323

W niektórych przypadkach nie ma możliwości całkowicie pewnego odróżnienia innych wtrętów od ciałek Negriego w mózgu kotów i dlatego w wątpliwych przypadkach konieczne jest użycie metod identyfikacji, szczególnie za pomocą immunofluorescencji. Również u psów padlych w następstwie zatrucia jadem żmii lub porażenia prądem elektrycznym można stwierdzić ciałka wtrętowe przypominające ciałka Negriego.

W ZHW stosowane jest często barwienie metodą Gerlacha, które jest nieco bardziej złożone, lecz zdaniem niektórych autorów pozwala na łatwiejsze wykazanie ciałek wtrętowych w materiale nadesłanym w stanie rozkładu.

Roztwory macierzyste barwników (do metody Gerlacha) stanowią:

1)    fuksyna karbolowa

woda destylowana    l(K)    ml

Phenolum liąuefactum    5    ml

dokładnie wstrząsnąć i dodać nasycony alkoholowy- roztwór fuksyny zasadowej    10    ml

2)    zasadowy błękit metylenowy (Lófflera)

nasycony alkoholowy roztwór    błękitu    metylenowego 30    ml

woda destylowana    *    100 ml

1% ług potasowy    1    ml

Do barwienia sporządza się    ex    tempore mieszaninę o składzie:

w^foda destylowana    50    ml

fuksyna karbolowa (1.)    3    ml

błękit metylenowy (2.)    6    ml

Barwnik ten zachowmje przydatność do barwienia nie dłużej niż jedną dobę.

Barwienie wykonuje się w sposób następujący.

1.    Wysuszony na powietrzu preparat utrwala się w alkoholu metylowym przez 5 min (albo w alkoholu etylowym absolutnym lub 95% przez 15 minut).

2.    Spłukuje się preparat w^rodą i strząsa jej resztki bez osuszania.

3.    Barwmik ogrzany ostrożnie w kolbce nad palnikiem, do ukazania się pary nad szyjką, nalewa się na preparat.

4.    Po 10—15 sekundach zlewa się barwnik, po czym nalewa św^rieżą jego partię jeszcze dwa razy.

5.    Preparat spłukuje się wodą, suszy i ogląda pod immersją. Ciałka Negriego barw-ią się na czerwono (widoczna ciemnoniebieska

struktura w-ewmętrzna), a cytoplazma — na niebiesko lub niebieskofio-letowo. Czerwone krwinki, zabarwione na kolor żółtoczerwony, a nawet czasem prawic bezbarwne, łatwo odróżnić od ciałek wtrętowych.

Wykrywanie antygenów wirusa. Najlepsze usługi oddaje metoda immunofluorcscencji. Znajduje ona zastosowanie również do wykazywania obecności wirusa w śliniankach psów zakażonych wirusem wścieklizny. Ostatnio podany „test rogówkowy” umożliwia przyżyciowe rozpoznanie wścieklizny odczynem IF w odciskowych preparatach z rogówki chorych zwierząt. U psów, zwłaszcza w fazie szalowej, wykonanie preparatu jest trudne i niebezpieczne, natomiast u dużych zwierząt domowych odczyn ten powinien znaleźć powszechne zastosowanie.

Sposób wykonania badania przedstawia się następująco.

Sporządza się po 3 preparaty odciskowe z rogu Ammona. pnia mózgowego (ciałek czworączych) i z kory mózgowej na 3—6 szkiełkach podstawowych. Preparaty powinny być możliwie cienkie, gdyż w przeciwnym razie badanie i ocena swoistej fluorescencji jest utrudniona. Ze ślinianek żuchwowych sporządza się preparaty mazane (najmniej z 6 różnych części gruczołu, gdyż rozmieszczenie wirusa nie jest jednolite); wymaga to najczęściej odpowiednio silnego nacisku, gdyż ze względu na znaczną zawartość mucyn zbyt mało materiału pozostaje na szkiełku.

Jeżeli próbki nadesłano do badania w glicerolu, należy je uprzednio dokładnie opłukać.

Preparaty suszy się na powietrzu, a następnie utrwala przez umieszczenie w acetonie schłodzonym do — 20'C przez 10—60 minut, lub przez trzykrotne przeprowadzenie nad palnikiem.

Barwienie uzyskuje się przez naniesienie na preparat koniugatu w roboczym rozcieńczeniu.

Czas barwienia w 37°C, w komorze wilgotnej, wynosi 30 minut. Następnie koniugat zlewa się i preparaty płucze w PBS dwa razy po 5 minut, a następnie spłukuje wodą destylowaną.

Po wysuszeniu zatapia się je w buforowanym glicerolu (9 części glicerolu + 1 część buforu fosforanowego) i bada preparat w mikroskopie fluorescencyjnym. Antygen wścickliznowy w preparatach z mózgu występuje w postaci jasnozielono fluoryzujących cząstek różnej wielkości, od najmniejszych do mających średnicę 20 pm; natomiast w preparatach zc ślinianek skupienia antygenu mają wymiary 6—8 pm. Kształt dużych cząstek może być dość różnorodny, jednak zwykle są one okrągłe lub owalne. Większość z nich wykazuje jednorodną fluoresceneję, lecz w niektórych jest ona intensywniejsza na obwodzie; nie stwierdza się nato-

323