02

■

o znanych stężeniach i wykonać szereg chromatografii kalibracyjnych, aby znaleźć zależność między ilością nastrzykiwanego wzorca a powierzchnią powstającego na chromatogramie szczytu (wyznaczyć krzywą kalibracyjną dla danego związkuji Konieczne jest również odczytanie z chromatogramu charakterystycznego czasu retencji (/?,) chromatografowanego związku, który jest czasem upływającym od nastrzyknięcia roztworu związku na kolumnę do momentu pojawienia się odpowiadającego mu szczytu zarejestrowanego przez detektor. Pozwoli to prawidłowo zidentyfikować szczyt oznaczanego związku na chromatogramie zawierającym wiele innych szczytów wywoływanych przez pozostałe składniki analizowanej mieszaniny.

W nowszych typach chromatografów zarówno wyznaczenia czasów retencji wszystkich szczytów chromatogramu, jak i pomiaru pola powierzchni pod nimi dokonuje oprogramowanie chromatograficzne komputera. W starszych chromatografach (wyposażonych w rejestrator zamiast komputera) czas retencji szczytów odczytuje się z papieru milimetrowego, uwzględniając szybkość przesuwu papieru w rejestratorze, a parametrem mierzonym w celu określenia ilości związku jest zazwyczaj nie powierzchnia szczytu, lecz jego wysokość, która również jest wprost proporcjonalna do ilości związku naniesionego na kolumnę.

Zastosowanie różnych typów nośników chromatograficznych jako wypełnienia kolumn do HPLC umożliwia rozdział mieszanin związków w trybie wszystkich rodzajów chromatografii znanych wcześniej z zastosowań w klasycznej chromatografii kolumnowej. Stosuje się więc w HPLC kolumny wypełnione nośnikami do chromatografii jonowymiennej, podziałowej, hydrofobowej, powinowactwa, jak i żelami do sączenia molekularnego.

Najpopularniejszym obecnie rodzajem chromatografii stosowanym w HPLC jest odmiana chromatografii podziałowej — chromatografia podziałowa fazy odwróconej (RPC). Nośnik chromatograficzny wypełniający kolumnę stanowią porowate, mikroskopijne kuleczki krzemionkowe (Si0₂), których powierzchnia stykająca się z clucntem powleczona jest chemicznie silnie hydrofobowymi łańcuchami węglowodorowymi, najczęściej dimetylooktadecylosilanowymi: —O—Si(—OCH₃)₂(—O—C₁₈H₃₇). Kolumny z takim wypełnieniem nazywa się często w skrócie ODS (oktadecylosilan) lub C,₈ (z I uwagi na obecność 18-węglowego łańcucha hydrofobowego). Łańcuchy węglowodoro- [ we związane na powierzchni krzemionki stanowią rodzaj półpłynnej, silnie hydrofobowej otoczki. W trakcie chromatografii rozdzielane związki podlegają ciągłemu j procesowi podziału pomiędzy dwie niemieszające się fazy, a mianowicie eluent użyty do I przemywania kolumny (faza ruchoma układu chromatograficznego) oraz wspomniane hydrofobowe powleczenie nośnika chromatograficznego (faza stacjonarna).

Przykład — na kolumny wypełnioną omówionym nośnikiem naniesiono mieszaniny dwóch związków różniących się znacznie polarnością, np. glukozy z fenolem, i eluowano ją wodą. Cząsteczki glukozy, I charakteryzujące się dużą polarnością, mają silną tendencję do pozostawania w fazie polarnej, a więc I w wodzie użytej do przemywania kolumny. Wobec tego szybko wędrują przez kolumnę z prądem przepływającej przez nią wody, nie bydąc utrzymywane przez hydrofobowy nośnik chromatograficzny. Silnie hydrofobowe cząsteczki fenolu natomiast wykazują duż.e powinowactwo do hydrofobowej warstwy węglowodorowej na powierzchni nośnika, co jest spowodowane większą rozpuszczalnością fenolu w tej fazie niż w wodzie opływającej złoże chromatograficzne. W efekcie glukoza szybko zostaje wymyta | z kolumny podczas elucji wodą, w przeciwieństwie do fenolu, który podlega bardzo powolnemu

422