20080421038

Nic izotopowa detekcja DNA

Blokowanie niespecyficznych miejsc wiązania (Membranę shiclding)

35.    Umieścić membranę na 5 minut w kuwecie z 100 ml rozcieńczonego buforu J, koniecznie stroną zawierającą DNA do góry.

36.    Podczas moczenia membrany ogrzewać 50 ml buforu K w 65°C aż do momentu rozpuszczenia (roztwór może być lekko mętny). Temperatura nie może przekroczyć 65°C.

37.    Zlać bufor J z kuwety, przytrzymując membranę szczypcami.

38.    Dodać 50 ml ogrzanego buforu K. do butli hybrydyzacyjncj i włożyć membranę. Membrana cały czas powinna leżeć stroną z DNA do góry.

39.    Inkubować w piecyku w temperaturze 65°C przez 1 h.

Detekcja

40.    Po godzinnej inkubacji wyjąć butlę hybrydyzacyjną z piecyka.

41.    Zlać bufor K z butli. Wyjąć membranę szczypcami.

42.    Umieścić membranę w kuwecie stroną z DNA do góry.

43.    Do czystej zlewki dodać 10 ml rozcieńczonego buforuj i 8 pl SAAP (P), wymieszać i zalać membranę.

44.    Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, co jakiś czas ruszając kuwetą, żeby membrana była cały czas w roztworze.

45.    Wyjąć na chwilę membranę, przepłukać kuwetę dużą ilością wody destylowanej. Wytrząsnąć resztki wody i umieścić membranę z powrotem w kuwecie.

46.    Dodać do kuwety 400 ml rozcieńczonego bufoni J i trzymać przez 20 minut, co jakiś czas poruszając kuwetą Zlać roztwór.

47.    Dodać do kuwety 200 ml rozcieńczonego buforu J i trzymać przez 15 minut, co jakiś czas poruszając kuwetą Zlać roztwór.

48.    Dodać do kuwety 200 ml rozcieńczonego buforu J i trzymać przez 15 minut, co jakiś czas poruszając kuwetą Zlać roztwór.

49.    Podczas ostatniego przemywania buforem J przygotować roztwór wywołujący barwę.

Wywoływanie barwy

50.    10 minut przed zlaniem buforu J przygotować roztwór wywołujący barwę przez rozpuszczenie tabletki BCIP/NBT w 20 ml wody destylowanej. Worteksować. Zużyć w przeciągu 1 h.

51.    Po ostatnim zlaniu buforu J wyjąć membranę.

52.    Do szalki Petriego dodać 10 ml roztworu wywołującego barwę.

53.    Włożyć membranę do roztworu stroną z DNA do dołu.

54.    Inkubować w 37°C w ciemności przez kilka godzin.

55.    Żeby określić postęp reakcji należy sprawdzić membranę po 30-60 minutach. Powinny być widoczne niebieskie pasma odpowiadające pozycji fragmentów DNA. Jeśli wszystkie spodziewane pasma widać, można przejść do fazy końcowej, jeśli nic, należy kontynuować inkubację.

3