1112

4.    Zawiesić komórki w 40 pl buforu do sortowania na 10⁷ komórek.

5.    Dodać 10 jal koktajlu biotyna-przeciwciała na 10⁷ komórek.

6.    Bardzo dokładnie wymieszać i inkubować w4-8°C przez 10 min.

7.    Dodać 30 pl buforu do sortowania, 20 pl kulek magnetycznych opłaszczonych przeciwciałem przeciwko biotynie.

8.    Zawiesinę dokładnie wymieszać i inkubować w 4-8°C w' ciemności przez 15 min.

9.    Komórki przepłukać poprzez dodanie 1-2 ml buforu do sortownia i wirować (10 min, 4°C, 350 x g).

10.    Całkowicie usunąć supernatant.

11.    Komórki zawiesić w buforze do sortowania (komórki w ilości do 10⁸ można zawieszać w 500 pl buforu).

12.    Kolumnę MS umieścić w polu magnetycznym separatora i przepłukać 500 pl buforu do sortowania i poczekać aż będzie pusta. Następnie na tę samą kolumnę nanieść zawiesinę komórek. Komórki, które przeszły przez kolumnę należy zebrać do now^rej probówki, są nimi komórki CD4.

13.    Kolumnę MS przepłukać 3 x 500 pl buforu do sortowania, który¹ należy dodawać dopiero jak kolumna będzie pusta. W eluacie będą niewielkie ilości komórek CD4.

Uw aga. Jeśli dysponujemy większą ilością komórek niż 10⁷, to należy proporcjonalnie do

ilości komórek zwiększyć ilość buforu do sortowania, kulek magnetycznych

1    przeciwciał.

Przygotowanie buforu do sortowania:

Skład

0.5% BSA

2    mM EDTA

PBS bez jonów Ca^2r i Mg²*

pH buforu doprowadzić do 7.2 i bufor zostawić w 4-8°C