img099 2

pobranych od dawców żywych. Wycinek wielkości I mm' tkanki rąbkowej umieszcza się w roztworze 0,05% trypsyny i 0,91% BDTA, w temp. 37"C, nu okres od 15 min do 3 godzin. Następnie trypsynę inaktywuje się medium hodowlanym zawiera jącym surowicę cielęcą, co pozwala uzyskać jednorodną zawiesinę komórek macierzystych nabłonka rogówki. Kolejnym etapem jest wysianie komórek na odpowiednio przygotowane podłoże. Najczęściej RKM hoduje się na podłożu z mysich fibroblastów 3T3, inaktywowanych mitomycynąC (MMC) lub promieniowaniem pochodzącym z izotopu 60*Co. Tak przygotowane komórki stanowią warstwy odżywczą (feeder layer) dla hodowli RKM.

Podłożem do hodowli RKM może być również klej tkankowy (żel fibryno-wy) lub błona owodniowa, pobrana podczas zabiegu cesarskiego cięcia, a następnie specjalnie preparowana. Możliwe jest także łączenie poszczególnych podłoży, szczególnie z hodowlą mysich fibroblastów 3T3. Posiane komórki RKM inkubuje się w temp. 37°C, w atmosferze zawierającej 5 % C0₂. Komórki hoduje się ok. 14 dni. W tym czasie komórki namnożają się i różnicują. Powstają dwie do trzech warstw prostopadłościennych komórek podstawnych. Komórki odkleja się od podłoża przy pomocy proteaz.

Z wycinka tkanki rąbkowej można wytworzyć wszczep o powierzchni kilku centymetrów kwadratowych. Wszczep przygotowany na podłożu fibrynowym pokrywa się szkłem kontaktowym, natomiast na błonie owodniowej przyszywa się go obwodowo.

W przypadku przeszczepów allogcnicznych wymagane jest również leczenie immunosupresyj ne.

Proces regeneracji nabłonka rogówki z wykorzystaniem metod inżynierii tkankowej przedstawiono na schemacie (ryc. 13.3).

i

174

zawiesina RKM

pobroilio wycinka zawwfując«8⁰ RKM z iqbfca rogówki dawcy

i

O

wycsnck tkanki rąbkowej

^ lrawiwuo Lrypsyną i EDTA

luyiowla mysich libroblustów 3T3

mitomycyna O (MMC) lub

promieniowanie i/otopu 6l>^łCo

ńiiikiywowauc mysie librobJasŁy 3T3

olr/yntaitii w wyniku lioilowli jiowierzclinia iwbku ikowa

przeszczepienie uzyskanej in vitro powierzchni nabłonkowej

ł

wszczep na błonie owodnjowej w oku bioi cy

Ryc. 13.3. Sposób uzyskania powierzchni nabłonkowej rogówki, z wykorzystaniem metod inżynierii tkankowej - schemat

175