img035

2. Maleriafy i odczynniki chemiczne

2.1.    Materiał biologiczny

•    8-dniowe hodowle Streptomyces fradiae na podłożu zawierającym pióra kurcząt i bezazotowe sole mineralne

•    Częściowo oczyszczony preparat pozakomórkowych proteinaz Streptomyces fradiae

•    Zmielone pióra kurcząt

2.2.    Odczynniki chemiczne

•    Odczynniki stosowane do oznaczania zawartości białka: 2% roztwór węglanu dwusodowego (Na₂ COj) w 0.1 N roztworze wodorotlenku sodowego (NaOH) -składnik A; 0.5% roztwór siarczanu miedziowego (CuS0₄ * 5H₂0 ) w 1% cytrynianie sodowym (C6 Hj Na; O7 * 2H₂0) - składnik B oraz odczynnik Folina -Ciocateu

•    Odczynniki d&.-pomiaru zawartości grup sulfhydrylowych (-SH): 0.33 M bufor cytrynianowyi**. pH 4.6 i 1.92 mM kwas p-chlorortęciobenzoesowy (pCMB) w 0.01N NaOH &

•    Odczynnik do oznaczania aktywności keratynolitycznej enzymów: 0.025 M bufor boranowy o pH 8.5 oraz 0.001 M roztwór chlorku magnezowego (MgCI₂)

•    Fizjologiczny roztwór soli (0.85% chlorek sodowy - NaCI) do ekstrakcji podłoża stałego

2.3.    Sprzęt a

%

•    Mikroskop, szkiełka podstawowe i nakrywkowe, kolby Elrenmayera o poj 50 ml, pipety, probówki, lejki, sączki, stoper, łaźnia wodna, kolorymetr "Specol" , spektrofotometr

3. Wykonanie ćwiczenia

3.1. Ocena stopnia mikrobiologicznej degradacji piór kurcząt

Badane będą próby dwóch różnych typów hodowli:

I    - wstrząsanej, w podłożu zawierającym 2g zmielonych piór i 100 ml bezazotowych soli mineralnych

II    - statycznej, na stałym o ograniczonej wilgotności podłożu, zawierającym 2g piór zwilżone 8 ml roztworu bezazotowych soli mineralnych

Mikroorganizmy, utylizując keratynow'e substraty (np. pióra drobiu) powodują istotną zmianę ich natywnej struktury oraz uwalniają z degradowanej tkanki rozpuszczalne produkty, takie jak: białka, peptydy, a nawet wolne aminokwasy.

Charakterystycznymi połączeniami polipeptydowych łańcuchów keratynowych białek są krótkie, trwałe disiarczkowe mostki (-S-S-), występujące licznie w keratynach dzięki dużej zawartości aminokwasu siarkowego - cysteiny. Stopień degradacji keratyn zależny jest więc od zniszczenia tych kowalencyjnych wiązań. Miarą rozszczepienia mostków disiarczkowych w trakcie rozkładu keratyn jest przyrost rozpuszczalnych produktów zawierających grupy sulfhydrylowe (-SH).

Ocena stopnia mikrobiologicznego rozkładu piór kurcząt będzie obejmowała następujące analizy:

*    mikroskopowe obserwacje preparatów uzyskanych bezpośrednio z hodowli promieniowca (p.3.1.1.)

*    pomiar przyrostu ilości rozpuszczalnego białka (p.3.1.2.) oraz zawartości sulfhydrylowych substancji (p.3.1.3.) w filtratach hodowli wstrząsanej i ekstraktach z hodowli na podłożu stałym

3.1.1.    Obserwacje mikroskopowe

Preparat mikroskopowy wykonać bezpośrednio z hodowli, nancsząc na szkiełko podstawowe kroplę zawiesiny hodowli 1 (p.3.1 ) lub pobierając cząstkę podłoża stałego i zwilżając ją kroplą wody - hodowla II (p.3.1). Nałożone na szkiełko podstawowe próby przykryć szkiełkiem nakrywkowym i umieścić w mikroskopie. Preparaty obserwować przy powiększeniu 600 x . Podobne preparaty wykonać dla prób kontrolnych, nie zaszczepionego podłoża. Opisać wygląd preparatów i uchwycone, spowodowane mikrobiologiczną degradacją zmiany piór.

3.1.2.    Ilościowa analiza produktów degradacji piór

Przygotowanie prób hodowli do analiz.

Hodowlę wstrząsaną (I - p.3.1.) przesączyć przez filtr bibułowy, filtrat pozostawić do oznaczeń. Hodowlę stałą (II - p.3.1.) uzupełnić 92 ml roztworu soli fizjologicznej, ekstrahować podłoże (wstrząsając ręcznie), a następnie oddzielić części stałe (nie zdegradowane pióra, biomasa) na sączku. Odsączoną ciecz poddać analizie. W podobny sposób przygotować próby kontrolne, nie zaszczepionego podłoża.

znaczanie zawartości białka w rozpuszczalnych produktach

. jzkładu piór

Metoda zaproponowana do oznaczania uwolnionego z piór rozpuszczalnego białka jest czułym i szeroko stosowanym pomiarem kolorymetrycznym jrble^a ona na oznaczaniu ilości barwnego produktu powstałego w wyniku przyłączenia miedzi do sąsiadujących z sobą wiązań peptydowych oraz redukcji odczynnika Folina-Ciocalteu przez obecne w białkach aminokwasy aromatyczne (tj. tyrozyna i tryptofan).

Sposób oznaczania

Odmierzyć do probówek po 0.4 ml filtratów lub ekstraktów, otrzymanych w sposób przedstawiony powyżej - p.3.1.2., dodać 2 ml odczynnika C (odczynnik C powstaje przez zmieszanie 50 ml składnika A i 1 ml składnika B - p.2.2.; odczynnik C