03032008(003)(1)

IWUWUIH l**; (tw^ouom w^gięacin oopowicttue) pony

referencyjnej

1) OMrryf się/cmc RNA przyjmując, te lOD-......pgtal RNA

Dzień D

Odwrotna transkrypcja RNA

1.    Przygotować mieszaninę reakcyjną, cały czas pracując na lodzie

•    RNA - 0.1-5 jxg

•    primer o specyficznej sekwencji 20 pmol na reakcję

•    DEPC-HyO - do 11 ul obj końcowej

2.    Delikatnie wymieszać, a następnie żwirować 3-4 %

przenieść aa lód.

3 Inkubować mieszaninę w temp 7()"( ‘ przez 5 minut, a km^hc 4. Następnie kolejno dodać:

•    bufor reakcyjny (5x) - 4|«l

•    inhibitor rybonuklcazy (40 U/|il) - 0.5 pl

•    mieszanina dNTP (10 mM) 2 pl

5    Delikatnie wymieszać a następnie żwirować przez 3-41

6    Inkubować mieszaninę w temp 37®C przez $ mmui

7    Dodać 2pl odwrotnej transkrypin/y M-MulV (201' pi) Końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 20 pi

I (temperatura aktu od inm. a następnie przenid

K Inkubować mieszaninę w temp S7*C lub 42*0 przez 60 nimi tylego enzy mu)

t firtytnf reakcję ogrzewając ■ntwią do WC prań 10 m aa lód.