DSC00213

BIOLOGIA KOMÓRKI; 4-8 STYCZNIA 2010 Podstawy ANALIZY BIAŁEK - zagadnienia

ZAGADNIENIE 1 (grupowe):

W oparciu o otrzymane materiały oraz przykładowy aparat do dektroforozy/W&stem biot (przedstawiony przez prowadzącego we wprowadzeniu) opracuj szczegółowy protokół elektroforezy białek SDS-PAGE w żelu Bis-Tris denaturującym, w warunkach redukujących

Zwróć uwagę na następujące szczegóły

1.    Jakiego rodzaju bufory stosuje się do elektroforezy w w w warunkach?

2.    Co należy dodać do buforu w którym zawieszone są próbki białek, a co do buforu w którym przeprowadza się elektroforezę? Uzasadnij, w jakim celu!

3.    Jakie należy ustawić napięcie w zasilaczu i ile czasu mniej więcej trwać będzie rozdział (uwzględnij oba możliwe bufory do rozdziału)?

4.    Gdzie w aparacie jest katoda (-) a gdzie anoda (♦) i w którym kierunku biegnie rozdział? Uzasadni] swoją odpowiedź!

5.    Jakiego rodzaju filtry stosuje się do transferu białek z żelów i jakie są różnice w ich przygotowaniu do transferu?

6.    Opisz jak układa się .kanapkę* do transferu białek uwzględniając kierunek transferu (tj gdzie powinna byc katoda a gdzie anoda w a parcie do transferu) — uzasadnij!

7.    Podaj warunki transferu, tj gdzie wiewa się bufor do transferu, co służy do chłodzenia układu, jakie należy przyłożyć napięcie przy trasferze szybkim (1-2h) a jakie jeśli chcemy dokonać transferu przez noc.

ZAGADNIENIE 2 (grupowe) c.d

1.    W oparciu o przedstawione schematy i opisy (materiały dodatkowe) wytłumacz jakie są. metody detekcji białek po Western biot i na czym polegają.

2.    Opracuj szczegółowy protokół detekcji biotów metodą chemttuminescencji w opracm o instrukcję firmową

3.    Podaj przepis na przygotowanie klasycznego barwnika (błękit kumaryny — z aog. Coomass\e b\ue) do barwienia białek bezpośrednio w żelu w oparciu o instrukcję firmową

4.    Zastanów się czy, kiedy i w jakim celu można wybarwió Ze\ Coomassie b\ue po rozdziale elektroforetycznym białek jeśli celem rozdziału jest późniejszy Western błot i detekcja białek przy użyciu przeciwciał?

5. W oparciu o firmowy katalog podaj przykłady żeli do elektroforezy, które są szczególnie użyteczne do\

a)    Rozdziału małych peptydów

b)    Ogniskowania izoelektrycznego

c)    Rozdziału zarówno natywnych jak i zdenaturowanych białek

6. Wytłumacz jak zmieniając rodzaj żelu można rozdzielić dwa białka o zbliżonej masie cząsteczkowej t\a przykładzie dwóch białek o znanej masie cząsteczkowej: 116 kDa i 97 kDa