20080526087

Ćwiczenie 4

I cmat: I ransformacja bakterii Escherichia coli plazm id owym DNA.

Cel ćwiczenia:

•    poznanie techniki transformacji komórek bakteryjnych plazmidowym DNA

•    nabycie umiejętności pracy z komórkami bakteryjnymi w warunkach jałowych

•    poznanie technik przygotowywania komórek kompetentnych

•    poznanie metod selekcji stransformowanych komórek

•    poznanie sposobu liczenia wydajności transformacji

Wymagana wiedza:

•    definicja transformacji i wydajności transformacji

•    czynniki wpływające na wydajność transformacji

•    kompetentność naturalna i indukowana

•    metody selekcji transformantów

Wykonanie ćwiczenia:

UWAGA: Należy pracować w rękawiczkach. Wszelkie procedury wykonywać w' warunkach jałowych (przy palniku).

Dzień 1

Doświadczenie 1

1)    Oznaczyć dwie płytki paskami.

2)    Rozpuścić medium.

3)    Trzymać w 60 °C.

4)    Wylać 1 płytkę na całą grupę (5 ml) do wysiania bakterii w celu uzyskania pojedynczych kolonii do transformacji.

5)    Dodać IPTG do medium i wymieszać.

6)    Wylać dwie płytki (po 5 ml) bez oznaczenia paskami.

7)    Dodać ampicylinę do pozostałego medium i wymieszać.

8)    Wylać dwie płytki (po 5 ml) oznaczone paskami.

9)    Pozostawić płytki do zastygnięcia.

10)    Przygotować dwie jałowe probów-ki na każdy zespół.

11)    Podpisać probówki: „+DNA” i „-DNA” (odpowiednio z plazmidem i bez).

12)    Do każdej probówki dodać 250 pl zimnego (trzymanego na lodzie) roztworu CaCh, używając sterylnej pipety 1 ml.

13)    Sterylną wykałaczką przenieść po dwie kolonie E. coli do każdej probówki z zimnym CaCb i energicznie zamieszać, żeby komórki bakterii odkleiły się od wykałaczki i pozostały w roztworze w probówkach.

14)    Probówki krótko zworteksować.

15)    Do probówki oznaczonej „+DNA” dodać jedną z następujących opcji: