć homogenat na łejku Buchnera przez bibułę Whatman Nr 1 pod próżnią pompki wodnej (wytrącenie enzymu do osadu)

Przesącz    Odsączony, papkowaty osad zebrać , ponownie

odrzucić    zhomogenizować z 250 ml acetonu ochłodzonego do

-20°C i pr/efiltrować — jak poprzednio

Przesącz    OSAD zhomogenizować z 180 ml oziębionego, 30% acetonu

odrzucić    (ekstrakcja enzymu) a następnie odwirować preparat

(30 min. x 3000 x g ) na wirówce K-70 z chłodzeniem

Osad    Do otrzymanego SUPERNATANTU dodać 180 ml acetonu (-20° C),

odrzucić    pozostawić w zamrażałniku do wytrącenia się osadu i odwirować

ten osad — jak poprzednio (ponowne wytrącenie enzymu)

Supernatant -    OSAD - rozpuścić w 60 ml 0,1 M buforu fosforanowego ( 0°C ),

odrzucić    dodać małymi porcjami, mieszając, stały siarczan amonu do uzyskania

20% nasycenia. Pozostawić mieszaninę w^r lodzie na 30 min. po czym odwirować osad (K-24 , 20 min. x 16000 x g

Osad - odrzucić Do SUPERNATANTU dodać stałego siarczanu amonu do otrzymania 65% nasycenia. Pozostawić preparat w lodzie na 60 min. po czym odwirować OSAD ENZYMU

Supernatant -

OSAD rozpuścić w 25 ml buforu fosforanowego, wydializować (opcja), PREPARAT ENZYMU ( przechowywać zamrożony w^r - 20°c)

Schemat 1 . Oczyszczanie tyrozynazy z pieczarki dwuzarodnikowej [wg. 2|

4