img281

74 Grzegorz Hess

14.1.3. Przykłady zadań do wykonania

14.1.3.1.    Efekty podania związków farmakologicznych

a.    Które z następujących związków, podawanych oddzielnie do płynu inkubacyjnego, nie blokują możliwości generowania potencjału czynnościowego przez włókno mięśniowe? ,

-    CTX i TTX

-    TUB i TTX

-    NEO i DAP

-    DAP i CTX

b.    Podanie DAP (3,4—diaminopirydyny) powoduje:

-    przedłużenie czasu trwania potencjału czynnościowego na skutek blokady kanałów sodowych

-    skrócenie czasu trwania potencjału czynnościowego na skutek blokady kanałów sodowych

-    skrócenie czasu trwania potencjału czynnościowego na skutek blokady kanałów potasowych

-    żadne z powyższych

c.    Które z następujących związków, podawanych oddzielnie, blokują możliwość generowania potencjałów postsynaptycznych wywołanych stymulacją elektryczną?

-    CTX i TTX

-    TUB i TTX

-    TTX i NEO

-    DAP i TUB

14.1.3.2.    Efekty zmian środowiska jonowego

a.    Proszę zmniejszyć [Ca²*] do 1 mM, zwiększyć [Mg²*] do 2 mM, ustawić skalę „oscyloskopu” na zakres: do -90 do —45 mV i kilkakrotnie stymulować nerw. Zamiast potencjału czynnościowego włókna mięśniowego w tych warunkach obserwuje się podprogowe potencjały postsynaptyczne. Czy jest to wynik:

-    zaniku możliwości generowania potencjału czynnościowego przez włókno mięśniowe?

-    hiperpolaryzacji włókna mięśniowego?

-    zwiększonego uwalniania neuroprzekażnika?

-zmniejszonego uwalniania neuroprzekażnika?

b.    Proszę zmniejszyć [Ca²*] do 1 mM, zwiększyć [Mg²*] do 2 mM i kilkakrotnie stymulować nerw, za każdym razem kopiując uzyskany przebieg do „pamięci ekranu”. Proszę zwrócić uwagę na różnice amplitudy pomiędzy potencjałami postsynaptycznymi. Czy są one wynikiem:

-    różnej ilości neuroprzekażnika w pęcherzykach synaptycznych?

-    różnej liczby pęcherzyków synaptycznych uwalniających neuroprzekaźnik pod wpływem kolejnych bodźców?

-    różnic w potencjale spoczynkowym włókna mięśniowego?

-    różnic w sile stosowanych bodźców?

Literatura

Kandel E. i Schwartz J.H. (red.): Principles ofNeural Science, Elsevicr, New York 1985.

OZNACZANIE STĘŻENIA I AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ BIAŁKA

Pracownia Badań Biostrukturainych Zakładu Fizjologii Zwierząt UJ

Wstęp

W pracy laboratoryjnej, a zwłaszcza przy izolacji i oczyszczaniu preparatów białkowych, niezwykle ważne jest ilościowe i jakościowe śledzenie poszczególnych etapów preparatyki, czyli określanie stężenia i aktywności danego enzymu.

15.1.    Wykonanie ćwiczeń

15.1.1.    Oznaczanie stężenia białka w próbce metodą Lowry’ego

Zasada: Wiązanie peptydowe oraz aminokwasy aromatyczne (tyrozyna i tryptofan) wchodzą w reakcję z odczynnikiem Folina-Ciocalteu (roztwór kwasu fosforomolibdenowolframo-wego). Reakcja przebiega w środowisku zasadowym, w obecności jonów miedziowych, t W pierwszym etapie następuje przyłączenie jonów miedzi Cu(II) do wiązań peptydowych (reakcja biuretowa). W drugim etapie następuje redukcja kwasów fosforowolframowego i fosforomolibdenowego do odpowiednich tlenków przez miedź związaną z białkiem oraz przez tyrozynę i tryptofan zawarte w oznaczanym białku. Absorbancję powstałego zabarwienia odczytuje się przy X = 500 nri).

Zalety: Metoda Lowry’ego pozwala na oznaczenie białka już w stężeniu 1 pg/ml, jest zatem około 100 razy bardziej czuła niż metoda biuretowa i bardziej czuła niż tradycyjna metoda spektrofotometryczna.

Wady: Poszczególne białka dają różne natężnie barwy z odczynnikiem Folina-Ciocalteu (np. białka surowicy i hemoglobina dają barwę słabszą niż trypsyna, lecz znacznie intensywniejszą niż żelatyna). Należy zatem stosować odpowiednie wzorce białkowe.

Fenole i nitrofenole, puryny i pirymidyny, kwas moczowy oraz niektóre detergenty reagują z odczynnikiem Folina-Ciocalteu, zwiększając natężenie barwy. Związki takie, jak: ZnS0₄, (NH₄),S0₄, CCljCOOH, HC10₄, etanol, sacharoza, w zależności od stężeń obniżają intensywność barwy.