img083 2

Rys. 4.6. Chromatograficzny rozdział aminokwasów na kolumnie jonowymiennej (wg: Moorc i Stci 1951; por. Ćwiczenia z biochemii. PWN, Warszawa 1982, s. 76)

Aminokwasy zasadowe — His, Lys i Arg przechodzą do roztworów buforowych o temp. 25°C. ale o pil odpowiednio 8,3; 9,2 i 11.0 (rys. 4.6). Do rozdziału tych trzech ostatnich aminokwasów stosuje się niekiedy kolumnę o wymiarach 9x 150 mm.

Niewielka ilość analizowanego materiału zhydrolizowanego białka, wielokrotnie mniejsza od pełnej pojemności jonowymiennej kolumny, zapewnia liniowy charakter izotermy sorpcji i symetryczny gaussowski kształt szczytów na krzywej elucji. pociąga jednak za sobą konieczność posługiwania się bardzo czułą reakcją wykrywającą.

Kmkcja ninhydrynowa jest dostatecznie czuła, pozwala zanalizować 10 ^g mol aminokwasu. Przeprowadza się ją następująco: Do 1 ml wycieku z kolumny dodaje się 1 ml odczynnika ninhydrynowego (800 mg ninhydryny + 120 mg hydryndantiny + 30 ml mctyloccllosolw + 10 ml 4 M buforu octanowego o pH 5,0). Całość ogrzewa się w łaźni wodnej w temp. 100'C przez 15 min. Po oziębieniu wprowadza się 5 ml 50% etanolu. Natężenie fiołkowoczerwonego zabarwienia oznacza się w fotometrze przy /    440 nm (dla Pro i hydroksy-Pro) oraz w 570 nm (dla pozostałych aminokwasów).

Już w 1958 r. Spacknian, Stein i Moorc wprowadzili automatyczne analizatory aminokwasów, które zapewniły postęp w poznaniu 1-rzędowej struktury białek.

lo 4.2. Wymiana jonów w procesie kolumnowym

.1 Aminokwasy w formie anionowej lub kationowej mogli wymieniać się na innie jonowymieniacza z jego anionami lub kationami, np

anionit⁺Cl" + aminokwas"-► anionit' aminokwas + Cl .

|| I >nwcx I x 8.

Ji I M roztwór NaOH (4%).

I| I M roztwór HCI.

4i 0.1 M roztwór AgNOj (1,7%).

4| I",, roztwór kwasu glutaminowego: I g kwasu rozpuścić w kilkudziesięciu ml H_zO z dodatkiem roztworu NaOH do uzyskania pH ok. 7,5 i uzupełnić wodą do 100 ml.

t kominie: W celu przygotowania kolumny kilka gramów jonitu Dowex 1 x 8 zalać Ikiisct ml 11,0 na kilkadziesiąt godzin. Po zdekantowaniu wody osad jonitu omywać na przemian 3-krotnie 1 M roztworem HCI i 2-krotnie 1 M roztworem nOII (zakończyć na 1 M HCI) według następującej procedury: po dodaniu ok. HI ml I M roztworu HCI lub 1 M roztworu NaOH wstawić do wrzącej łaźni nlnej na 10 min ciągle mieszając. Przesączyć przez lejek Buchnera i przemywać lik miaście razy wodą do uzyskania odczynu obojętnego (lub zaniku reakcji na Cl

lliyygotowaną zawiesinę jonitu przenieść do kolumny chromatograficznej.

Obniżyć ciecz w kolumnie szklanej do górnego poziomu jonitu. Nanieść 1 ml fn/tworu kwasu glutaminowego. Przez otwarcie kranu kolumny spowodować wsiąknięcie roztworu vy złoże wymieniacza jonowego. Przemywając następnie kolumnę Wodą zbierać po ok. 1 ml wycieku do probówek zawierających 1 ml roztworu AfNOj. Obserwować strącanie się jonów Cl" wypływających z kolumny.

Ćwiczenie 4.3. Chromatografia jonowymienna na CM-celulozie histonu grasicy bydlęcej (H. Nohara i wsp. 1968: Biochim. Biophys. Acta, 154:529 -539)

/.isada: Do rozdziału niejednorodnych białek zasadowych stosuje się jonowymieniacz kationowy, CM-celulozę z grupami kwasowymi: —OCH₂COOH. Na wierzchołek ka-tionitu przemytego buforem octanowym o pH 4,2 i małej sile jonowej wprowadza się niewielką ilość histonu rozpuszczonego w tym samym buforze. Cząsteczki histonu, znajdujące się po stronie kwasowej swojego punktu izoelektrycznego, występują w postaci kationów (—NH₃⁺) i zostają związane przez zdysocjowane anionowe grupy CM-celu-lozy (—CH₂COO") z różną siłą zależnie od ilości i rodzaju grup zasadowych. Przemywanie kolumny roztworami o zwiększającej się sile jonowej osłabia elektrostatyczne wzajemne oddziaływanie białko-kationit i pozwala rozdzielić mieszaninę cząsteczek histonowych na kilka frakcji różniących się molowym stosunkiem lizyny do argininy.

Odczynniki:

1)    Histon grasicy bydlęcej (cieląt) 10 mg.

2)    CM-celuloza.

3)    Bufor octanowy l: 0.1 M CHjCOOH - 0,03 M NaOH (pH 4,2).

4)    Bufor octanowy II: 0,1 M CH₃COOH - 0,03 M NaOH - 0.35 M NaCI (pH 4.2).

5)    0.01 Mi 0,02 M roztwory HCI.

111