5 (338)

Załącznik 5.

Techniki stosowane w diagnostyce wścieklizny - wczoraj i dziś?

Anna Orłowska, fylarcin Smreczak, Jan F, Żmudziński Zakład Wirusologii, Państwowy Instytut Weterynaryjny - Państwowy Instytut Badawczy

Wścieklizna jest ostrą wirusową infekcją ośrodkowego układu nerwowego, 'występującą u zwierząt lądowych (w tym również u ludzi) oraz nietoperzy. Typowe objawy kliniczne choroby obejmują zmiany w zachowaniu (agresja) i postępujący paraliż prowadzący do śmierci. Transmisja choroby następuje zazwyczaj poprzez pogryzienie ponieważ wirus wścieklizny znajduję się w ślinie chorego zwierzęcia. Czynnikiem wywołującym chorobę jest neurotropowy wirus wścieklizny należący do rodziny Rhabdoviridae i rodzaju Lyssavirus. Genom jego stanowi jednonidowy, niesegmentowany kwas rybonukleinowy o ujemnej polarności, zawierający 5 genów kodujących białka strukturalne wirusa wścieklizny: nukleoproteinę, fosfoprotelnę, białko matriks, glikoproteinę oraz RNA zależną polimerazę RNA. Analiza filogenetyczna oparta na porównaniu sekwencji genów kodujących nukleoproteinę i glikoproteinę wirusa wścieklizny wykazała występowanie 7 genotypów w obrębie rodzaju Lyssavirus (Johnson N., 2002). Są to klasyczny wirus wścieklizny (genotyp 1), wirus Lagos (genotyp 2), Mokola

snotyp 3), Duvenhage (genotyp 4), European Bat Lyssavirus typ 1 - EBLV 1 (genotyp 5) i typ 2 -EBLV 2 (genotyp 6) oraz Australian Bat Lyssavirus -ABLV (genotyp 7). W Polsce występują klasyczny wirus wścieklizny u zwierząt lądowych oraz EBLV 1 u nietoperzy.

[Diagnostyka wścieklizny opiera się na wykrywaniu antygenu wirusowego, izoiacji całego wirusa lub jego kwasu rybonukleinowego. Pierwszym badaniem mikroskopowym stosowanym w diagnostyce wścieklizny było badanie histopatologiczne, polegające na wykrywaniu zasadochłonnych wtrętów zwanych ciałkami Negriego w cytopiazmie neuronów (Surreau P, 1996)tyRuty nowa diagnostyka wścieklizny obejmuje odczyn immunofluorescencji bezpośredniej (FAT - fluorescent antibody test) oraz izolację wirusa wścieklizny na myszach (MIT - mouse inocuiation test) lub w hodowli komórek neuroblastomy (RTCIT - rabies tissue culture inocuiation test) (Smreczak M, 2004)./'Materiał do badań stanowi tkanka mózgowa, a w szczególności rogi Amona, móżdżek oraz wzgórze, ponieważ głównie tam dochodzi do namnażania się wirusa wścieklizny?; W teście immunofluorescencji bezpośredniej, opartym na reakcji antygen - przeciwciało, wykrywa się antygen wirusa wścieklizny, który stanowią jego białka. Z nadesłanego materiału wykonuje się preparaty odciskowe. Następnie znakuje się je koniugatem zawierającym przeciwciała, skierowane przeciwko białkom wirusa wścieklizny, skoniugowane z izotiocjanianem fluoresceiny, który w świetle UV emituje charakterystyczne zielone ^wiatło. Dzięki temu, w przypadku obecności w badanym materiale wirusa, dochodzi do reakcji antygen - przeciwciało czego wynikiem jest charakterystyczna zielona fluorescencja widziana pod mikroskopem w świetle UV.

W testach MIT oraz RTCIT izolowany jest żywy wirus wścieklizny. Myszy białe zakaża się domózgowo zawiesiną badanego mózgowia, a następnie obserwuje przez 30 dni. Zwierzęta, u których wystąpiły objawy choroby usypia się a ich mózgowia sprawdza w teście FAT na obecność antygenu wirusowego. Izolacja wirusa w hodowli komórek neuroblastomy, zastępująca MIT, polega na 72 godzinnej inkubacji komórek i zawiesiny badanego mózgowia, a następnie wyznakowaniu utrwalonej hodowli komórek koniugatem FITC. W przypadku obecności wirusa wścieklizny w cytopiazmie komórek neuroblastomy widoczne są ciałka wtrętowe o charakterystycznej zielonej fluorescencji.

W badaniach naukowych klasyczne techniki stosowane w diagnostyce wścieklizny ze względu na czułość reakcji, jakość badanego materiału oraz czas potrzebny na uzyskanie wyniku, zastępowane są przez molekularne metody, polegające na wykrywaniu materiału genetycznego wirusa. Wśród nich wyróżnia się reakcje RT-PCR, heminested RT-PCR oraz

PCR w czasie rzeczywistym (rea! - time RT - PCR). Wymienione metody są znacznie czulsze od klasycznych technik stosowanych w diagnostyce wścieklizny, a ponadto umożliwiają wykrycie wirusa w próbkach w stanie rozkładu gnilnego, gdzie zastosowanie metod immunofluorescencji I izolacji

Strona 6 z 7