CCF20110521 1

Oczyszczanie produktów trawienia restrykcyjnego

Oczyszczanie należy wykonać przy użyciu elektroforezy w żelu agarozowym. Preparaty DNA będą odzyskiwane z agarozy przy użyciu agarazy (GELase, Epicentre).

1.    Sporządzić żel z 1 % agarozy niskotopliwej (LMP) i jednokrotnie stężonego buforu TAE z dodatkiem bromku etydyny (do stężenia 0,5 ug/ml).

2.    Przed nałożeniem na żel do próbek dodać bufor obciążający w proporcji 2 ąl buforu na 10 pi roztworu DNA.

3.    Elektroforezę prowadzić w buforze TAE, przez 2 godziny, przy natężeniu pola elektrycznego 3 V/cm.

4.    Po elektroforezie, w świetle UV transiluminatora, z żelu wyciąć bloczki zawierające pożądany zakres wielkości fragmentów DNA.

5.    Do wyciętych bloczków dodać jednokrotnie stężony bufor reakcyjny (GELase buffer, Epicentre) w proporcji 3 ul bufom na 1 mg wyciętego bloczka. Próbki lekko kołysać przez godzinę, po czym usunąć bufor.

6.    Następnie bloczki umieścić na 3 minuty w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C, po czym przenśćje do temperatury 45 °C (termoblok) na 5 minut.

7.    Następnie do próbek dodać agarazę (GELase, Epicentre) w proporcji 1 U na 600 mg masy bloczka i inkubować przez godzinę w temperaturze 45°C.

8.    Preparaty uzyskane w wyniku trawienia agarazą:

a)    sprawdzić poprzez elektroforezę w żelu agarozowym (5 uL),

b)    użyć do ligacji z wektorem plazmidowym (objętość zależna od stężenia).