0000030(2)

genetyka

UMIESZCZENIE GENU W POŻĄDANYM REJONIE NIE JEST TAKIE PROSTE

Jest to jeden z największych problemów z jakim zetknęła się inżynieria genetyczna. Do dzisiaj bowiem me opanowano techniki pozwalającej na umieszczanie genu w konkretnym miejscu. Prowadzi to często do efektów ubocznych, polegających na wyłączeniu innego genu (np. wstawienie nowego genu „w środek" innego). Na dzisiaj jedynym wyjściem jest więc wykonywanie wielu prób i selekcjonowanie tych komórek, które wykazują komplet pożądanych cech.

INŻYNIERIA GENETYCZNA ROZBUDZA NADZIEJE. ALE I OBAWY

Skuteczne stosowanie inżynierii genetycznej z korzyścią dla nas wszystkich wymaga rozwiązywania wielu problemów m.in.:

I Wynikających z odmienności dawców, wektorów i (lub) biorców:

A)    Najwięcej problemów nastręcza odmienna organizacja materiału genetycznego Pro- i Eu-caryom. Przykładowo, umieszczenie eukariotycznego genu w komórce E. coli nie da pożądanego efektu, ponieważ ta ostatnia nic ma enzymów umożliwiających wycinanie intronów i łączenie egzonów w jedną całość. Rozwiązaniem może być synteza sztucznego genu, nic zawierającego sekwencji intronowych (por. niżej);

B)    Obecność ściany komórkowej u roślin iest jedną z przyczyn niemożności bezpośredniego zastosowania wektorów fagowych. Dlatego jako ..transporter” służy bakteria Agrobacteriu -im tumefaciem, wywołująca za pomocą specjalnego plazmidu oznaczonego jako Ti guzowatość korzeni i łodyg. Plazmid ten można „rozbroić” pozostawiając jednak możliwość wstawiania do chromosomu rośliny dodatkowego genu. Prawdziwy' kłopot polega więc na tym, że opisywana bakteria atakuje wyłącznie rośliny dwuliścienne, a i to nic wszystkie. Tymczasem nas najbardziej interesuje możliwość tworzenia zmienionych genetycznie roślin jednoliścicnnych (głównie zbóż). Dlatego na całym świccie poszukuje się dobrego wektora właśnie dla takich roślin. Poza tym coraz powszechniej testowane są inne metody wprowadzania obcego DNA do komórek roślinnych, np. przy wykorzystaniu tzw. działa genetycznego. W metodzie tej DNA nanosi się na mikroskopijne cząstki metalu, np. złota. Następnie wstrzeliwuje się je do komórek. Duża prędkość drobin umożliwia przebicie ściany komórkowej i trafienie w jądro komórkowe. Tam zaś część wprowadzonego DNA ulega dołączeniu do chromosomów;

UWAGA: Rozbrajanie wektora polega na wyłączeniu lub wręcz zniszczeniu tych jego genów, które wywołują nieporządanc efekty.

2. Konieczności dysponowania odpowiednio opisanymi, licznymi kopiami wszystkich genów

danego gatunku. Osiąga się to tworząc:

A) biblioteki (banki) genomowe. czyli zbiory kopii fragmentów DNA konkretnego gatunku połączone z cząsteczkami wektorów. Biblioteki genomowe zawierają wiec calv DNA- W przypadku organizmu eukariotycznego fragmenty zawierają kompletne geny struktury (zarówno ich egzony, jak i introny), sekwencje kontrolne, a nawet satDNA. Ze względu na szereg cech unikalnych wymienionych sekwencji, bezpośrednia przydatność banków geno-mowych do uzyskiwania nowych organizmów jest niewielka. Jedną z przyczyn tego stanu rzeczy może być np. możliwość dokonywania przez restryktazę cięć wewnątrz genu, co prowadzi do powstawania niefunkcjonalnych odcinków DNA. Sens tworzenia takich zbiorów polega więc głównie na gromadzeniu i opisywaniu genów, ich otoczenia oraz produktów ekspresji, co może być pomocne w innych zabiegach:

