img116 3

Wykonanie:

1.    Trawienie Fihryiiogcmi. Fibrynogcn (10 mg/ml) poddać dializie wobec PHS (w temp. 4 C przez 3 godz.). Następnie dodać pln/minę, do końcowej aktywności 0,5 U/ml, i prowadzić inkubację (w temp. 37 C pr/e/ 3 godz.). Trawienie zastopować przez, dodanie trasylolu (500 kU/ml). Uzyskany materiał zastosować do filtracji żelowej.

2.    Filtracja żelowa hydrolizatu fibrynogenu. Odważyć 4,5 g złoża Scphadex Ci 50 Fine, zalać wodą i pozwolić żelowi napęcznieć w ciągu 30 min. Zebrać supernatanl znad napęczniałcgo żelu i ponownie zalać wodą (20 ml). Odczekać 10 min i zebr.u supernatant wraz z zawiesiną bardzo drobnych fragmentów żelu. Czynność tę powtórzyć 3-krotnie, stosując bufor PBS zamiast H₂0. Następnie złoże u paków,u w plastikowej kolumnie (1 cm średnicy, 60 cm długości). Nanieść na kolumnę ok

1 ml strawionego fibrynogenu (nie więcej niż 3% objętości kolumny) i po wniknięciu naniesionej próbki w złoże przepuszczać przez kolumnę bufor PBS. Przez cały c/.iut zbierać 5-mililitrowe frakcje i metodą spektrofotometryczną (ż = 280 nm) monitom wać w nich zawartość białka. Rozdział prowadzić aż do przepuszczenia prze/, kolumnę buforu PBS w objętości równej 10-krotnej objętości kolumny (ok. 500 ml) Narysować chromatogram rozdziału (wykres zależności gęstości optycznej od ob jętości elucji) i wybrać ostatni jego szczyt. Zebrane cluaty zawierające niskocząsta / kowe peptydy połączyć razem, rozdzielić na 1-mililitrowe porcje i zamrozić. Prze/ kolumnę przepuścić 100 ml buforu PBS z dodatkiem 0,01% azydku sodu i prze chowy wać ją w temperaturze pokojowej nie dopuszczając do wyschnięcia złoża.

3.    Rozdział chromatograficzny peptydów. Do właściwego wyodrębniania peptydów należy zastosować gradientowy system wysokosprawnej chromatografii cieczowi i IłPLC. Kolumnę C₁₈ zrównoważyć wodą z dodatkiem 0,1% TFA. Ustawić przepływ na 1 ml/min. Detektor ustawić na / = 280 nm. Materiał do analizy przclil trować przez filtr z porami o średnicy 0,45 pm i nanieść do pętli 1 ml tego filtratu Przygotować program chromatografii z liniowo narastającym gradientem acetonu ryłu (z dodatkiem 0,1% TFA) w granicach 0-100% w czasie 20 min. Narastanie stężenia acetonitrylu uruchomić po 5 min od nastrzyknięcia próbki. Zbierać 1 -mili litrowe frakcje za pomocą kolektora. Na podstawie chromatogramu uzyskanego w integratorze zidentyfikować frakcje zawierające oczyszczone peptydy i prze z nu czyć je do dalszej analizy. Kolumnę zrównoważyć 20% roztworem acctoniti\lu i przechowywać w temperaturze pokojowej.

Ćwiczenie 4.37. Analityczne metody oznaczania leków w płynach fizjologicznych (Ił. Wallinder: Application Notę 368, LKB Bromma, Sweden)

Zasada: Paracetamol (N-acetylo-p-aminofenol) jest silnym lekiem przeciwbólowym Lek ten wchłania się drogą jelitową i jest metabolizowany w wątrobie. Wykazano, /.e po przekroczeniu stężenia 2 mM w osoczu uszkadza poważnie wątrobę. Tcofilinn jest efektywnym lekiem ułatwiającym oddychanie w chorobach astmatycznych Kfckt terapeutyczny jest skorelowany ze stężeniem tego leku w osoczu, któic powinno zawierać się w granicach 40 80 pM. Gdy stężenie przewyższało 100 pM obserwowano liczne skutki uboczne. Salicylany, szczególnie w formie acctylowancj acctylosalicyluny są najczęściej stosowanymi Ickami przeciwbólowymi, przeciwzapalnymi i przeciwzakrzepowymi. Leki te wchłaniają się drogą jelitową i wiążą się z licznymi białkami osoczowymi. Efektywne stężenie salicylanów w osoczu nic powinno przekroczyć wartości 2,5 mM. Większe stężenia mogą być przyczyną poważnych zaburzeń metabolicznych oraz niekontrolowanych lokalnych krwawień. Wszystkie trzy leki można stosunkowo łatwo ekstrahować z osocza i dzięki temu określić ich stężenie w osoczu. Ekstrakcję prowadzi się z zastosowaniem mieszaniny chlorek metylenu/propanol (9:1). Ekstrahowany materiał rozdziela się metodą fazy odwróconej z zastosowaniem kolumny C₁₈ w izokratycznym systemie HPLC wyposażonym w detektor UV oraz integrator.

Materiał: Osocze ludzkie wolne od Icków i osocze pochodzące od chorego przyjmującego analizowane leki.

Odczynniki:

1)    Kolumna HPLC C,₈ (ODS2, 5 pm, 4 x 100 mm).

2)    Prekolumna (Guard column 5 pm, 4 x 30 mm).

3)    Eluent: 13% metanol (v/v) - 0,75% CH₃COOH (v/v) - 0,02 M CH₃COONa.

4)    Paracetamol.

5)    Teofilina.

6)    Salicylan.

7)    8-Cl-tcofilina (wewnętrzny standard).

8)    1 M roztwór HC1.

9)    Chlorek metylenu/2-propanol (9:1).

10) Gazowy azot.

Uwaga! Bufory i próbki stosowane w chromatografii HPLC muszą być filtrowane przed użyciem. Aparatura: Zestaw izokratyczny HPLC z detektorem UV.

Wykonanie:

1.    Przygotowanie próbek do chromatografii — ekstrakcja leków. Przygotować mieszaninę ekstrakcyjną (chlorek metylenu/2-propanol, 9:1) z dodatkiem wewnętrznego standardu, 8-Cl-teofiliny (7 pM). Z osocza kontrolnego (wolnego od leków) przygotować osocze wzorcowe (1 ml) zawierające: paracetamol (0,4 mM), teofilinę (75 pM) oraz salicylan (1 mM). Równolegle prowadzić ekstrakcję 3 próbek: 1) osocza wolnego od leków, 2) osocza wzorcowego, 3) osocza zawierającego nieznaną ilość leków. Do 0,5 ml osocza dodać 0,5 ml 1 M roztworu HC1 oraz 5 ml mieszaniny ekstrakcyjnej. Mieszać przez 1 min, a następnie odwirować (10000 xg, 10 min). Zebrać 3 ml supematantu (warstwa zawierająca rozpuszczalniki organiczne), przenieść do szklanej probówki i odparować w łaźni wodnej (w temp. 50°C) w atmosferze azotu. Osad rozpuścić w eluencie (100 pl) i zastosować do rozdziału na kolumnie C,₈. Wydajność ekstrakcji dla badanych leków przekracza 90%.

2.    Analiza zawartości leków w próbkach. Kolumnę C₁₈ zrównoważyć eluentem, prędkość przepływu ustalić na 1 ml/min, w detektorze UV wybrać długość fali X = 280 nm. Do pętli nanieść 10 pl analizowanej próbki. Po ustaleniu się warunków nastrzyknąć próbkę na kolumnę. Prowadzić rozdział w czasie 20 min. Analizować po kolei przygotowane próbki. W próbce wolnej od leków powinien pojawić się tylko wewnętrzny standard (8-Cl-tcofilina), przy czasie retencji ok. 19 min. W pró-

177