Obrazek 0003(1)

54

p~_;. _{rVV    ;}^:V=v -    • •    1

|Materiały;    •    :    -ri⁷-:    ^:    •    J}\]    .

I    1. 24 h hodowle szczepów bakterii o znanej przynależności systematycznej

j 2, Szkiełka przedmiotowe; zestaw do odtłuszczania szkiełka; bibuła filtracyjna; tryskawka j jj • z wodądestyiowaną,; wanienka do barwienia, szczypce Corneta |j 3. Eza bakteriologiczna z oczkiem    ..v

li 4. Roztwór A (roztwór .wodny fioletu krystalicznego) 6.dRoztwórB(rQ^ór.wodnylwaśnegp węglanu sodu)

I 6.. Płyn' Uugoja_(rbztwórwodny jodu i jodku potasu)

!j 7. Rozpuszczalnik organiczny (96% alkohol etylowy lub mieszanina 1:1 eteru i acetonu; ii bądź-chloroformu i acetonu)

;j ^. BarwnLktontrastowy (wodny roztwórfuksyny fenolowej) ' ;    j

■[    '9. ''Mikroskop, ołejetc -immersyjny

10. Derm atog raf    i

ijwykonanie:

| 1. Na odtłuszczonym szkiełku przedmiotowym przygotować cienki rozmaz materiału;

pobranego jałową ezą, z 24 h hodowli szczepu wzorcowego; odpowiednio oznakować¹; | preparat

ii 2.    Wysuszyć rozmaz na powietrzu

j 3. Utrwalić preparat w płomieniu palnika

;j    4.    Nawarstwić preparat roztworem    A,    dodając    2-3    krople    roztworu    B;    barwić przez 2-3!

j...    min    ;!

I 5.    Spłukać pręparąt roztworem.Lugola

| 6.    Nawarstwić preparat.świeżym-j?łynem Lugola na ~2 min

| - 7. • Spłukać preparat .wodą •

i! 8.' Odcisnąć nadmiar wilgoci bibułą filtracyjną (rozmaz powinien pozostać wilgotny) ii 9. Odbarwić preparat rozpuszczalnikiem organicznym (trzymając preparat ukośnie nad!; wanienką szczypcami Corneta lać rozpuszczalnik po kropli do momentu, gdy] spływający ze szkiełka rozpuszczalnik będzie bezbarwny j    10'.    Spłukać preparat, wodą    ;j

ij    11.    Wysuszyć preparat na powietrzu    j

12.    Nawarstwić preparat barwnikiem    kontrastowym i    pozostawić    na 5-10    sekund    il

13.    Spłukać preparat, wodą    ;]

14.    Wysuszyć preparat bibułą

|    15.    Oglądać pod immersją    ;j

1 16. Wynikirobserwacji zapisać w tabeli 18

MECHANIZM BARWIENIA SIĘ KOMÓREK BAKTERII W METODZIE GRAMA

1.    Barwienie roztworem fioletu krystalicznego wspomagane jodem w KJ.

Barwnik przenika przez osłony komórkowe a J' zastępuje Cl' w cząsteczce barwnika tworząc duże, fioletowe agregaty wewnątrzkomórkowe.

2.    Odbarwianie rozpuszczalnikiem organicznym.

Rozpuszczalnik organiczny rozpuszcza błonę cytoplazmatyczną bakterii Gram-dodatnich oraz błonę cytoplazmatyczną i błonę zewnętrzną bakterii Gram-ujemnych. Wskutek częściowego odwodnienia ściany komórkowej zmniejsza się wielkość "porów" w mureinie. W przypadku komórek z grubą warstwą mureiny (bakterie Gram - dodatnie) barwne kompleksy zostają zatrzymane wewnątrz komórki.

3.    Barwienie kontrastowe safraniną lub fuksyną.

Odbarwione rozpuszczalnikiem organicznym komórki zabarwione zostają kolejnym barwnikiem stosowanym w tej metodzie.

WSKAZÓWKA

Na kolor fioletowy barwią się jedynie komórki gramododatnie w prawidłowym stanie fizjologicznym. Szczepy przechowywane przez dłuższy okres czasu, poddane działaniu antybiotyków, środków dezynfekcyjnych czy konserwantów często wybarwiają się na kolor różowy. Przy prawidłowym barwieniu bakterie gramujemne nigdy, nie barwią się na kolor fioletowy.

Tabela 18

Wybarwianie się komórek wybranych szczepów bakterii metodą Grama

Drobnoustrój	Barwa komórek w preparacie	i Bakterie |G ram-dodatnie*	Bakterie Gram-ujemne*	Uwagi
Bacillus subtilis
Bacilius cereus
Escherichia coli
Pseudomonas fluorescens
\ Streptococcus faecalis		•— .
Strepłococcus lactis				I
Staphylococcus aureus				j
Serratia marcescens
Proteus vulgaris
Micrococcus sp.				i
Sarcina lutea
Salmonella enteńtidis
Lisłeria monocytogenes

* - wstawić "x" we właściwym polu