0 2

3)    Agaroza o niskiej temperaturze topnienia.

4)    Układ: 10 mg/ml protcinaza K - 1% sarkozyl w buforze L (odcz. 2).

5)    Roztwór fluorku fcnylometylosulfonowcgo (PMSF — phenylmetylsulfonyl fluoridc) o stężeniu 40 pg/ml w buforze TE o pH 7,6: 10 mM Tris/HCl - 1 mM EDTA.

Aparatura: Aparat do elektroforezy w polu pulsacyjnym /. zasilaczem, łaźnia wodna z zakresem temperatur obejmującym 50°C, homogenizator ze szklanym tłokiem.

Wykonanie:

1.    Tkankę stałą rozdrobnić i homogenizować w homogenizatorze szklanym z buforem PBS (odcz. 1) w temp. ok. 0°C, przepuścić homogenat przez gazę i płukać zawiesinę komórek w lodowatym PBS z odwirowaniem; osad po ostatnim wirowaniu zawiesić w lodowatym buforze L tak, aby stężenie komórek wynosiło 5 I0⁷ ml'¹. Krew pobraną na antykoagulant odwirować (1300x_tćy przez 15 min), usunąć super-natant, zebrać warstwę interfazową zawierającą krwinki białe, przenieść ją do czystej probówki i odwirować tak jak poprzednio. Ponowmie zebrać warstwę interfazową i zawiesić ją w lodowatym buforze L tak, aby stężenie komórek wynosiło 5-10⁷ ml"¹.

2.    Przygotować równą (z objętością zawiesiny komórek) objętość 0,1% agarozy

0    niskiej temperaturze topnienia. Ochłodzić agarozę do temp. 42°C.

3.    Ogrzać zawiesinę komórek do temp. 42°C i zmieszać ją z roztopioną agarozą tak, aby komórki były rozmieszczone w agarozie równomiernie.

4.    Używając pipety wprowadzić porcje agarozy o odpowiedniej objętości do forem bloków o objętości 50-100 pl lub do wnętrza rurki o średnicy wewnętrznej ok. 2,5 mm i doprowadzić do temp. 4^r,C.

5.    Po zestaleniu agarozy wyjąć bloki z forem lub wypchnąć agarozę z rurki

1    pokroić na odcinki 1-centymetrowa.

6.    Przenieść bloki agarozowe do 50 objętości buforu L zawierającego proteina-zę K i sarkozyl (odcz. 4). Inkubować w' temp. 50°C (przez 24 godz.).

7.    Zmienić bufor na świeży i ponownie inkubować (w^f temp. 50^:C przez 24 godz.).

8.    Inkubować bloki w PMSF (odcz. 5; w' temp. 50°C przez 1 godz.). Po inkubacji zmienić bufor na świeży oraz inkubować następną godzinę.

9.    Bloki wprowadzić do studzienek żelu i przeprowadzić elektroforezę.

Uwagi:

1)    Każdy blok agarozy powinien zawuerać ok. 1,5-10⁶ komórek.

2)    PMSF jest substancją silnie toksyczną, szczególnie dla błon śluzowych; wchłania się łatwo przez drogi oddechowe i skórę.

3)    Bloki agarozowe można przechowywać w buforze TE (w temp. 4°C przez kilka dni). Można je także przesyłać pocztą do innych laboratoriów' w probówkach wypełnionych 0,5 M roztworem EDTA (pH 8,0).

10.3.4. Analiza kwasów nukleinowych przez hybrydyzację

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych jest bardzo szerokim pojęciem, opisującym wszystkie zjawiska, kiedy to powitają stabilne struktury dwuniciowe z cząsteczek pojedynczych łańcuchów polinukleotydowych o wzajemnie komplementarnych sek-

452