Elektrofereza

3. Elektroforeza

3.1. Wiadomości ogólne

Cząsteczki DNA, posiadające na swej powierzchni ładunek ujemny, poruszają się poprzez podłoże (żel agarozowy lub poliakryloamidowy) w kierunku elektrody, posiadającej przeciwny ładunek niż rozdzielane cząsteczki. Funkcją żelu jest zapobieganie dyfuzji oraz stabilizacja pH.

Szybkość migracji cząsteczek DNA w żelu agarozowym zależy od wielu czynników.

Masa cząsteczkowa DNA. Liniowe cząsteczki DNA migrują w żelu z szybkością, która jest odwrotnie . proporcjonalna do log_]0 ich masy cząsteczkowej.

Stężenie agarozy. Im stężenie agarozy jest wyższe, tym wolniejsza jest migracja DNA. Istniejąca linio-wa zależność pomiędzy logarytmem elektroforetycznej ruchliwości DNA w żelu (p) i stężeniem agarozy (y) wyrażona jest wzorem: log p = log p_u - Ky, gdzie: p_o - swobodna elektroforetyczna ruchliwość DNA, K — współczynnik spowalniania (const), związany z właściwościami żelu oraz wielkością i kształtem migrujących cząsteczek. Zakres rozdziału liniowego DNA w zależności od stężenia agarozy w żelu przedstawiono w tabeli 2.

Tabela 2. Zakres rozdziału liniowego DNA w różnych stężeniach agarozy o standardowej rozdzielczości

Stężenie agarozy w żelu [%]	Zakres rozdziału liniowego DNA [kpz]
0,3	5-60
0,6	1-20
0,7	0,8-10
0,9	0,5-7
1,2	0,4-6
1,5	0,2-3
2,0	0,1-2

Konformacji DNA. Superzwinięte cząsteczki DNA (forma 1, CCC), cząsteczki DNA naciętego kolistego (forma II, OC) i DNA liniowego (forma III, L) o tej samej masie migrują w żelu z różną szybkością (rys. 1). Względna ruchliwość tych form DNA zależy od: stężenia agarozy w żelu, wielkości natężenie prądu, siły jonowej buforu, gęstości superhelikalnych skrętów w cząsteczce DNA forra^ j§

Rysunek I. Tempo migracji DNA w zależności od konformacji cząsteczek

— 20 —