DSC00215

BIOLOGIA KOMÓRKI; 4-8 STYCZNIA 2010 Podstawy ANALIZY BIAŁEK - zagadnienia

lysate		insulin + BSA
•NEM	NEM	•NEM NEM
DTT	DTT	DTT	DTT
NEM	•NEM	NEM	•NEM

ZAGADNIENIE 3 (indywidualne):

niwai-11 IMiaiTIwfnMiiiiiłMlitftfuiliiiaKiMWI

m

W pewnym laboratorium przeprowadzano rozdział mieszany białek cytozolowych celem zbadania, czy białka cytozolowe posiadają cysteiny, które mogą tworzyć wiązania dwusiarczkowe z innymi białkami. Jako kontrolę użyto mieszaniny albuminy (w skład której wchodzi 37 Cys) i insuliny (6 Cys). W obu przypadkach mieszaninę białek zdenaturowano celem ekspozycji wszystkich wolnych cystein a następnie traktowano w odpowiedniej kolejności czynnikami takimi jak NEM i DTT.

NEM to N-etylomaleimid, który kowalencyjnie łączy się z grupami SH _N wolnych cystein uniemożliwiając tworzenie im wiązań -S-S-

DTT to ditiotreitol, który podobnie jak p-merkaptoetanol przerywa t wszystkie wiązania-S-S-

*NEM to wyznakowany izotopowo NEM; dodanie takiego r wyznakowanego NEM do mieszaniny białek spowoduje, że radioaktywne będą wszystkie białka, z którymi *NEM przereagował.

Po elektroforezie i transferze białek na filtr (Western biot), poddano filtr ekspozycji na kliszy rentgenowskiej, tak więc otrzymany obraz pochodzi wyłącznie od radioaktywnych prążków.

1. W oparciu o rezultat eksperymentu przedstawiony po prawej odpowiedz, czy mieszanina białek cytozolowych zawiera cysteiny zdolne do tworzenia wiązań dwusiarczkowych.

2. Wytłumacz na czym polegał .myk’ z użyciem w dwóch różnych kolejnościach NEM i 'NEM i jak pomógł on prawidłowo zinterpretować wyniki

ZAGADNIENIE 4 (indywidualne):

W innym laboratorium porównywano dwa białka uzyskane w wyniku rozdziału przy pomocy elektroforezy dwukierunkowej. Aby zidentyfikować ich podobieństwa i różnice potrawiono je wpierw na peptydy a następnie poddano analizie z użyciem spektrometrii masowej. Okazało się, ze wszystkie peptydy z wyjątkiem \edneoo są. identyczne. Dla tego peptydu zmierzono stosunek masy do ładunku (m/ż) Który pozwala okre&Mć, czy obserwowana różnica odpowiada różnicy w zamianie np. dwóch aminokwasów, ale okazało się, że w tym przypadku różnica ta nie odpowiada żadnej kombinacji zamiany poszczególnych aminokwasów. Jaka wobec tego może być przyczyna różnicy w parametrze m/z dla tego peptydu?

abund

m/z (mass to charge ratio)