scan0153

244

Stosowane są rozmaite techniki, np. fuzja w polu elektrycznym, w p₀l_u ultradźwiękowym, działanie odpowiednio inaktywowanymi wirusami lub dodawanie glikolu politylenowego (PEG). Często stosowana jest metoda traktowania komórek wirusami Senday inaktywowanymi promieniami ultrafioletowymi. Wirusy te nie tracąc zdolności do przytwierdzania się i uszkadzania błon, komórkowych nie infekują samych komórek. W wyniku uszkodzenia błon protoplasty zlewają się w jedną komórkę heteroka-riotyczną. Jeżeli następnie zachodzi fuzja jąder, to powstaje protoplast z jednym jądrem. Po zregenerowaniu błon, powstaje jedna komórka mieszańcowa zawierająca we wspólnym jądrze chromosomy obu form rodzicielskich. Komórki takie mogą się następnie dzielić i wytwarzać linie komórek mieszańcowych.

-    Selekcję komórek hybrydowych. Podstawowe znaczenie ma opracowanie metod selekcjonowania komórek mieszańcowych spośród tych komórek, między którymi nie zaszła fuzja lub też fuzja dotyczyła dwóch komórek tego samego typu. W tym celu tak dobiera się linie komórek rodzicielskich, aby na pożywce selekcyjnej rosły wyłącznie komórki mieszańcowe, a komórki rodzicielskie były niezdolne do wzrostu i podziału.

-    Izolację hybryd produkujących pożądane przeciwciała. Etap ten jest bardzo pracochłonny. Konieczna jest szybka kontrola dużej liczby próbek.

-    Namnożenie.wyizolowanych komórek. Stosuje .się omówione metody hodowli komórek. Stężenie przeciwciał w płynie pohodowlanych dochodzi do 60 mg/dm³.

Przeciwciała monoklonalne mają coraz większe zastosowanie, obejmujące nic tylko różne działy medycyny, ale również inne dziedziny techniki. Główną przyczyną niezwykle szybkiego zastosowania przeciwciał monoklonalych, zwłaszcza w diagnostyce medycznej, jest ich specyficzność, tzn. zdolność wiązania wyłącznie określonego antygenu. Specyficzność taka jest trudna do uzyskania tradycyjnymi metodami analizy i diagnostyki. Zastosowania ciał monoklonalnych obejmują:

-    Chromatografię powinowactwa. Umieszczenie przeciwciał na nośniku pozwala uzyskać wypełnienie dla kolumny chromatograficznej o ściśle określonym, selektywnym powinowactwie. Można w ten sposób np. oddzielić ściśle określone białko z mieszaniny różnych białek z bardzo wysoką sprawnością nieosiągalną innymi metodami.

-    immunoterapię. Jednym z zastosowań przeciwciał jest ich połączenie z odpowiednim lekiem, dzięki czemu, po związaniu przeciwciała z odpowiednim antygenem, lek dostarczany jest dokładnie w miejsce, w którym ma działać.

-    Immunodiagnostykę. Ta dziedzina zastosowań przeciwciał monoklonalnych rozwija się bardzo gwałtownie. Dzięki specyficzności działania przeciwciał możliwe jest przeprowadzenie precyzyjnego oznaczenia obecności określonych antygenów w badanych próbkach. Umożliwia to np. określenie zgodności lub niezgodności tkankowej.

Szczególnie interesujące są różnorodne techniki immunoenzymatyczne, wykorzystujące z jednej strony specyficzność wiązania przeciwciał z antygenem, z drugiej - możliwości detekcyjne, które daje zastosowanie enzymów. Przykładem są metody immunosorpcji koiliugowanych enzymów (ELISA - Enzyme--Linked Immunosorbent Assay). Polegają one na połączeniu przeciwciała z odpowiednim enzymem. Oznaczane białka sorbowane są na powierzchni nośnika. Dodanie odpowiednich przeciwciał znakowanych enzymem powoduje połączenie z białkami stanowiącymi antygeny (jeżeli oczywiście występują w badanej próbce). Po odmyciu niezwiązanych przeciwciał możliwe jest stwierdzenie obecności przeciwciał związanych z antygenem dzięki specyficznej reakcji katalizowane przez enzym. Obok znakowania przeciwciał enzymami stosowane są również techniki wykorzystujące przeciwciała łączone ze znacznikami chemi-luminescyjnymi, fluoroscencyjnymi i radioizotopami.

19.1,5. Interferony

Interferony to grupa związków, będących czynnikami niespecyficznej odporności organizmu. Działają hamująco na rozwój wirusów w komórce, modyfikują działanie systemu odpornościowego oraz regulują szybkość podziału komórek. Interferony jako produkty fizjologiczne nie wywołują w organizmie ludzkijn szkodliwych działań ubocznych, nic mają własności antygenowych. Stanowią cenny lek w leczeniu chorób wirusowych. Pewne nadzieje wiąże się z interferonami w leczeniu raka.

W zależności od komórek producenta wyróżnia się trzy rodzaje interferonów:

-    interferon a produkowany jest przez ludzkie leukocyty,

-    interferon produkowany jest przez diploidanle fibroblasty,

-    interferon y produkowany jest przez ludzkie limfocyty T.

Klasyczna metoda otrzymywania interferonu polegała na jego wydzieleniu z osocza krwi ludzkiej. Tak otrzymany inteiferon był bardzo drogi. Interferon a można otrzymać z hodowli leukocytów zainfekowanych odpowiednim wirusem. Czysty preparat otrzymuje się, podobnie jak inne produkty białkowe, w wyniku kilkuelapowcgo oczyszczania, m.in. metodami chromatograficznymi. Sposób ten nie jest najlepszy, niesie ryzyko zanieczyszczenia wirusami, ograniczona jest produkcyjność, syntetyzowane są inne immunoglobuliny oddziałujące na końcowy lek.

Interferon 13 można otrzymywać z hodowli diploidalnych komórek ludzkich traktowanych odpowiednim induktorem. Hodowle prowadzi się w monowarstwie.

interferon Y można otrzymywać z hodowli ludzkich limfocytów T. Wydzielone limfocyty traktowane są surowicą przeciw limfocytową iub mitogenem.

Odrębną techniką jest otrzymywanie interferonu w wyniku zabiegów inżynierii genetycznej. Dzięki manipulacjom genetycznym udało się wprowadzić gen kodujący wytwarzanie interefonu do bakterii Escherichia coli, co umożliwiło otrzymywanie interferonu w wyniku kłasyczncj hodowli bakterii.