img099 3

Objętość wewnętrzną V_t można wyliczyć w przybliżeniu z ilości użytego suchego żelu w gramach oraz stopnia wiązania wody (U,) charakterystycznego dla poszczególnych typów Sephadex, podanego w tab. 4.6. Zatem:

(2)

gdzie: a ilość g suchego żelu.

Objętość swobodną V₀ ustala się doświadczalnie. W tym celu przepuszcza się przez kolumnę wielkocząsteczkową substancję barwną i mierzy ilość wycieku w ml od chwili naniesienia próbki do momentu jej wyjścia z kolumny (maksimum szczytu). Objętość ta równa się wartości V₀ dla danej kolumny; V₀ jest jednocześnie objętością elucyjną (V_c) dla cząsteczek nie wchodzących w głąb ziaren żelu. Wartości graniczne mas cząsteczkowych podano w tab. 4.6.

Objętość elucyjną V_e można wyliczyć na podstawie znanej wartości K_d danej substancji i wielkości użytych we wzorze (1):

V_n + K_a-V

Jeżeli wartość K_d danej substancji, jest nieznana, V_c można ustalić w doświadczeniu pilotowym, przyjmując za objętość elucyjną tę ilość eluatu, która jest potrzebna do wyeluowania tej substancji (maksimum szczytu). Z równania (3) wynika wartość K_d:

(idy rozdziela się dwie lub więcej różnych substancji, nie bez znaczenia jest objętość próbki, w której zostały one naniesione na kolumnę V_% (sample volumc). Nie można stosować przypadkowo dobranych objętości. W procesie rozdziału dwóch substancji o współczynnikach podziału K_d i K_d wypłyną one z kolumny przy objętości wycieku Ko + Kj-k' oraz V₀ + K_d ■ V_x. Aby w takim przypadku uzyskać ich całkowity rozdział, objętość naniesionej próbki musi spełniać następujący warunek:

	Vs < V: - V'	(5)
stąd:	K < (*d " *d)*1	(6)

W praktyce trudno ustalić dokładną objętość fazy nieruchomej V-_y a także, co jest z tym związane, wartość współczynnika podziału między fazą ruchomą i nieruchomą. Wartość K_d jest ponadto zależna od upakowania kolumny i stosowanego ciśnienia. Wyznacza się więc wartość współczynnika dostępności A'„ (available), który stanowi stosunek stężeń substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej V₀ i całkowitej fazie żelowej V_t + V_r Wartość K_av nie zależy od upakowania kolumny.

wynika, że

	I II 5*	II I
	" ^y.+ K	y,-y.
Ponadto, jeżeli	II O	K„ = 0;
a jeśli	II r-* O	K., = 1.

Wartości K_av rozdzielanych substancji muszą zatem być zawarte w przedziale od 0 do 1.

Zależność dokładności rozdziału substancji na drodze filtracji żelowej od objętości próbki naniesionej na kolumnę obrazuje graficznie rys. 4.18. Na górnym schemacie widoczne jest całkowite i bardzo ostre rozdzielenie trzech substancji A, Ił i C o różnym K_d, rozpuszczonych w małej objętości rozpuszczalnika, a na środkowym — wynik uzyskany z zastosowaniem teoretycznie maksymalnej dopuszczalnej objętości próbki, tj. separację niezupełną — wskutek dyfuzji. Wreszcie dolny schemat przedstawia maksymalną objętość próbki określoną wzorem (6), pozwalającą uzyskać zupełny rozdział substancji.

^v.c    m!

Rys. 4.18. Rozdział substancji na drodze filtracji żelowej zależnie od objętości próbki naniesionej na kolumnę

143