kurs

Rekombinowane białka są coraz częściej stosowane w medycynie, diagnostyce, a także w przemyśle spożywczym, tekstylnym, skórzanym i chemicznym. Wykorzystywanie tych cząsteczek w tak wielu dziedzinach życia jest możliwe dzięki ich heterologicznej syntezie w dostępnych systemach ekspresyjnych (prokariotycznych i eukariotycznych - drożdżowe, roślinne, zwierzęce). Obecnie najczęściej stosowane są systemy prokariotyczne, ze względu na łatwość hodowli oraz niskie koszty. Jako gospodarza wykorzystuje się głównie bakterię Escherichia coli. Bakteria ta jest najpowszechniej wykorzystywanym mikroorganizmem ze względu: na łatwość manipulacji genetycznych, dużą liczbę dostępnych mutantów, dużą wydajność w produkcji większości heterołogicznych białek (nawet do 50% totalnego białka) oraz wzrost do dużych gęstości. Komórki bakteryjne są jednak niezdolne do prowadzenia modyfikacji posttranslacyjnych takich, jak glikozylacja, fosforylacja czy tworzenie mostków dwusiarczkowych. W związku z tym systemy prokariotyczne stosuje się przede wszystkim do nadprodukcji białek bakteryjnych lub małych białek eukariotycznych nie wymagających dla aktywności biologicznej modyfikacji posttranslacyjnych. W przeciwnym razie ekspresja rekombinowanych białek w E. coli prowadzi do utworzenia dużych, nierozpuszczalnych agregatów białkowych - ciał inkłuzyjnych.

Produkcja heterołogicznych białek w komórkach bakteryjnych jest możliwa dzięki wykorzystaniu plazmidów - kolistych cząsteczek DNA, odrębnych od chromosomu bakteryjnego, które są zdolne do autonomicznej (niezależnej) replikacji. Rozwój technologii w dziedzinie rekombinacji DNA in vitro pozwolił na skonstruowanie nowej klasy plazmidów, nazywanych wektorami ekspresyjnymi, które niosą kopie genów rekombinowanych białek.

Każdy wektor ekspresyjny charakteryzuje się podobnym planem budowy i powinien zawierać następujące elementy:

-    ori - miejsce inicjacji replikacji

-    promotor - sekwencja DNA wektora rozpoznawana przez polimerazę RNA komórki gospodarza i umożliwiająca transkrypcję wklonowanego genu. Najczęściej stosowane są tzw. silne promotory pochodzenia wirusowego (CMV, SV40, LTR) lub bakteriofagowego (SP6, T?). Ponadto wyróżnia się promotory konstytutywne i indukowane.

-    gen markerowy - najczęściej gen oporności na antybiotyki. Umożliwia selekcję komórek niosących dany plazmid

-    poiilinker - miejsce wielokrotnego klonowania, jest to fragment DNA zawierający kilkanaście miejsc rozpoznawanych przez różne enzymy restrykcyjne, umożliwia wprowadzenie genu kodującego interesujące nas białko.

I