numero uno

Izolacja plazmidowego DNA

Odczynniki

1.    Roztwór I - bufor do rozpuszczenia osadu bakterii:

50mM glukoza, 25 mM Tris:HCl,10 mM EDTA, końcowe pH 8,0

2.    Roztwór II - bufor do lizy alkalicznej bakterii:

0,2 N NaOH (rozcieńczony z 10 N roztworu wyjściowego), 1% SDS (sól sodowa siarczanu dodecylu, rozcieńczony z 10% roztworu wyjściowego)

3.    Roztwór III - bufor do wytrącania białek i genomowego DNA:

3M octan potasu, 2M kwas octowy

Liza alkaliczna

1. Do eppendorfa dodać l,5ml zawiesiny bakteryjnej, żwirować próbkę (12000g 30s.), usunąć supernatant. Dodać kolejne l,5ml zawiesiny bakteryjnej, żwirować próbkę (12000g 30s.), usunąć supernatant. Osuszyć osad.

1.    Otrzymany osad bakteryjny całkowicie rozpuścić w 100 pl schłodzonego na lodzie R I, mieszając za pomocą mieszadła wirowego (vortex).

2.    Dodać 100 pl świeżo przygotowanego R II. Dokładnie zamknąć probówkę i wymieszać jej zawartość delikatnie odwracając 5 razy. Cała powierzchnia probówki powinna mieć kontakt z roztworem II. Nie używać mieszadła wirowego (vortex). Umieść probówkę w lodzie na 5 min.

3.    Dodać 150 pl R III. Probówkę zamknąć i odwracać łagodnie przez około 10 sek., aby lizat bakterii rozpuścił się w R III. Inkubować probówkę w lodzie przez 5 minut.

4.    Odwirować w 12000g w temp. 4°C przez 5 min. Supernatant, w którym znajduje się plazmidowy DNA oraz RNA przenieść do nowej podpisanej probówki.

5.    Dodać równą objętość mieszaniny fenol-chloroform 1:1 w celu odbiałczenia zawiesiny 1'^Ojp kwasów nukleinolwych (UWAGA-FENOL!) Energicznie wmieszać za pomocą vortexu.

6.    Odwirować próbkę w 12000g przez 5 min., ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki

2oCd

7.    Dodać równą objętość mieszaniny chloroform-alkohol izoamylowy (42-1). (UWAGA-CHLOROFORM!), energicznie wymieszać.