B) biblioteki cDNA. Aby uzyskać prawidłową ekspresję genu w zmienionych komórkach, często stosuje się zupełnie inne podejście do materiału genetycznego. Otóż do stworzenia banku genów wykorzystuje się mRNA danego organizmu. Poprzez odwrotną transkrypcję uzyskuje się dwuniciową cząsteczkę tzw. cDNA. który następnie łączy się z wektorem i namnaża. Uzyskany sztucznie cDNA jest komplementarny do mRNA, ten zaś tylko do egzonów swojego macierzystego DNA. Tak więc wprowadzenie cDNA do komórki proka-riotyczncj daje spore szanse na prawidłową ekspresję (m.in. omijamy problemy wynikające ze specyfiki obróbki posttranskrypeyjncj u Eucaryota). Rozwiązanie tego rodzaju, obok niewątpliwych zalet, ma też pewne wady. Przede wszystkim problem stanowi pozyskanie właściwego mRNA, ponieważ w komórce eukariotycznej może znajdować się w jednym momencie nawet kilka tysięcy różnych cząsteczek tego związku. Tak więc, synteza cDNA wszystkich genów organizmu jest niesłychanie żmudne. Poza tym uzyskanie prawidłowej ekspresji genu w innej komórce może wymagać wprowadzenia odpowiednich rejonów regulatorowych (promotorów i operatorów), a tego cDNA także nie zapewnia. Krótko mówiąc, ograniczeniem jest to. że cDNA nie iest odbiciem całego DNA badanego gatunku.

Jednym z największych wyzwań dla „inżynierów-genetyków" jest oczywiście stworzenie i opisanie obu rodzajów bibliotek dla naszego gatunku. Na razie można tylko powiedzieć, że droga do tego celu jest jeszcze daleka;

3.    Wynikających z niewielkiej pojemności wektorów. Używane do przenoszenia DNA wektory plazmidowe mogą pomieścić dodatkowe odcinki DNA o długości do 10 000 par nuklcotydów (10 kb; od ang. 1 kilobasc = 1 000 par zasad). Nieco lepiej przedstawia się sprawa z wektorami fagowymi, ponieważ mogą one przenosić DNA długości do 15 kb. Niestety geny eukariotyczne często są większe. W tych przypadkach stosuje się, np. mikroiniekcje jądra komórkowego (w uproszczeniu: „mikronakłucia”) albo działa genetyczne, a więc praktycznie bezpośrednie wprowadzanie DNA:

4.    Wynikających z używania cząstek infekcyjnych. Dlatego wykorzystywane do przenoszenia wektory muszą hvć trwale ..rozbrojone". W końcu nikt nie chce. aby wirus używany jako wektor zrealizował swój program życiowy. Oczywiście stosowane w laboratoriach szczepy wektorów zostały genetycznie zmodyfikowane tak. że są zdolne do infekcji, nie mają jednak żadnych możliwości zrealizowania swojego cyklu życiowego, ponieważ nie wytwarzają kilku kluczowych białek, np. wirusowej polimerazy DNA, białek blokujących DNA gospodarza itd;

5.    Zmniejszenia ryzyka związanego z manipulacjami genetycznymi. Twory powstające w laboratoriach biotechnoloeicznych mogą być niebezpieczne dla człowieka lub innych organizmów. Dlatego:

A)    do uzyskiwania pożądanych substancji, np. insuliny stosuje się szczepy bakteryjne zmodyfikowane genetycznie tak. żc nie są zdolne do życia w warunkach naturalnych:

B)    bardzo dokładnie bada się wytwory inżynierii genetycznej zanim zostaną wyprowadzone poza laboratoria, np. nowe odmiany roślin uprawnych:

C)    przepisy dotyczące budowy i warunków eksploatacji laboratoriów są niezwykle rygorystyczne;

D)    wprowadzono zakaz wykonywania pewnych badań, a inne wymagają szczególnego nadzoru.

223