0
2

Uwagi:

1)    Fenol jest substancją silnie żrącą i mutagenną, więc należy stosować środki ostrożności w postaci rękawic i okularów ochronnych. Miejsca kontaktu skóry z fenolem powinno się spłukiwać dużą ilością wody i zmywać mydłem. Nie należy w tym celu używać etanolu.

2)    Wydajność procedury wynosi około 20 pg DNA na 500 pl krwi.

3)    Stosunek A₂₆₀//4₂₈₀, który jest miarą czystości DNA, powinien wynosić 1,7-2,2.

4)    Otrzymany DNA nadaje się do trawienia enzymami restrykcyjnymi oraz do zastosowania jako matryca w reakcji PCR (polymerase chain reaction — reakcja łańcuchowa polimerazy).

Ćwiczenie 10.3. Izolowanie DNA metodą odsalania białek (D.T. Bilton, M. Jaarola 1995 w: Methods in molecular biology. red. J.P. Clapp, Humana Press Inc., Totowa, s. 25-37)

Zasada: Odbiałczanie DNA w tej metodzie zachodzi w wyniku odsalania białek komórkowych poprzez odwodnienie i wytrącanie z użyciem nasyconego roztworu NaCl. Technika ta jest stosunkowo prosta i tania. Ekstrakcja przeprowadzana bez użycia fenolu zmniejsza ryzyko, co ma znaczenie szczególnie w pracy z wieloma próbkami.

Materiał: Tkanka zwierzęca świeża lub zamrożona.

Odczynniki:

1)    Bufor ekstrakcyjny: 3M NaCl - 0,4 M Tris/HCl (pH 7,8) - 20 mM EDTA.

2)    25% roztwór SDS.

3)    Roztwór proteinazy K o stężeniu 10 mg/ml.

4)    6 M roztwór NaCl.

5)    Chloroform.

6)    Absolutny etanol.

7)    70% roztwór etanolu.

8)    10 mM bufor Tris/HCl (pH 8,0).

9)    Bufor TE o pH 8,0: 10 mM Tris/HCl - 1 mM EDTA.

Ważniejsze przyrządy: Homogenizator nożowy (jeśli stosuje się jako materiał tkankę stałą), mikro-wirówka.

Wykonanie:

1.    Preparatykę tkanki należy przeprowadzić tak jak w ćw. 10.1.

2.    W probówce o pojemności 1,5 ml umieścić rozdrobnione 25-50 mg tkanki stałej lub zawiesinę interfazową z 1-1,5 ml krwi i dodać 400 pl buforu ekstrakcyjnego (odcz. 1), 20 pl proteinazy K (odcz. 3) oraz 10 pl roztworu SDS (odcz. 2) i łagodnie mieszać przez powolne obracanie probówki.

3.    Inkubować w temp. 55°C przez co najmniej 3 godz. (najlepiej 12 godz.). Dodać 250 pl nasyconego roztworu NaCl (odcz. 4) i wytrząsać ręcznie. Wprowadzić 650 pl chloroformu i łagodnie mieszać przez powolne obracanie probówki do utworzenia emulsji.

4.    Odwirować (13 000 x g w temp. pokojowej przez 30 min). Przenieść górną fazę wodną do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 100 pl buforu Tris (odcz. 8) i 750 pl etanolu (odcz. 6) ochłodzonego do temp. 0°C. Inkubować w lodzie przez 30 min dla wytrącenia DNA.

372