5

C. Badanie wpływu stężenia substratu na aktywność katalityczną kwaśnej fosfatazy. Wyznaczanie stałej Michaełisa (K_lM).

Przygotowanie roztworów substratu

Z 1 mM roztworu p-nitrofenylofosforanu w 0,5 M buforze Tris-octan pH 5,5 przygotuj po 1 ml roztworów o następujących stężeniach: 0,2 mM, 0,4 mM 0,6 mM, i 0,8 mM i 1 mM. Używając 10 mM roztworu tego substratu przygotuj po 1 ml roztworów o stężeniach: 2 mM; 4 mM; 6 mM; 8 mM. Do przygotowania roztworów użyj 0,5 M w buforu Tris-octan pH 5,5. Wykonanie oznaczenia

Do 27 probówek dodaj po 0,25 ml substratu o odpowiednim stężeniu (9 x 2 = 18 prób badanych + 9 prób kontrolnych dla każdego stężenia substratu). Wszystkie próby umieścić w termostacie o temperaturze 37°C na 5 minut, po czym rozpocznij reakcję dodając po 0,25 ml odpowiednio rozcieńczonego enzymu. Próby inkubuj 15 minut. Reakcję przerwij dając do każdej próby 2,5 ml 0,1 M NaOH. Do prób kontrolnych z substratem po 15 minut inkubacji dodaj 2,5 ml 0,1 M NaOH a następnie 0,25 ml enzymu. Zamieszaj!

Dokonaj pomiaru fotometrycznego przy X = 405 nm wobec odpowiednich prób kontrolnych.

OPRACOWANIE WYNIKÓW

A.    Posługując-się krzywą standardową lub korzystając ze współczynnika kalibracji, oblicz szybkość reakcji (v), odpowiadającą ilości p-nitrofenolu uwolnionego w każdej próbie w ciągu 1 min reakcji (pmole x min'¹ x ml"¹).

B.    Sporządź wykres zależności szybkości reakcji od stężenia substratu. UWAGA! Przed sporządzeniem wykresu należy obliczyć stężenie substratu w mieszaninach reakcyjnych.

C.    Oblicz odwrotności stężeń substratu (1/[SJ) i odwrotności szybkości reakcji (1/V) przy danym stężeniu substratu. Na podstawie tych danych sporządź wykres Lineweavera-Burka. Odczytaj z wykresu 1/Km i oblicz wartość stałej Michaełisa (Km) oraz V_max.

D.    Oblicz wartość v/[S] i sporządź wykres Eadie-Hofstee. Odczytaj z wykresu wartość V_max i korzystając z wykresu oblicz Km- Oceń przydatność obu metod w analizie wartości Km i V_max enzymów.

5